專利名稱：一種針對flg基因rna干擾的重組慢病毒載體及其制備的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬分子生物學(xué)，生物醫(yī)藥及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，主要涉及針對絲聚合蛋白 (filaggrin, FLG)基因的RNA干擾重組慢病毒載體(LV-sh-FLG)及其制備。
背景技術(shù)：
特應(yīng)性皮炎(atopic dermatitis, AD),是一種與遺傳有關(guān)的，復(fù)雜的、瘙癢性、慢性炎癥性皮膚病。AD的病因和發(fā)病機制復(fù)雜，缺乏特效的治療手段，嚴(yán)重影響嬰幼兒及成年人的生活質(zhì)量。目前認(rèn)為AD的特征性臨床表現(xiàn)是易感基因、環(huán)境因素、有缺陷的皮膚屏障功能、免疫學(xué)異常共同相互作用的結(jié)果。近年來，遺傳學(xué)在AD的發(fā)病機理中的作用成為研究熱點。有關(guān)的易感區(qū)域研究近年來取得了一定程度的進展。近來，很多研究發(fā)現(xiàn)絲聚合蛋白基因(filaggrin gene, FLG)突變和AD的發(fā)病有關(guān)。在有關(guān)尋常型魚鱗病(IV)的基因研究中，表皮分化復(fù)合物(EDC)的染色體lq21已經(jīng)被確認(rèn)，并描繪出幾個IV家系的在染色體lq21上的表皮分化復(fù)合物的繪制圖，強化了 FLG可能是一個有潛在突變的可能致病的候補基因這一觀點。在此基礎(chǔ)上，2006年歐洲科學(xué)家發(fā)現(xiàn)FLG與AD發(fā)病的相關(guān)性，F(xiàn)LG也是AD的一個易感基因。并在今后的研究中得以證實。絲聚合蛋白(filaggrin，F(xiàn)LG)是哺乳動物表皮細(xì)胞分化終末階段產(chǎn)生的一種陽離子蛋白，1993年由Simon等首先成功通過人表皮分離并部分純化，它與角蛋白等相互作用，構(gòu)成真核細(xì)胞骨架。人類絲聚合蛋白的編碼基因FLG位于lq21，包含3個外顯子，其中 exonl (15bp)和exon2(159bp)均不編碼蛋白質(zhì),exon3 (12753bp)編碼大部分的重復(fù)序列和 N-末端，主要由10 12個長約Ikb的絲聚合蛋白重復(fù)序列組成，這些重復(fù)序列的相似性接近100%。絲聚合蛋白是皮膚表皮角質(zhì)層的角質(zhì)包膜(CE)的一個重要的組成蛋白，CE是形成表皮機械性防御屏障的基礎(chǔ)，因此filagghn表達(dá)的缺失和減少和皮膚干燥有關(guān)。它將會影響角質(zhì)層的滲透作用，導(dǎo)致角質(zhì)層含水量的下降，同時也影響阻止水分丟失的能力，引起表皮水分丟失量的增加，引起皮膚干燥。Filaggrin在表皮屏障功能中起著重要作用，也是 AD皮膚屏障功能異常的主要原因之一。近年來很多研究者研究了 FLG編碼突變引起角質(zhì)層屏障功能缺失與AD之間的聯(lián)系。FLG基因突變引起的皮膚屏障功能障礙在AD發(fā)病中扮演著重要角色，然而FLG基因突變具有種族及地域差別。R501X、2282del4、R2447X、S3247X和 3702delG是歐洲AD人群FLG基因的主要突變位點；而在日本AD人群中，S2554X、3321delA、 S2889X和S3296X為其主要的易感位點；而香港的一項關(guān)于中國AD人群FLG的研究只在4 例男性患者中發(fā)現(xiàn)R501X突變。RNA干擾(RNA interference, RNAi)技術(shù)是抑制基因表達(dá)的常用手段，又叫基因沉默。RNA干擾的原理是當(dāng)細(xì)胞中導(dǎo)入與內(nèi)源性mRNA編碼區(qū)同源的雙鏈RNA時，該mRNA發(fā)生降解而導(dǎo)致基因表達(dá)沉默的現(xiàn)象。RNA干擾過程主要有兩個步驟一、雙鏈RNA被細(xì)胞源性雙鏈RNA特異性的核酸酶切成21-23個堿基對的短雙鏈RNA，即小干擾RNA(smallinterference RNA, siRNA) ;二、 siRNA的反義鏈與核酸酶形成了沉默復(fù)合物(RNA-induced silencing complex, RISC),該
