專利名稱：一種重組蛋白質(zhì)及其單克隆抗體的制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。具體的說(shuō)，本發(fā)明涉及ー種新的重組蛋白，編碼該重組 蛋白的核苷酸序列，以及含有上述核苷酸序列的質(zhì)粒載體，轉(zhuǎn)化有上述質(zhì)粒載體的菌株，還 涉及使用上述的重組蛋白制備心臟型脂肪酸結(jié)合蛋白單克隆抗體，并應(yīng)用于急性心肌梗死 (AMI)早期診斷。
背景技術(shù)：
急性心肌梗死是指急性、持續(xù)性缺血、缺氧(冠狀動(dòng)脈功能不全)所引起的心肌壞 死，是ー種嚴(yán)重影響人類健康的心血管疾病。近年來(lái)，該疾病的發(fā)病率逐年上升，患病人群 年輕化趨勢(shì)愈演愈烈，但治療效果卻不甚理想，其中的一個(gè)關(guān)鍵原因是無(wú)法實(shí)現(xiàn)急性心肌 梗死的早期快速診斷以爭(zhēng)取治療時(shí)間。從而導(dǎo)致患者病情惡化甚至死亡。因此，能夠在心 肌梗死的早期做出正確的診斷顯得尤為重要。研究表明，人心臟型脂肪酸結(jié)合蛋白(fabp3)是目前早期診斷AMI最具有特異性 和敏感性的生化指標(biāo)。該蛋白等電點(diǎn)為5. 1，分子量為15KD左右，它可將脂肪酸從細(xì)胞質(zhì) 膜向發(fā)生酯化和氧化的部位運(yùn)輸，從而進(jìn)入線粒體的能量代謝體系之中，是脂肪酸在此氧 化分解并最終生成三磷酸腺苷(ATP)，為心肌收縮提供能量。正常人的血液中不含有心臟 型脂肪酸結(jié)合蛋白，但在胸痛后0. 5-3小時(shí)后濃度開始上升，在4-8小時(shí)內(nèi)達(dá)到最高值，在 12-24小時(shí)內(nèi)恢復(fù)到正常水平；而且心臟型脂肪酸結(jié)合蛋白專ー于心肌的損傷，具有高度 特異性，基于心臟型脂肪酸結(jié)合蛋白的以上特點(diǎn)使得其成為理想的AMI早期診斷指標(biāo)。因 此，特異性檢測(cè)識(shí)別人心臟型脂肪酸結(jié)合蛋白顯得尤為重要。目前，以免疫學(xué)為基礎(chǔ)的血 清學(xué)檢測(cè)，由于其操作簡(jiǎn)便，結(jié)果易于判定，已成為主流方向。該方法主要是通過(guò)制備得到 的人心臟型脂肪酸結(jié)合蛋白單克隆抗體實(shí)現(xiàn)對(duì)人心臟型脂肪酸結(jié)合蛋白的特異性檢測(cè)。常 規(guī)的人心臟型脂肪酸結(jié)合蛋白單克隆抗體制備所使用的免疫原是基因工程技術(shù)表達(dá)的完 整蛋白，但由于堿基密碼子的緣故，該蛋白在大腸桿菌中表達(dá)困難，表達(dá)量極低，導(dǎo)致后續(xù) 的純化工作難以開展，嚴(yán)重阻礙其單克隆抗體的制備。另外，由于抗原表位氨基酸序列同源 性的緣故，使用心臟型脂肪酸結(jié)合蛋白全長(zhǎng)序列作為免疫原制備得到的單克隆抗體特異性 差，可能識(shí)別其它蛋白，從而導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果失真。

發(fā)明內(nèi)容
設(shè)計(jì)目的避免背景技術(shù)中的不足之處，通過(guò)設(shè)計(jì)一種重組蛋白并制備其單克隆 抗體，從而實(shí)現(xiàn)心臟型脂肪酸結(jié)合蛋白的特異性檢測(cè)識(shí)別，既增強(qiáng)了檢測(cè)靈敏度，又不會(huì)導(dǎo) 致檢測(cè)結(jié)果失真。設(shè)計(jì)方案為了實(shí)現(xiàn)上述設(shè)計(jì)目的。本申請(qǐng)(1)以心臟型脂肪酸結(jié)合蛋白為靶抗 原，分析并選擇該抗原兩個(gè)特異性優(yōu)勢(shì)抗原表位，序列比較結(jié)果顯示所選擇的兩個(gè)抗原表 位與其它蛋白序列無(wú)明顯同源性。