專利名稱：一種l-丙氨酸脫氫酶的突變體酶蛋白及其制備方法
技術領域：
本發明涉及一種L-丙氨酸脫氫酶的突變體酶蛋白，屬于基因工程和酶工程技術領域。
背景技術：
L-丙氨酸脫氫酶(L-alanine dehydrogenase, Aid, EC1.4.1.1)是一種以煙酰胺腺嘌呤(NAD)為輔酶的氨基酸脫氫酶。L-丙氨酸脫氫酶可逆催化L-丙氨酸氧化脫氨生成丙酮酸、氨以及NADH。反應如下所示:
L-alanine + NAD+ + H2O <->NH4+ + pyruvate + NADH + H+
L-丙氨酸脫氫酶是參與調節氨基酸和糖代謝的重要酶類，催化反應的產物丙酮酸或L-丙氨酸廣泛應用于醫藥、農藥、食品等領域，具有良好的發展前景。如將該酶與丙氨酸消旋酶共同作用，則可將丙酮酸、氨等 最終生成D-丙氨酸。因此，L-丙氨酸脫氫酶在醫藥、農藥及食品等領域具有重要的應用價值。L-丙氨酸脫氫酶廣泛存在于微生物之中，最初是由Wiame等人于1955年發現，但直到1990年其編碼基因才由Kuroda等人被克隆。目前已經從超嗜熱古菌 Archaeoglobus fulgidus,細長聚球藻 Synechococcus elongatus PCC7942,納豆菌Bacillus subtilis等多個生物體內發現了丙氨酸脫氫酶的存在。自1998年Patrick等人第一次解析了來自于Phormidium Iapideum中丙氨酸脫氫酶的空間結構以來，目前共有來自6個菌株的丙氨酸脫氫酶的晶體結構得到解析，空間結構的解析為深入闡述丙氨酸脫氫酶的催化機理提供了更為便利的條件。極端嗜堿假堅強芽孢桿菌(Bacillus pseudofirmus 0F4),是由Guffanti等于1986年首先發現，Takami等進行了分類學上的分析，該菌是嚴格需氧型、產孢子、革蘭氏陽性、運動型桿狀細菌，最適生長溫度是30°C，在pH 7.5 -11.5
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的條件下生長，最適pH 10.5。基因組序列分析發現，L-丙氨酸脫氫酶基因和丙氨酸消旋酶相鄰形成一個操縱子，二者共同作用，可以合成D-丙氨酸。但由于這些酶在微生物中含量少、活性低，用途受到了一定限制。

發明內容
本發明的目的之一是提供一種酶活力提高的L-丙氨酸脫氫酶的突變體酶蛋白。本發明的目的之二是提供一種L-丙氨酸脫氫酶的突變體酶蛋白的制備方法。本發明的目的是這樣實現的。本發明提供的一種L-丙氨酸脫氫酶的突變體酶蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示。本發明還提供編碼上述突變體酶蛋白的基因，其核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示。本發明還提供含有上述基因的載體及宿主細胞。本發明還提供含有上述基因的工程菌。本發明還提供上述突變體酶蛋白的制備方法，包括以下步驟:(1)根據NCBI數據庫中公開的來自假堅強芽孢桿菌的L-丙氨酸脫氫酶的氨基酸序列，在與結構已解析同源蛋白的二級結構序列比對的基礎上確定突變位點；設計定點突變的突變引物對；所述突變引物對為5 ' - TCTTTAACTGCCATCACCAT-3 '和5 '-ATGGTGATGGCAGTTAAAGA-3'；
(2)以攜帶L-丙氨酸脫氫酶基因的載體為模板，使用上述設計的引物進行PCR擴增，將含有突變位點的擴增產物連入表達載體中，構建突變質粒；
(3)將上述突變質粒轉化可表達目的基因的工程菌中，隨工程菌的復制表達該突變體酶蛋白。制備方法的優選條件:步驟(2)中所述表達載體為pET系列，pUC系列，pT7-7，或pGEX中的任意一種；
步驟(3)中所述工程菌為BL21 (DE3)。本發明進一步提供上述突變體酶蛋白的應用，具體是將突變體酶蛋白用 -2-
于生物法生產丙酮酸或L-丙氨酸及D-丙氨酸。具體地，本發明是從假堅強芽孢桿菌(Bacillus Pseudofirmus)中獲得L-丙氨酸脫氫酶基因(NCBI編號:YP_003426902)，根據同源蛋白的二級結構比對結果確定突變位點，通過定點突變技術(site-directed mutagenesis)取代活性中心附近氨基酸位點,將突變體基因片段與PET22b (+)質粒連接，成功構建重組表達質粒pET22b-K73A ;該重組質粒轉化大腸桿菌感受態細胞，構建用于突變體酶表達的基因工程菌BL21(DE3)/ pET22b-K73A ；在37°C和1.0mM IPTG條件下獲得了較好的表達。以轉換數Keat和表觀二級速率常數Kcat/Km表示，突變體K73A的酶活較野生型L-丙氨酸脫氫酶得到了提高；突變體的Kcat及Kcat/Km提高的倍數:
權利要求
1.一種L-丙氨酸脫氫酶的突變體酶蛋白，其特征在于其氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示
2.一種編碼權利要求1所述突變體酶蛋白的基因，其特征在于其核苷酸序列如SEQ IDN0.2所示。
3.一種制備權利要求1所述突變體酶蛋白的方法，其特征在于包括以下步驟: (1)根據NCBI數據庫中公開的來自假堅強芽孢桿菌的L-丙氨酸脫氫酶的氨基酸序列，在與結構已解析同源蛋白的二級結構序列比對的基礎上確定突變位點；設計定點突變的突變引物對；所述突變引物對為5 ' - TCTTTAACTGCCATCACCAT-3 '和5 '-ATGGTGATGGCAGTTAAAGA-3'； (2)以攜帶L-丙氨酸脫氫酶基因的載體為模板，使用上述設計的引物，利用快速PCR突變技術，構建73位氨基酸突變的突變質粒； (3)將上述突變質粒轉化可表達目的基因的工程菌中，隨工程菌的復制表達該突變體酶蛋白。
4.根據權利要求3所述的方法，其特征在于，步驟(2)中載體為pET系列中的任意一種。
5.根據權利要求3所述的方法，其特征在于，步驟(3)中工程菌為BL21(DE3)。
全文摘要
本發明公開了一種L-丙氨酸脫氫酶的突變體酶蛋白及其制備方法。根據同源序列二級結構比對結果，將假堅強芽孢桿菌(Bacilluspseudofirmus)的L-丙氨酸脫氫酶活性中心附近73位賴氨酸通過PCR定點突變為丙氨酸，構建突變體表達載體，通過原核表達及Ni-NTA親和層析技術純化得到突變體酶K73A。所獲得的突變體酶K73A之比活力是野生型的202%，而其他酶學性質沒有變化。突變體酶蛋白對底物L-丙氨酸的轉換數Kcat為376.7min-1，對β-NAD+的轉換數Kcat為290.1min-1，分別是野生型的2.0和2.1倍。可用于改善生物法生產丙酮酸及L/D-丙氨酸等的生產工藝。
文檔編號C12N15/70GK103074309SQ20121033388
公開日2013年5月1日 申請日期2012年9月11日 優先權日2012年9月11日
發明者鞠建松, 徐書景, 趙寶華, 何廣正, 李兵杰 申請人:河北師范大學