4復(fù)合體具有識別結(jié)合與小干擾RNA有同源序列的mRNA，并在特異位點將該mRNA切斷。RNA 干擾技術(shù)目前在基因治療及研究中得到了廣泛的應(yīng)用，同時那些在靶標(biāo)實驗中證明有效的 siRNA/shRNA本身可以進一步開發(fā)成為RNAi藥物。shRNA(shorthairpin RNA)即短發(fā)夾 RNA包含兩個短反向重復(fù)序列，其中一個與目的基因互補，中間loop序列分隔組成發(fā)夾結(jié)構(gòu)。在體內(nèi)shRNA被加工成siRNA有效降解目的基因抑制其表達(dá)。但是要將該技術(shù)應(yīng)用于臨床治療，需要解決RNA干擾片段表達(dá)持續(xù)及表達(dá)效率等重要問題。目前基因治療的載體主要有非病毒載體及病毒載體，然而非病毒載體無法滿足長時間的表達(dá)，這一缺陷無疑被病毒載體填補。近年來慢病毒介導(dǎo)的RNA干擾技術(shù)在研究中已經(jīng)取得了良好的開端。慢病毒載體(lentivirus-based vector, LV)是逆轉(zhuǎn)錄病毒的一種，具有逆轉(zhuǎn)錄病毒的基本結(jié)構(gòu)，但又有不同逆轉(zhuǎn)錄病毒的組分特性，該病毒既可以轉(zhuǎn)染分裂細(xì)胞又可以轉(zhuǎn)染非分裂細(xì)胞。病毒基因組可以整合宿主中，使得基因長時間穩(wěn)定的表達(dá)， 并且慢病毒具有較低的免疫源性，這使得慢病毒成為RNA干擾的最佳載體，目前廣泛用于基因表達(dá)調(diào)控，基因治療等領(lǐng)域。我們選用的第三代復(fù)制缺陷型慢病毒載體是自殺性病毒， 在體內(nèi)可以較長期的表達(dá)且安全性高，能很好的解決RNA干擾技術(shù)基因治療的靶向性、安全性、整合效率等問題。因此慢病毒載體介導(dǎo)的RNA干擾效應(yīng)在靶細(xì)胞內(nèi)長期存在，可為更好發(fā)揮干擾作用創(chuàng)造條件。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是提供一種針對FLG基因RNA干擾的重組慢病毒載體，是自身失活的第三代慢病毒載體，其特征在于，所述的載體含PGLV/Hl/GFP-sh FLG重組載體，所述的PGLV/Hl/GFP-sh FLG重組載體是在PGLV/H1/GFP載體的多克隆位點中連接了雙鏈DNA 片段；所述的雙鏈DNA片段的序列為以下序列中的一種(其中S代表正義鏈，AS代表反義鏈)(l)FLG-homo—274 FLG-homo-274-S 5，-GATCCGTTGGCTCAAGCATATTATTTCAAGAGAATAATATGCTTGAGCCAACTTTTTTG-3，F(xiàn)LG-homo-274-AS 5， -AATTCAAAAAAGTTGGCTCAAGCATATTATTCTCTTGAAATAATATGCTTGAGCCAACG-3，(2) FLG-homo-769 FLG-homo-769-S 5，-GATCCGCACCACTGATAGTCTATTATTTCAAGAGAATAATAGACTATCAGTGGTGCTTTTTTG-3，F(xiàn)LG-homo-769-AS 5，-AATTCAAAAAAGCACCACTGATAGTCTATTATTCTCTTGAAATAATAGACTATCAGTGGTGCG-3，(3)FLG-homo-1627 FLG-homo-1627-S 5，-GATCCGCCACGAGCAATCGGTAAATTTCAAGAGAATTTACCGATTGCTCGTGGCTTTTTTG-3，F(xiàn)LG-homo-1627-AS 5， -AATTCAAAAAAGCCACGAGCAATCGGTAAATTCTCTTGAAATTTACCGATTGCTCGTGGCG-3，本發(fā)明的另一個目的是提供所述的針對FLG基因RNA干擾的重組慢病毒載體的制備方法，其特征在于，根據(jù)FLG mRNA序列，設(shè)計合成了雙鏈DNA片段，所述的雙鏈DNA片段為以下序列中的一種(l)FLG-homo—274 FLG-homo-274-S 5，-GATCCGTTGGCTCAAGCATATTATTTCAAGAGAATAATATGCTTGAGCCAACTTTTTTG-3，F(xiàn)LG-homo-274-AS 5，-AATTCAAAAAAGTTGGCTCAAGCATATTATTCTCTTGAAATAATATGCTTGAGCCAACG-3，(2)FLG-homo-769 FLG-homo-769-S 