(2)為了促進(jìn)所選擇優(yōu)勢(shì)抗原表位對(duì)BALB/c小鼠免疫 系統(tǒng)的刺激，增強(qiáng)免疫效果，故分別將所選擇的兩個(gè)優(yōu)勢(shì)抗原表位序列重復(fù)后通過(guò)柔性片段(連續(xù)四個(gè)甘氨酸)連接，形成重組蛋白氨基酸序列。(3)采用大腸桿菌偏愛(ài)密碼子，將 重組蛋白氨基酸序列轉(zhuǎn)換為對(duì)應(yīng)的核苷酸序列，以利于重組蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)以提 高表達(dá)量。(4)化學(xué)合成上一步驟得到的核苷酸序列，并通過(guò)酶切連接，將合成得到的核苷 酸片段插入表達(dá)載體PET-28a(+)，構(gòu)建重組蛋白表達(dá)載體。(5)重組蛋白表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大 腸桿菌ER2566感受態(tài)細(xì)胞，篩選得到重組蛋白表達(dá)菌株。(6)重組蛋白表達(dá)菌株大規(guī)模培 養(yǎng)后，超聲破菌并低溫離心后，取溶液上清通過(guò)鎳瓊脂糖親和層析柱親和層析，洗脫得到純 化重組蛋白。(7)純化后的重組蛋白多次免疫BALB/c小鼠后，取其脾臟細(xì)胞與sp2/0骨髄 瘤細(xì)胞融合，經(jīng)過(guò)多輪篩選并最終得到雜交瘤細(xì)胞株。(8)將雜交瘤細(xì)胞株分別制備BALB/ c小鼠腹水，使用辛酸-硫酸銨法及Protein G分兩步純化單克隆抗體,并分別標(biāo)記辣根過(guò) 氧化物酶(HRP)。(9) ELISA正交實(shí)驗(yàn)篩選顯示7C3單抗包被與5F6-HRP配對(duì)檢測(cè)心肌梗死 為最佳組合。技術(shù)方案I :一種重組蛋白質(zhì)，該重組蛋白質(zhì)具有如序列表SEQ ID No :1所示的氨 基酸序列。技術(shù)方案2 :—種重組蛋白質(zhì)，該重組蛋白質(zhì)包含如序列表SEQ ID No :2和SEQ ID No: 3所示的氨基酸序列。技術(shù)方案3 : —種核苷酸序列，該核苷酸序列如序列表SEQ ID No :4所示，可編碼 權(quán)利要求1-2所述的重組蛋白質(zhì)。技術(shù)方案4 :ー種質(zhì)粒載體，該質(zhì)粒載體含有權(quán)利要求3所述的核苷酸序列。技術(shù)方案5 :—種菌株，該菌株包含采用權(quán)利要求4所述的質(zhì)粒載體。本申請(qǐng)與背景技術(shù)相比，一是通過(guò)分子生物學(xué)技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了心臟型脂肪酸結(jié)合蛋 白兩個(gè)優(yōu)勢(shì)抗原表位的重復(fù)及串聯(lián)表達(dá)，增強(qiáng)了目的抗原表位對(duì)小鼠免疫系統(tǒng)的刺激，排 除了無(wú)關(guān)序列可能帶來(lái)的干擾；ニ是作為免疫原的重組蛋白僅含有人心臟型脂肪酸結(jié)合 蛋白特有的優(yōu)勢(shì)抗原表位，保證了最終得到的單克隆抗體僅特異性識(shí)別人心臟型脂肪酸結(jié) 合蛋白，并篩選得到了最優(yōu)單抗配對(duì)組合，提高了檢測(cè)的靈敏度；三是采用大腸桿菌偏愛(ài) 密碼子優(yōu)化重組蛋白對(duì)應(yīng)的核苷酸序列，從而大大提高了重組蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)水 平。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例雖然對(duì)本發(fā)明的設(shè)計(jì)思路作了比較詳細(xì)的文字描述，但是這些文字描 述，只是對(duì)本發(fā)明設(shè)計(jì)思路的簡(jiǎn)單文字描述，而不是對(duì)本發(fā)明設(shè)計(jì)思路的限制，任何不超出 本發(fā)明設(shè)計(jì)思路的組合、増加或修改，均落入到本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。