專利名稱：一種間充質干細胞注射液及其制備方法和在制備治療潰瘍性結腸炎藥物中的應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物醫藥領域，具體涉及一種間充質干細胞注射液及其制備方法和在制備治療潰瘍性結腸炎藥物中的應用。
背景技術：
潰瘍性結腸炎可以發生于任何年齡階段，但多見于20-40歲。發達國家及城市多于農村。發病原因尚不清楚，目前認為是免疫紊亂，遺傳與環境因素共同作用導致發病。研究發現潰瘍性結腸炎易發生于某些特定家族，大約20%左右潰瘍性結腸炎患者的一級親戚(即堂/表兄弟/姐妹或更親近)也患有潰瘍性結腸炎，因此遺傳因素起了一定作用。除胃腸道的癥狀，有些患者會出現機體其他部位的癥狀，包括眼睛紅和癢脹；口腔潰瘍；關節腫痛；皮膚腫塊及其他損傷；骨質疏松；腎結石等。有潰瘍性結腸炎8-10年病史的患者患結腸癌風險較高。潰瘍性結腸炎不同于一般的炎癥疾病，患者的腸道粘膜損傷嚴重，只有對其進行根本上的修復患者才能康復，傳統上的手術、藥物等手段緩解的只是表面炎癥反應，治標不治本，所以治療效果不理想，病情還是會復發，無法讓患者和家屬滿意。間充質干細胞(MSCs)是干細胞家族的重要成員，因其具有多向分化潛能、造血支持和促進干細胞植入和自我復制等特點而日益受到人們的關注。MSCs具有低免疫原性和獨特的免疫調節作用，能調節體內過激或較弱的免疫反應，減少自身異常免疫反應對自身組織的破壞。而且MSCs在體內或體外特定的誘導條件下，可分化為脂肪、骨、軟骨、肌肉、肌腱、韌帶、神經、肝、心肌、內皮等多種組織細胞，連續傳代培養和冷凍保存后仍具有多向分化潛能。胎盤、臍帶來源的MSCs具有分化潛力大、增殖能力強、免疫原性低、取材方便、無道德倫理問題的限制、易于工業化制備等特征，使其有可能成為用于組織修復、免疫紊亂的調節和代謝性疾病細胞治療最具臨床應用前景的多能干細胞。目前潰瘍性結腸炎的治療主要解決的是消除癥狀和維持無癥狀的狀態，不能從根本上治療疾病，患者需終生嚴格控制飲食，在此情況下仍然容易復發，腹痛、腹瀉及粘液膿血便嚴重影響患者的生活質量，且激素及柳氮磺砒啶等藥物副作用很大。隨著病程的進展，潰瘍性結腸炎的并發癥逐漸出現且加重，病史較長的患者易出現結腸癌。目前的藥物與手術治療并不能很好的避免這些情況的發生，調整潰瘍性結腸炎患者體內的免疫紊亂，修復病變的腸段才是治療潰瘍性結腸炎的根本。潰瘍性結腸炎病程長難治愈，通過藥物可促使結腸病變愈合，緩解腹瀉、直腸便血和腹痛等癥狀，達到消除癥狀和維持無癥狀的狀態，但不能從病因上治療疾病，而且部分患者由于病變腸段廣泛，藥物治療不能緩解病情，須通過手術切除病變腸段進行治療，手術效果尚可，但手術的并發癥較多，包括潰瘍導致的嚴重出血、腸穿孔、中毒性巨結腸、潰瘍癌變等，風險較大。鑒于目前潰瘍性結腸炎發病率逐年增高且無特效簡便的治療方法，本發明擬從根本上解決患者長期服藥和病情反復發作的困境，治療潰瘍性結腸炎。
現有技術的缺點目前潰瘍性結腸炎的治療主要依賴于飲食控制、柳氮磺砒啶及激素、中藥灌腸等藥物治療，病情嚴重時需手術治療。這些療法的綜合運用可以暫時控制腹痛、腹瀉及膿血便等癥狀，不能有效糾正患者體內免疫紊亂，不能從根本上治療潰瘍性結腸炎及阻止病情的進展與復發。而且柳氮磺吡啶及激素等藥物有很嚴重的毒副作用，比如過敏反應，中性粒細胞減少或缺乏癥、血小板減少癥及再生障礙性貧血，溶血性貧血及血紅蛋白尿，肝臟損害等。手術可以部分治愈此疾病，但術后并發癥較多且較嚴重，如粘連性腸梗阻，吻合口出血、瘺等，嚴重影響患者的生活質量。

發明內容