5，-GATCCGCACCACTGATAGTCTATTATTTCAAGAGAATAATAGACTATCAGTGGTGCTTTTTTG-3，F(xiàn)LG-homo-769-AS 5， -AATTCAAAAAAGCACCACTGATAGTCTATTATTCTCTTGAAATAATAGACTATCAGTGGTGCG-3，(3)FLG-homo-1627 FLG-homo-1627-S 5，-GATCCGCCACGAGCAATCGGTAAATTTCAAGAGAATTTACCGATTGCTCGTGGCTTTTTTG-3，F(xiàn)LG-homo-1627-AS 5，-AATTCAAAAAAGCCACGAGCAATCGGTAAATTCTCTTGAAATTTACCGATTGCTCGTGGCG-3，然后將所述的DNA片段連接到PGLV/H1/GFP載體的多克隆位點中構(gòu)建成PGLV/H1/ GFP-shFLG 重組載體；再將 PGLV/Hl/GFP-sh FLG 重組載體、pHelperl. 0、pHelper 2. O 三種載體共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞培養(yǎng)，獲得所述的重組慢病毒載體。作為優(yōu)選，在所述的雙鏈DNA片段末端引入BamH I和EcoR I酶切位點。作為優(yōu)選，用BamH I和EcoRI酶將PGLV/H1/GFP載體酶切，回收大片段后將其與所述雙鏈DNA片段連接后轉(zhuǎn)化感受態(tài)菌，挑取重組陽性克隆。該載體能有效轉(zhuǎn)染細(xì)胞或組織后特異性降低FLG基因的表達(dá)，從而可能應(yīng)用于基因治療或基因功能研究。本發(fā)明提供的PGLV/Hl/GFP-sh FLG最重要特征在于提供靶向性 FLG基因抑制效應(yīng)，并用重組慢病毒載體作為載體，使得干擾效果得到持續(xù)性作用。整個制備過程全部使用質(zhì)粒，避免傳統(tǒng)方法腺病毒污染。本發(fā)明通過篩選最有效FLG干擾序列，合成其雙鏈DNA，連接到慢病毒骨架質(zhì)粒載體中，與輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染工具細(xì)胞293T細(xì)胞，制備出FLG干擾重組慢病毒載體PGLV/Hl/GFP-sh FLG。本發(fā)明的有益之處是I、本發(fā)明采用的PGLV/H1/GFP載體能夠在宿主細(xì)胞中持續(xù)表達(dá)有干擾作用的小 RNA0同時該質(zhì)粒能表達(dá)由CMV啟動子驅(qū)動的熒光蛋白GFP，方便病毒包裝時轉(zhuǎn)染效率，以及感染宿主細(xì)胞的感染效率的檢測。PHelper I. O質(zhì)粒中含有HIV病毒的gag基因，編碼病毒主要的結(jié)構(gòu)蛋白；pol基因，編碼病毒特異性的酶；rev基因,編碼調(diào)節(jié)gag和pol基因表達(dá)的調(diào)節(jié)因子。pHelper 2. O質(zhì)粒中含有單純皰疹病毒來源的VSVg基因，提供病毒包裝所需要的衣殼蛋白。將以上三種載體共轉(zhuǎn)入293T細(xì)胞能高效組裝自身失活的第三代慢病毒載體，增加了兩個安全特性其一構(gòu)建了自身失活的慢病毒載體，即刪除了 U3區(qū)的3’ LTR，使載體失去HIV-I增強子及啟動子序列，即使存在所有的病毒蛋白也不能轉(zhuǎn)錄出RNA。第二個特點是去除了 tat基因代之以異源啟動子序列，這樣原始的HIV基因，組中的9個基因在構(gòu)建的HIV慢病毒載體中只保留了 3個(gag、pol和rev)。因此第三代HIV慢病毒載體系統(tǒng)更加安全。2、本發(fā)明針對FLG靶基因根據(jù)在線原則設(shè)計出四個有效干擾序列，通過重組的慢病毒干擾載體系統(tǒng)構(gòu)建包裝獲得PGLV/Hl/GFP-sh FLG,通過檢測靶細(xì)胞中FLG基因mRNA 表達(dá)水平，篩選出最有效干擾片段，不僅克服非病毒載體的低轉(zhuǎn)染效率，也避免了重組腺病毒產(chǎn)生的免疫原性，表達(dá)時間較短等缺點，這種重組的慢病毒載體是“自殺性”病毒，比較安全，能整合到宿主的基因組中并穩(wěn)定表達(dá)，不會導(dǎo)致插入失活，使得干擾作用更加持續(xù)， 具有可感染非分裂細(xì)胞、目的基因整合至靶細(xì)胞基因組長時程表達(dá)、免疫反應(yīng)小等優(yōu)點，為有關(guān)FLG基因的進一步研究奠定良好實驗基礎(chǔ)，并能廣泛用于體內(nèi)基因治療及基因功能研究。