實(shí)施例I :心臟型脂肪酸結(jié)合蛋白優(yōu)勢(shì)抗原表位選擇以人心臟型脂肪酸結(jié)合蛋白為靶抗原，利用生物軟件DNAssist2. 0分析其抗原表 位序列的親水性及抗原性，選擇A優(yōu)勢(shì)抗原表位(SEQ ID No 2)和B優(yōu)勢(shì)抗原表位(SEQ ID No :3)。同時(shí)，序列比較結(jié)果表明所選擇的A、B兩個(gè)優(yōu)勢(shì)抗原表位序列特異性高，與其它蛋 白序列無(wú)明顯同源性。實(shí)施例2 :心臟型脂肪酸結(jié)合蛋白優(yōu)勢(shì)抗原表位的串聯(lián)為增強(qiáng)所選擇抗原表位對(duì)小鼠免疫系統(tǒng)的刺激以利于后續(xù)實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行，將心臟型 脂肪酸結(jié)合蛋白A、B兩個(gè)優(yōu)勢(shì)抗原表位序列分別重復(fù)后再通過(guò)柔性片段(連續(xù)四個(gè)甘氨酸)連接，得到重組蛋白氨基酸序列，其具體序列如序列表SEQ ID No:l所示。實(shí)施例3 :優(yōu)化編碼重組蛋白的核苷酸序列為了提高重組蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)量，在重組蛋白氨基酸序列不變的前提 下，根據(jù)大腸桿菌偏愛(ài)密碼子將編碼重組蛋白的氨基酸序列轉(zhuǎn)化為對(duì)應(yīng)的核苷酸序列，具 體序列如序列表SEQ ID No 4所示，并在其上下游分別添加酶切位點(diǎn)BamHI和EcoRI對(duì)應(yīng) 的核苷酸序列后，由杭州賢至生物科技有限公司合成。合成后的目的基因克隆于PMD19-T 載體(寶生物工程大連有限公司)中。實(shí)施例4 :構(gòu)建重組蛋白表達(dá)載體用限制性內(nèi)切酶BamHI和EcoRI (寶生物工程大連有限公司)于37°C分別雙酶切 含目的基因的PMD19-T載體和PET-28a(+)載體(德國(guó)Novagen公司)12小時(shí)，酶切產(chǎn)物分 別行1%瓊脂糖凝膠電泳，并分別切膠回收目的基因和PET-28a(+)載體(本發(fā)明所使用的 膠回收試劑盒均來(lái)自寧波中鼎生物技術(shù)有限公司)。使用T4連接酶(寶生物工程大連有 限公司)將回收的目的基因和PET-28a(+)載體按一定的比例于4°C連接12小時(shí)后，連接 產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5ci感受態(tài)細(xì)胞(杭州賢至生物科技有限公司)，并涂布于含卡那青霉素抗性 (50 u g/mL)的LB平板，于37°C恒溫培養(yǎng)12小時(shí)之后，于平板上挑取單克隆菌株至含卡那 青霉素抗性(50 y g/mL)的LB液體培養(yǎng)基，37°C恒溫?fù)u床培養(yǎng)12小時(shí)后，采用質(zhì)粒純化試 劑盒(本發(fā)明所使用的質(zhì)粒純化試劑盒均來(lái)自于寧波中鼎生物技術(shù)有限公司)提取質(zhì)粒， 經(jīng)BamHI和EcoRI雙酶切鑒定后得到正確的重組表達(dá)載體。實(shí)施例5 :構(gòu)建重組蛋白表達(dá)菌株將構(gòu)建好的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化E. coli ER2566感受態(tài)細(xì)胞，并涂布于含卡那青霉 素抗性(50 y g/mL)的LB平板，于37°C過(guò)夜培養(yǎng)。第二日，挑取平板上單克隆菌株至含卡 那青霉素抗性(50 u g/mL)的LB液體培養(yǎng)基，37°C恒溫?fù)u床培養(yǎng)8小時(shí)后，加誘導(dǎo)劑異丙 基硫代-D-半乳糖苷(終濃度為1. 0mmol/L)誘導(dǎo)表達(dá)4個(gè)小時(shí)后制備蛋白電泳樣品。 13. 