針對現有技術中潰瘍性結腸炎存在的上述缺陷，本發明提供了一種間充質干細胞注射液及其制備方法和在制備治療潰瘍性結腸炎藥物中的應用。所述注射液可以從根本上調節潰瘍性結腸炎患者的免疫紊亂，阻止自身免疫紊亂對腸道組織的破壞；促進病變腸道的修復與潰瘍的愈合，從而使患者擺脫腹痛腹瀉的困擾、激素等藥物帶來的毒副反應以及病情控制不佳導致的嚴重并發癥。為實現上述發明目的，本發明采用下述技術方案予以實現
一種間充質干細胞注射液，它包括以下組分
含量為2 X IO5-I XlOVml的間充質干細胞；
體積比為5-10%的臨床級DMSO ；
質量體積比為1-6%的人血白蛋白；
質量體積比為1%的低分子右旋糖酐；
余量為復方電解質溶液。對上述技術方案的進一步改進所述間充質干細胞來源于人臍帶和/或胎盤。對上述技術方案的進一步改進所述間充質干細胞活力保持在85%以上。本發明還提供了所述的間充質干細胞注射液的制備方法，包括臍帶間充質干細胞的制備和胎盤間充質干細胞的制備。本發明還提供了所述的間充質干細胞注射液在制備治療潰瘍性結腸炎藥物中的應用。對上述技術方案的進一步改進所述間充質干細胞注射液的用量為含有
IX IO6-I X IO8個/ml間充質干細胞。與現有技術相比，本發明的優點和積極效果是
I.本發明選擇用來源于人臍帶和胎盤的間充質干細胞來制備間充質干細胞注射液，所述間充質干細胞產量較大，制備體系易于質控，易于產業化。2.間充質干細胞注射液成分由人間充質干細胞、臨床級DMS0、人血白蛋白、低分子右旋糖酐、和勃脈力(復方電解質溶液)組成。本注射液可以直接經程控降溫凍存，復蘇后可直接用于臨床注射。3.本發明利用人間充質干細胞注射液來糾正潰瘍性結腸炎患者體內的免疫紊亂，從病因上治療疾病，阻止自身免疫紊亂對腸道的繼續破壞；同時分泌很多細胞生長因子及修復因子，促進病變腸段潰瘍的愈合，從而達到從根本上治療潰瘍性結腸炎的目的。本發明可以逆轉潰瘍性結腸炎病程，阻止并發癥的出現，幫助患者擺脫腹痛腹瀉對生活的影響
5以及藥物帶來的毒副作用，徹底治療潰瘍性結腸炎。結合附圖閱讀本發明的具體實施方式
后，本發明的其他特點和優點將變得更加清
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圖I是本發明中所述人臍帶間充質干細胞的顯微鏡照片。圖2是本發明中大鼠結腸組織治療后變化比較圖。圖3是本發明中大鼠結腸組織治療后病理變化比較圖。圖4是本發明中治療后大鼠血清TNF-α含量變化比較圖。
具體實施例方式下面結合附圖和具體實施方式
對本發明的技術方案作進一步詳細的說明。實施例I
一、臍帶間充質干細胞的制備
1.新鮮足月健康胎兒臍帶，用PBS緩沖液沖洗，所述PBS緩沖液含100kU/ L青霉素及100 mg/ L鏈霉素；
2.剪取5-lOcm長臍帶，將臍帶剪成2cm長的小段，用PBS緩沖液反復沖洗；所述PBS緩沖液含100 kU/ L青霉素及100 mg/ L鏈霉素；
3.將臍帶組織塊剪碎成2-5mm3小塊；加入L-DMEM培養基洗滌，在500-800g條件下離心5分鐘，棄上清；
4.將組織塊和培養基按體積比2.5-3:1比例加入培養基，混勻組織塊，接種至細胞培養皿中，置培養箱培養；所述的培養基為含l-10ng/ml堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)及MSC專用無血清培養基；
5.每3天換一次培養基，至8-9天細胞達80%左右融合時傳代；傳代培養基為MSC專
用無血清培養基。二、胎盤間充質干細胞的制備