圖I為慢病毒骨架質(zhì)粒PGLV/H1/GFP載體結(jié)構(gòu)示意圖。圖2為慢病毒侵染293T細(xì)胞72h (96孔板)圖片(熒光)。圖2A 為 C721 侵染 293T 72h 后圖片(200 X)；圖2B 為 C722 侵染 293T 72h 后圖片(200 X)；圖2C 為 C723 侵染 293T 72h 后圖片(200 X)；圖2D 為 NC 侵染 293T 72h 后圖片(200X)。圖3為慢病毒侵染HACAT細(xì)胞72h(6孔板)圖片(熒光、可見光)。圖3A為C721侵染HACAT細(xì)胞72h后圖片(200 X)；圖3B為C722侵染HACAT細(xì)胞后圖片(200 X)；圖3C為C723侵染HACAT細(xì)胞后圖片(200 X)；圖3D為NC侵染HACAT細(xì)胞后圖片(200X)。圖4 為 Real-timePCR 擴增曲線。圖4A為NC侵染HACAT 72h后GAPDH和FLG基因擴增曲線；圖4B為未進行病毒侵染的HACAT 72h后GAPDH和FLG基因擴增曲線；圖4C為C721侵染HACAT 72h后GAPDH和FLG基因擴增曲線；圖4D為C722侵染HACAT 72h后GAPDH和FLG基因擴增曲線；圖4E為C723侵染HACAT 72h后GAPDH和FLG基因擴增曲線；圖5為Real-timePCR擴增產(chǎn)物電泳圖。其中1-11 泳道分別為分子量 marker，GAPDH-B, GAPDH-NC, GAPDH-C721， GAPDH-C722, GAPDH-C723，F(xiàn)LG-B, FLG-NC, FLG-C721，F(xiàn)LG-C722，F(xiàn)LG-C723。圖6為PGLV/Hl/GFP-sh FLG對HACAT細(xì)胞中FLG基因表達(dá)干擾效果圖片。NC,加陰性對照病毒感染的細(xì)胞組72h樣品；B,未感染任何病毒的細(xì)胞組72h樣品；C721，加FLG-homo-274病毒感染的細(xì)胞組72h樣品；C722，加FLG-homo-769病毒感染的細(xì)胞組72h樣品；C723，加FLG-homo-1627病毒感染的細(xì)胞組72h樣品。
具體實施例方式本發(fā)明結(jié)合附圖和實施例作進一步的說明。實施例I :針對基因FLG的慢病毒載體構(gòu)建I、寡核苷酸的設(shè)計及合成利用Invitrogen公司的在線RNAi系列設(shè)計軟件BLOCK-iT RNAi Designer,設(shè)計針對FLG基因mRNA序列(NM-002016. I)的3個干擾靶序列(參見下表)，并合成相應(yīng)的雙鏈DNA (上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)。LV3-shRNA模板中的loop結(jié)構(gòu)選用了 TTCAAGAGA以避免形成終止信號。正義鏈模板的5’端添加了 GATCC，與BamHI酶切后形成的粘端互補；反義鏈模板的5’端添加了 AATTC，與EcoRI酶切后形成的粘端互補。
權(quán)利要求
1.一種針對FLG基因RNA干擾的重組慢病毒載體，是自身失活的第三代慢病毒載體， 其特征在于，其特征在于，所述的載體含PGLV/Hl/GFP-Sh FLG重組載體，所述的PGLV/H1/ GFP-Sh FLG重組載體是在PGLV/H1/GFP載體的多克隆位點中連接了雙鏈DNA片段；所述的雙鏈DNA片段的序列為以下序列中的一種(1)FLG-homo-274FLG-homo-274-S .5，-GATCCGTTGGCTCAAGCATATTATTTCAAGAGAATAATATGCTTGAGCCAACTTTTTTG-3， FLG-homo-274-AS .5，-AATTCAAAAAAGTTGGCTCAAGCATATTATTCTCTTGAAATAATATGCTTGAGCCAACG-3，(2)FLG-homo-769FLG-homo-769-S .5，-GATCCGCACCACTGATAGTCTATTATTTCAAGAGAATAATAGACTATCAGTGGTGCTTTTTTG-3， FLG-homo-769-AS .5，-AATTCAAAAAAGCACCACTGATAGTCTATTATTCTCTTGAAATAATAGACTATCAGTGGTGCG-3，(3)FLG-homo-1627FLG-homo-1627-S .5，-GATCCGCCACGAGCAATCGGTAAATTTCAAGAGAATTTACCGATTGCTCGTGGCTTTTTTG-3， FLG-homo-1627-AS .5，-AATTCAAAAAAGCCACGAGCAATCGGTAAATTCTCTTGAAATTTACCGATTGCTCGTGGCG-3，