5%聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果表明重組蛋白成功表達(dá)，得到重組蛋白表達(dá)菌株。實(shí)施例6 純化重組蛋白接種重組蛋白表達(dá)菌株至LB液體培養(yǎng)基，加卡那青霉素至終濃度為50ii g/mL， 37°C恒溫?fù)u床培養(yǎng)8小時(shí)后，用含50 y g/mL卡那青霉素的LB液體培養(yǎng)基將該菌按1 : 100 比例稀釋后，分裝至細(xì)菌培養(yǎng)瓶中，置37°C恒溫?fù)u床培養(yǎng)至0D600 = 0.8，加誘導(dǎo)劑異丙基 硫代_ P -D-半乳糖苷至終濃度為1. 0mmol/L,繼續(xù)培養(yǎng)誘導(dǎo)4小時(shí)。離心收集菌體后，低溫 超聲破菌，低溫離心后取上清通過(guò)鎳瓊脂糖親和層析柱，經(jīng)洗滌、洗脫最終得到純化重組蛋 白。實(shí)施例7 :雜交瘤細(xì)胞株的獲得取5-7周齡雌性BALB/c小鼠，基礎(chǔ)免疫每只小鼠皮下多點(diǎn)注射福氏完全佐劑乳化 的50y g重組蛋白。15天后進(jìn)行加強(qiáng)免疫，方法為取相同量的重組蛋白用福氏不完全佐劑 乳化后，皮下多點(diǎn)注射。30天后，取15 yg重組蛋白尾靜脈加強(qiáng)注射，并于尾靜脈加強(qiáng)注射 后72小時(shí)后，眼眶取血，并處死小鼠，取其脾臟制備細(xì)胞懸液，細(xì)胞計(jì)數(shù)，按1/5于脾細(xì)胞的 數(shù)量取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的sp2/0小鼠骨髓瘤細(xì)胞，混和離心后，加入聚乙二醇(PEG-4000)使 二者融合。另外，再加入等體積的飼養(yǎng)細(xì)胞，混勻后分置于96孔細(xì)胞板(200UL/孔)，于 5%二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)。5天后，半保留換液，10天后采用間接酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中的雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清。具體方法如下重組蛋白經(jīng)包被液稀釋后(終濃度為I U g/mL)，以100 ii L/孔加入酶標(biāo)板(深圳 金燦華實(shí)業(yè)有限公司)，4°C包被12小時(shí)后用洗滌液洗滌五次并拍干；加入封閉液，150 u L/ 孔，37°C封閉2小吋，棄孔內(nèi)液體，拍干；加待檢細(xì)胞培養(yǎng)上清及對(duì)照血清，100 u L/孔，370C 孵育I小時(shí)后，洗滌液洗滌五次并拍干；加HRP(辣根過(guò)氧化物酶)標(biāo)記的羊抗鼠IgG， 100 u L/孔，37°C孵育30分鐘后，洗滌液洗滌五次并拍干；每孔加顯色液A和顯色液B各 50 u L，37で避光顯色10分鐘后，加終止液終止反應(yīng)，50 u L/孔，酶標(biāo)儀450nm波長(zhǎng)空白孔 校零后讀取OD值。以免疫小鼠的血清作為陽(yáng)性對(duì)照，相關(guān)溶液配方如下包被液=Na2CO3I. 5g，NaHCO3 2. 9g，加雙蒸水定容至 IOOOmL (pH9. 6)。封閉液=Na2HPO4.12H20 2. 68g, NaH2P04. 2H20 0. 39g, NaCl 8. 5g，20g 牛血清白蛋 白，加雙蒸水定容至IOOOmL (pH7. 4)。洗滌液=Na2HPO4.12H20 2. 68g, NaH2PO4. 2H20 0. 39g, NaCl 8. 5g, Tween-20 0. 5mL, 加雙蒸水定容至IOOOmL (pH7. 4)。顯色液A 200mg TMB溶于IOOmL無(wú)水こ醇,加雙蒸水定容至1000mL。顯色液B :梓檬酸2. lg, Na2HPO4. 12H20 71g，加雙蒸水定容至1000mL。