1.用含100kU/ L青霉素、100 mg/ L鏈霉素和50u/ml肝素鈉的PBS緩沖液沖洗胎盤，沿胎盤邊緣將胎兒面羊膜慢慢剝離；
2.再次沖洗胎盤源羊膜，將羊膜剪成l_5mm3小塊；
3.將羊膜組織塊用含青霉素和鏈霉素的DMEM培養基混勻，在700-950g條件下離心IOmin ；
4.棄上清，每管加含體積比O.25%胰蛋白酶的DMEM培養基于37 °C消化IOmin，在700_950g條件下離心IOmin ；
5.棄上清，每管加完全培養基后，在2200rpm條件下離心IOmin;所述完全培養基為含100 kU/ L青霉素+100 mg/ L鏈霉素的MSC無血清培養基；
6.棄上清，羊膜組織塊接種于培養皿中，加完全培養基，在培養箱培養；每3天進行半量換液；
7.至10-12天有細胞貼壁生長，細胞克隆形成后，棄掉組織塊，加完全培養基進行培
養;
68.至15-17天細胞克隆融合至80-90%，進行細胞傳代。三、間充質干細胞注射液的制備該注射液是由以下成分按比例配制而成
1、來源于人臍帶和/或胎盤間充質干細胞，每毫升注射液中間充質干細胞的數量為
2X IO5-I X IO7 個；
2、體積比為5-10%的DMSO(臨床級)；
3、質量體積比為1-6%的人血白蛋白；
4、質量體積比為1%低分子右旋糖酐
5、余量為勃脈力(復方電解質溶液)。臨床級DMSO對細胞無毒，可以更好地起到保護細胞的作用，在細胞復蘇后無需漂洗，可直接用于臨床注射，對患者安全無毒。人血白蛋白為臨床常用注射液，可為細胞提供營養，利于細胞的新陳代謝。1%低分子右旋糖酐的添加保證細胞在保存過程中維持良好的細胞分散狀態，減少了細胞間的黏附成團及細胞黏附容器壁的現象，降低了臨床細胞輸注時可能發生的血管內細胞成團栓塞的危險，同時也降低了細胞聚集而被輸液濾器過濾導致的細胞損失。勃脈力(復方電解質溶液)，可以保持細胞的滲透壓，利于細胞的存活。該注射液組份為臨床常用電解質溶液，可方便臨床輸注。該注射液可在_196°C溫度中穩定保存。使用時解凍復蘇后可直接輸注到患者體內，細胞保持為單細胞懸液狀態，細胞活力保持在85%以上,且不會引起患者不適反應。這種注射液非常利于間充質干細胞的保存、運輸及存活，且臨床輸注安全，細胞可在此注射液中長時間保持較高的活力，便于運輸而不受使用時間的苛刻限制，解決了異地患者使用時細胞長時間運輸影響細胞活力的問題。間充質干細胞注射液的具體配制過程為如配制IOOml干細胞注射液，該注射液由人間充質干細胞、臨床級DMSO 5ml、人血白蛋白原液(原液質量體積比濃度為20%) 10ml、低分子右旋糖酐Iml (原液濃度100%)及勃脈力(復方電解質溶液)84ml組成。本發明所述質量體積比均代表質量(g)與體積(ml)的比例。每毫升注射液中間充質干細胞的數量為2X 105-1 X 107。間充質干細胞注射液在_196°C環境溫度中，仍可保持單細胞懸液狀態，復蘇后細胞活力保持在85%以上，可直接用于臨床注射。四、間充質干細胞注射液對潰瘍性結腸炎大鼠治療的安全性和有效性實驗
健康清潔級SD大鼠45只，6-8周齡，隨機分為3組，每組15只。采用免疫復合法制備潰瘍性結腸炎模型。A、B兩組大鼠均于實驗I天、14天在其腹股溝、足趾處注射乳化液O. 4ml。免疫后禁食(不禁水)24h，3%水合氯醛腹腔注射麻醉，經肛門推入0.6ml液體(100mg/kgTNBS+50%乙醇)。造模24h后A組大鼠經尾靜脈注入Iml人間充質干細胞注射液(含5 X IO6細胞，電鏡照片如圖I所示)，B組大鼠經尾靜脈注射Iml PBS0 C組為正常SD大鼠。實驗開始后每天定時觀察大鼠活動及體征。