2.權(quán)利要求I所述的針對FLG基因RNA干擾的重組慢病毒載體的制備方法，其特征在于，根據(jù)FLG mRNA序列，設(shè)計合成了雙鏈DNA片段，所述的雙鏈DNA片段為以下序列中的一種(1)FLG-homo-274FLG-homo-274-S .5，-GATCCGTTGGCTCAAGCATATTATTTCAAGAGAATAATATGCTTGAGCCAACTTTTTTG-3， FLG-homo-274-AS .5，-AATTCAAAAAAGTTGGCTCAAGCATATTATTCTCTTGAAATAATATGCTTGAGCCAACG-3，(2)FLG-homo-769FLG-homo-769-S .5，-GATCCGCACCACTGATAGTCTATTATTTCAAGAGAATAATAGACTATCAGTGGTGCTTTTTTG-3， FLG-homo-769-AS .5，-AATTCAAAAAAGCACCACTGATAGTCTATTATTCTCTTGAAATAATAGACTATCAGTGGTGCG-3，(3)FLG-homo-1627FLG-homo-1627-S .5，-GATCCGCCACGAGCAATCGGTAAATTTCAAGAGAATTTACCGATTGCTCGTGGCTTTTTTG-3， FLG-homo-1627-AS .5，-AATTCAAAAAAGCCACGAGCAATCGGTAAATTCTCTTGAAATTTACCGATTGCTCGTGGCG-3，然后將所述的DNA片段連接到PGLV/H1/GFP載體的多克隆位點中構(gòu)建成PGLV/H1/ GFP-Sh FLG 重組載體；再將 PGLV/HI/GFP-Sh FLG 重組載體、pHelperl. O、pHelper 2. O 三種載體共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞培養(yǎng)，獲得所述的重組慢病毒載體。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的針對FLG基因RNA干擾的重組慢病毒載體的制備方法，其特征在于，在所述的雙鏈DNA片段末端引入BamH I和EcoR I酶切位點。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的針對FLG基因RNA干擾的重組慢病毒載體的制備方法，其特征在于，用BamHI和EcoRI酶將PGLV/H1/GFP載體酶切，回收大片段后將其與所述雙鏈DNA 片段連接后轉(zhuǎn)化感受態(tài)菌，挑取重組陽性克隆。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種針對FLG基因RNA干擾的重組慢病毒載體及其制備。實驗構(gòu)建了針對FLG基因的shRNA的慢病毒載體，將合成的針對ShRNA的DNA片段通過慢病毒載體介導(dǎo)，還與pHelper1.0、pHelper2.0兩種載體共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞培養(yǎng)，獲得重組慢病毒載體后，轉(zhuǎn)染目的細(xì)胞，實現(xiàn)針對FLG基因的RNA干擾。采用的自身失活的第三代慢病毒載體，具有安全可靠、可感染非分裂細(xì)胞、目的基因整合至靶細(xì)胞基因組長時程表達(dá)、免疫反應(yīng)小等優(yōu)點，是一種理想載體。本發(fā)明的慢病毒載體，對人正常皮膚細(xì)胞HACAT干擾效果達(dá)75-95%，因此本發(fā)明重組慢病毒載體為有關(guān)FLG基因的進一步研究奠定良好實驗基礎(chǔ)，并能廣泛用于體內(nèi)基因治療及基因功能研究。
文檔編號C12N15/867GK102604994SQ20121005562
公開日2012年7月25日 申請日期2012年3月6日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月6日
發(fā)明者黨寧寧, 初晶學(xué), 邊紅, 逄曙光, 馬曉麗 申請人:黨寧寧