使用時(shí)ImL顯色液 A+lmL 顯色液 B+0. 4 U L 30% H2O2終止液2M H2SO4, 21. 7mL濃H2SO4加雙蒸水定容至1000mL。對(duì)于檢測(cè)陽(yáng)性的雜交瘤細(xì)胞克隆，再使用有限稀釋法進(jìn)行亞克隆。經(jīng)過(guò)三次亞克 隆，共篩選得到7株雜交瘤細(xì)胞株(1F4、2B6、3D7、5F6、7C3、7E5、8A1)。實(shí)施例8 :單克隆抗體的大量制備及純化取8-9周齡的健康BALB/c小鼠，腹腔注射降植烷，每只200 U L，7天后腹腔注射雜 交瘤細(xì)胞(約I X IO6個(gè)/只)，15天后，小鼠腹部鼓起，收集腹水，3000rpm離心10分鐘，收 集上清，按I 4的比例加入60mmol/L pH4. 0醋酸緩沖液，用100mmol/L NaOH調(diào)pH4. 5。以 每毫升腹水上清加入25 y L正辛酸的比例，在磁力攪拌條件下緩慢加入正辛酸，在室溫條 件下繼續(xù)攪拌30min后，4°C 5000rpm離心30分鐘，棄沉淀。將上清液在4°C條件下預(yù)冷，以 ImL體積上清液加入0. 227g硫酸銨的比例,緩慢加入硫酸銨粉末,邊加邊攪拌,室溫條件下 繼續(xù)攪拌30min之后，5000rpm離心15分鐘,沉淀溶于1/10體積的10mmol/L PBS (pH7. 4) 緩沖液中，透析至無(wú)硫酸銨。將透析后的單抗用Protein G吸附純化，洗滌后收集洗脫峰， 即得到純化后的單抗。實(shí)施例9 =HRP標(biāo)記單抗的制備取IOmg HRP加0. lmol/L醋酸鈉2mL,充分混勻，約5分鐘后加0. 08mol/L NaIO4 溶液lmL，混勻后，室溫反應(yīng)20分鐘。加0. 4mol/Lこニ醇溶液0. 5mL,室溫靜置30分鐘后， 加21 % NaCl溶液0. 3mL,再加I. 2mL冰冷的無(wú)水こ醇沉淀醛化酶，離心去上清，沉淀酶再用 6mL 80%冰冷的こ醇溶液浸泡洗滌一次后，離心傾去除こ醇)。沉淀用0. 05mol/L碳酸鹽 緩沖液(PH9. 6)2mL溶解，然后單抗20mg，攪拌均勻，于4°C過(guò)夜。次日加IOmg NaBH4-勻， 反應(yīng)3小時(shí)后加等量飽和硫酸銨沉淀酶結(jié)合物，4°C攪拌反應(yīng)30分鐘，4°C 5000rpm離心分 鐘，棄上清，沉淀用0.01mol/L PBS 3mL溶解，置透析袋中用0.01mol/L PBS于4°C過(guò)夜透 析，加3mL無(wú)菌甘油，混勻后于_20°C保存。以上述方法分別對(duì)1F4、2B6、3D7、5F6、7C3、7E5、8A1單抗進(jìn)行HRP標(biāo)記。
實(shí)施例10 :配對(duì)單抗的篩選七種單克隆抗體(1F4、2B6、3D7、5F6、7C3、7E5、8A1)分別經(jīng)包被液稀釋后(終濃度 為I U g/mL)，以100 y L/孔加入酶標(biāo)板(深圳金燦華實(shí)業(yè)有限公司)，4°C包被12小時(shí)后用 洗滌液洗滌五次并拍干；加入封閉液，150 UL/孔，37°C封閉2小時(shí)，棄孔內(nèi)液體，拍干；加心 肌梗死患者臨床血清標(biāo)本及正常人血清標(biāo)本，100 u L/孔，37°C孵育I小時(shí)后，洗滌液洗滌 五次并拍干；加入100 u L實(shí)施例9制備得到的HRP標(biāo)記單抗，100 u L/孔，37°C孵育30分 鐘后，洗滌液洗滌五次并拍干；每孔加顯色液A和顯色液B各50 y L，37°C避光顯色10分鐘 后，加終止液終止反應(yīng)，50 ii L/孔，酶標(biāo)儀450nm波長(zhǎng)空白孔校零后讀取OD值。相關(guān)溶液 配方如下包被液=Na2CO3I. 5g，NaHCO3 2. 9g，加雙蒸水定容至 IOOOmL (pH9. 6)。封閉液=Na2HPO4.12H20 2. 68g, NaH2P04. 2H20 0. 39g, NaCl 8. 5g，20g 牛血清白蛋 白，加雙蒸水定容至IOOOmL (pH7. 4)。