3組均于間充質干細胞治療后3天、7天、14天麻醉處死5只大鼠，剖取結腸，觀察結腸損傷，并在顯微鏡下觀察結腸病理變化。結果整個實驗過程未見大鼠出現急性休克或死亡。I.大鼠生活狀態觀察造模后I天，A、B組大鼠即開始出現厭食、懶動、大便次數增多、軟便或稀便等。3天后癥狀達高峰，之后癥狀開始緩解，A組緩解速度快于B組，實驗結束時A組已無腹瀉，活動正常。C組未見任何異常癥狀。2.結腸組織變化治療后3天，A、B組均見結腸腸壁明顯增厚、充血水腫、部分區域可見范圍較大的潰瘍；治療后7天，A組充血水腫稍減輕，潰瘍范圍亦減少，B組病變無明顯改觀；治療后14天，A組結腸僅見輕度充血水腫，未見潰瘍，B組病變略有減輕，實驗結果如圖2所示，左圖為A組大鼠間充質干細胞治療后3天結腸組織，結腸腸壁明顯增厚、充血水腫、部分區域可見范圍較大的潰瘍；中圖為A組大鼠間充質干細胞治療后14天結腸組織，病變明顯減輕，潰瘍愈合；右圖為B組大鼠治療后14天結腸組織，仍有明顯充血水腫及肉眼可見的潰瘍。3.結腸組織病理變化細胞治療后3天，A組結腸病理切片HE染色顯微鏡下見較大范圍的上皮缺損，粘膜及粘膜下層有炎癥細胞浸潤，B組病理改變類似于A組；治療后7天，A組上皮缺損范圍有所減少，粘膜及粘膜下層見大量炎癥細胞浸潤，B組病變無明顯改觀；至14天，A組粘膜結構基本完整，僅有少量炎癥細胞浸潤，實驗結果如圖3所示，左圖為A組大鼠間充質干細胞治療后3天結腸組織病理，鏡下可見較大范圍的上皮缺損，粘膜及粘膜下層有炎癥細胞浸潤；中圖為A組大鼠間充質干細胞治療后14天結腸組織病理，鏡下可見粘膜結構基本完整，僅有少量炎癥細胞浸潤；右圖為B組大鼠治療后14天結腸組織病理，鏡下仍有大范圍的上皮缺損，粘膜及粘膜下層有炎癥細胞浸潤。4.大鼠體內免疫指標變化細胞治療后3天，A組大鼠血清TNF-α含量較對照組明顯升高，B組改變類似于A組；治療后7天，A組大鼠血清TNF- α含量有所減少，B組病變無明顯改觀；至14天，A組大鼠血清TNF- α含量較B組明顯減少，實驗結果如圖4所示，治療后14天，A組大鼠血清TNF-α含量較B組明顯減少(Ρ〈0. 05)。結論人間充質干細胞注射液治療潰瘍性結腸炎大鼠安全可行，經間充質干細胞治療后患病大鼠的生活狀態、癥狀及體征、結腸病理及免疫紊亂狀態均有明顯好轉，治療明顯有效。實施例2
如配制IOOml干細胞注射液，該注射液由人間充質干細胞、臨床級DMSO 10ml、人血白蛋白原液(原液濃度為20%) 10ml、低分子右旋糖酐Iml及勃脈力(復方電解質溶液)79ml組成。每毫升注射液中間充質干細胞的數量為2X 105-1 X 107。間充質干細胞注射液在_196°C環境溫度中，仍可保持單細胞懸液狀態，復蘇后細胞活力保持在85%以上，可直接用于臨床注射。以上實施例僅用以說明本發明的技術方案，而非對其進行限制；盡管參照前述實施例對本發明進行了詳細的說明，對于本領域的普通技術人員來說，依然可以對前述實施例所記載的技術方案進行修改，或者對其中部分技術特征進行等同替換；而這些修改或替換，并不使相應技術方案的本質脫離本發明所要求保護的技術方案的精神和范圍。
權利要求
1.一種間充質干細胞注射液，其特征在于它包括以下組分含量為2 X IO5-I X IO7個/ml的間充質干細胞；體積比為5-10%的臨床級DMSO ；質量體積比為1-6%的人血白蛋白；質量體積比為1%的低分子右旋糖酐；余量為復方電解質溶液。
2.根據權利要求I所述的間充質干細胞注射液，其特征在于所述間充質干細胞來源于人臍帶和/或胎盤。
3.根據權利要求I所述的間充質干細胞注射液，其特征在于所述間充質干細胞活力保持在85%以上。