洗滌液=Na2HPO4.Iffi2O 2. 68g, NaH2PO4. 2H20 0. 39g, NaCl 8. 5g, Tween-20 0. 5mL, 加雙蒸水定容至IOOOmL (pH7. 4)。顯色液A 200mg TMB溶于IOOmL無(wú)水こ醇,加雙蒸水定容至1000mL。顯色液B :梓檬酸2. lg, Na2HPO4. 12H20 71g，加雙蒸水定容至1000mL。使用時(shí)ImL顯色液 A+lmL 顯色液 B+0. 4 U L 30% H2O2終止液2M H2SO4, 21. 7mL濃H2SO4加雙蒸水定容至1000mL。以上述方法正交檢測(cè)各包被單抗與酶標(biāo)單抗配對(duì)，求P/N值(陽(yáng)性標(biāo)本檢測(cè)均值 與陰性標(biāo)本檢測(cè)均值比值)值，見(jiàn)表I。表I各單抗與酶標(biāo)單抗P/N值統(tǒng)計(jì)
權(quán)利要求
1.一種重組蛋白質(zhì)，其特征在于該重組蛋白質(zhì)具有如序列表SEQ ID No :1所不的氣基酸序列。
2.—種重組蛋白質(zhì)，其特征在于該重組蛋白質(zhì)包含如序列表SEQ ID No :2和SEQ IDNo :3所示的氨基酸序列。
3.一種核苷酸序列，其特征在于該核苷酸序列如序列表SEQ ID No :4所示，可編碼權(quán)利要求1-2所述的重組蛋白質(zhì)。
4.一種質(zhì)粒載體,其特征在于該質(zhì)粒載體含有權(quán)利要求3所述的核苷酸序列。
5.一種菌株，其特征在于該菌株包含采用權(quán)利要求4所述的質(zhì)粒載體。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-2所述的重組蛋白質(zhì)，其特征在于可用于心臟型脂肪酸結(jié)合蛋白單克隆抗體的制備，包括 (a)合成權(quán)利要求3所述的核苷酸序列，并連接質(zhì)粒載體，構(gòu)建重組蛋白表達(dá)載體； (b)將步驟(a)中的重組蛋白表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌，篩選得到重組蛋白表達(dá)菌株； (c)大規(guī)模培養(yǎng)重組蛋白表達(dá)菌株后，經(jīng)純化獲取重組蛋白； (d)重組蛋白多次免疫Balb/c小鼠后,取其脾臟細(xì)胞與sp2/0骨髓瘤細(xì)胞融合,經(jīng)過(guò)多輪篩選得到雜交瘤細(xì)胞株； (e)純化單抗并分別標(biāo)記辣根過(guò)氧化物酶(HRP)，ELISA正交實(shí)驗(yàn)確定最佳單抗配對(duì)組入口 ο
全文摘要
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明涉及一種重組蛋白，該重組包含人心臟型脂肪酸結(jié)合蛋白兩個(gè)優(yōu)勢(shì)抗原表位，并采用大腸桿菌偏愛(ài)密碼子將該重組蛋白氨基酸序列轉(zhuǎn)換為對(duì)應(yīng)的核苷酸序列，化學(xué)合成該核苷酸序列并構(gòu)建重組表達(dá)載體，從而提高該重組蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)量。本發(fā)明還涉及該重組蛋白單克隆抗體的制備，經(jīng)過(guò)免疫、細(xì)胞融合及多輪篩選后得到雜交瘤細(xì)胞株，純化單克隆抗體并分別標(biāo)記辣根過(guò)氧化物酶(HRP)，ELISA正交實(shí)驗(yàn)確定最佳單抗配對(duì)組合，可用于心肌梗死早期診斷。
文檔編號(hào)C12R1/19GK102659937SQ20121007068
公開日2012年9月12日 申請(qǐng)日期2012年3月16日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月16日
發(fā)明者余銘恩, 馮俊濤, 吳瓊杉, 李會(huì)強(qiáng), 李曉照, 汪俊 申請(qǐng)人:杭州賢至生物科技有限公司