4.根據權利要求I所述的間充質干細胞注射液的制備方法，其特征在于配制體積比為5-10%的DMS0、質量體積比為1-6%的人血白蛋白、質量體積比為1%低分子右旋糖酐和復方電解質溶液，將間充質干細胞重懸于上述溶液中制成單細胞懸液，使干細胞數量為2X IO5-I X IO7 個/ml。
5.根據權利要求4所述的間充質干細胞注射液的制備方法，其特征在于所述臍帶間充質干細胞的制備包括以下步驟(1).取新鮮足月健康胎兒臍帶，用含100kU/L青霉素及100mg/L鏈霉素的PBS緩沖液沖洗；(2).剪取5-lOcm長臍帶，將臍帶剪成2cm長的小段，用所述PBS緩沖液反復沖洗；(3).將臍帶組織塊剪碎成2-5mm3小塊；加入L-DMEM培養基洗滌，在500-800g條件下離心5分鐘，棄上清；(4).將組織塊和培養基按體積比2.5-3:1比例加入培養基，混勻組織塊，接種至細胞培養皿中培養，所述的培養基為含l-10ng/ml堿性成纖維細胞生長因子的MSC專用無血清培養基；(5).每3天換一次培養基，至8-9天細胞達80%左右融合時傳代，傳代培養基為MSC專用無血清培養基。
6.根據權利要求4所述的間充質干細胞注射液的制備方法，其特征在于所述胎盤間充質干細胞的制備包括以下步驟(1).用含100kU/L青霉素、100mg/L鏈霉素和50u/ml肝素鈉的PBS緩沖液沖洗胎盤，沿胎盤邊緣將胎兒面羊膜慢慢剝離；(2).再次沖洗胎盤源羊膜，將羊膜剪成l_5mm3小塊；(3).將羊膜組織塊用含青霉素和鏈霉素的DMEM培養基混勻，在700-950g條件下離心IOmin ；(4).棄上清，每管加含體積比0.25%胰蛋白酶的DMEM培養基于37°C消化lOmin，在700_950g條件下離心IOmin ；(5).棄上清，每管加完全培養基后，在2200rpm條件下離心IOmin;所述完全培養基為含100kU/L青霉素+100mg/L鏈霉素的MSC無血清培養基；(6).棄上清，羊膜組織塊接種于培養皿中，加完全培養基，在培養箱培養；每3天進行半量換液；(7).至10-12天有細胞貼壁生長，細胞克隆形成后，棄掉組織塊，加完全培養基進行培養;(8).至15-17天細胞克隆融合至80-90%，進行細胞傳代。
7.根據權利要求I所述的間充質干細胞注射液在制備治療潰瘍性結腸炎藥物中的應用。
8.根據權利要求7所述的間充質干細胞注射液在制備治療潰瘍性結腸炎藥物中的應用，其特征在于所述間充質干細胞注射液的用量為含有I X IO6-I X IO8個/ml的間充質干細胞。
全文摘要
本發明提供了一種間充質干細胞注射液及其制備方法和在制備治療潰瘍性結腸炎藥物中的應用，所述間充質干細胞注射液它包括以下組分含量為2×105-1×107個/ml的間充質干細胞；體積比為5-10%的DMSO；質量體積比為1-6%的人血白蛋白；1%的低分子右旋糖酐和復方電解質溶液。本發明利用人間充質干細胞注射液來糾正潰瘍性結腸炎患者體內的免疫紊亂，阻止自身免疫紊亂對腸道的繼續破壞；同時分泌很多細胞生長因子及修復因子，促進病變腸段潰瘍的愈合，從而達到從根本上治療潰瘍性結腸炎的目的。本發明可以逆轉潰瘍性結腸炎病程，幫助患者擺脫腹痛腹瀉對生活的影響以及藥物帶來的毒副作用，徹底治療潰瘍性結腸炎。
文檔編號C12N5/0775GK102920734SQ20121045704
公開日2013年2月13日 申請日期2012年11月14日 優先權日2012年11月14日
發明者魏斯溧, 高宏, 王麗, 胡建霞, 張學峰 申請人:青島奧克生物開發有限公司