一種用于過敏原篩查的活細胞分析系統的制作方法
【專利摘要】本發明公開一種快速檢測過敏原的方法，屬于檢測【技術領域】，本發明整合了細胞固定、過敏原刺激和組胺釋放與測定的集成式過敏原活細胞檢測系統。該系統由四層二甲基硅氧烷微晶片構成的三個腔室組成，各腔室通過硅烷毛細管相連接，第一層腔室有多個接口可以連接流動注射儀或注射器，第二層腔室為效應細胞腔室，第三層腔室為組胺反應池腔室。待測液與效應細胞持續充分反應后，溶液通過濾膜達到組胺反應池，與事先通過反應液注射孔引入的熒光衍生液充分反應，熒光顯微鏡下根據熒光強度判斷組胺產生情況從而判定反應液中是否含有過敏原。該方法具有良好的靈敏性、快速響應性和直觀可視性，顯著縮短檢測時間，穩定性高，在化妝品、食品安全、臨床醫學的過敏原檢測中具有很大的應用潛力。
【專利說明】一種用于過敏原篩查的活細胞分析系統

【技術領域】
[0001]本發明涉及了一種基于活細胞的分析系統及其制備方法，特別是涉及到一種基于鄰苯二甲醛識別組胺等胺類的活細胞分析技術。

【背景技術】
[0002]過敏癥是在全世界廣泛流行的一類常見變態反應性疾病，由于其癥狀復雜，種類繁多，危害廣泛且難以根治，成為長期以來醫學界的一大難題。隨著經濟的發展和科技的進步，轉基因作物逐步推廣和轉基因食品的日漸普及，食物過敏原已成為食品安全隱患之一。過敏癥發病率的顯著上升，已引起社會廣泛的關注。過敏原是指能夠選擇性地激活CD4+Th2細胞及B細胞，誘導產生特異性IgE抗體應答，引起變態反應的抗原性物質。過敏原種類繁多，且對人群的危害越來越嚴重。在眾多過敏原中，一般分為兩大類:吸入性變應原和食入性變應原。一般地，引起食物過敏癥發生的過敏原多數來源于食物中的蛋白質，實際上與過敏反應相關的僅為蛋白質表面的抗原決定簇。食品過敏原或混合物的分布范圍非常廣泛，目前大約有160種食品含有過敏原。隨著轉基因食品的普及，食品中越來越多地包含有經基因修飾的成分，這些外源基因產物有可能是已知或未知的過敏原。另一方面，化妝品中的過敏物質是困擾化妝品推廣應用的天然障礙，每年因為化妝品過敏造成消費者投訴廠家的案件層出不窮，因此，在食品和醫學上建立快速有效準確的過敏原檢測技術是十分迫切并且具有重要意義的。
[0003]目前過敏原的檢測方法主要有利用人血清特異性IgE檢測法、動物抗體檢測法、PCR法、組胺釋放試驗、過敏原指紋圖譜法等。根據特異性IgE的血清學反應是主要的過敏原檢測方法之一。對于引起產生過敏反應的過敏原必須測定特異性IgE與食品過敏原結合的能力，但是由于此方法是針對單個過敏病人的血清進行檢測的，不是一種適合推廣的檢測方法。放射過敏原吸附抑制實驗和酶標記過敏原吸附抑制實驗技術是目前使用最廣泛、最靈敏的方法，也是評價過敏原總致敏活性的關鍵技術。其優點是全自動技術，避免人工實驗操作的誤差，靈敏性和準確性也很高，但其主要不足是對人血清的依賴性，血清是很難保證一致的，因此這兩種方法也難以標準化。
[0004]組胺釋放實驗主要是通過過敏原激發致敏的靶細胞，引起細胞釋放組胺，組胺含量可應用熒光測定法、放射免疫法等方法測定，與適當參照進行比較，確定組胺釋放率陽性標準，從而進行過敏原活性測定及鑒定的一類方法。通常用抗IgE抗體作陽性參照，以樣品介質(如PBS)為陰性參照，以排除實驗過程中組胺的非特異性釋放。該實驗共涉及細胞制備、組胺釋放和檢測三個步驟，不可控因素較多。因此，利用集成系統把細胞分析和組胺測定整合到一套系統上，既充分利用活細胞測定的實時、重現性好的優勢，又實現測量的一致性。將活細胞固定在一定基質上，在流動相中實現外源物刺激、組胺釋放與檢測，建立集成式活細胞篩查系統。


【發明內容】

[0005]本發明的目的是提供一種活細胞篩查系統用于檢測過敏原。
[0006]本發明的第二個目的是提供一種整合了細胞固定、過敏原刺激和組胺釋放與測定的集成式過敏原檢測裝置。
[0007]本發明的技術方案概述如下:
[0008]一種用于過敏原快速篩查的活細胞系統，具體結構如下:
[0009](I)由四層二甲基硅氧烷微晶片構成的三個腔室組成，各腔室通過硅烷毛細管相連接，第一層腔室有多個接口可以連接流動注射儀或注射器，第二層腔室為效應細胞腔室，第三層腔室為組胺反應池腔室。其中第一腔室為回行結構以增加液路長度。
[0010](2)在⑴中的反應細胞腔室含有0.45 μ m的微孔濾膜，濾膜上方與第一腔室通過硅烷毛細管相連，下方與反應池腔室相連，含有細胞的溶液從第一腔室到達效應細胞腔室后，細胞被截留濾膜上，液體則可以通過濾膜從廢液孔中排出。
[0011](3)在⑴中的組胺反應池腔室與效應細胞腔室相通，待測溶液通過檢測孔到達效應細胞腔室反應后，反應溶液通過濾膜到達組胺反應池腔室。
[0012]所述微晶片材料優選為二甲基硅氧烷、甲基硅氧烷。
[0013]所述腔室及液流通道優選用硅烷化修飾。
[0014]一種用于過敏原快速篩查的活細胞檢測方法，具體步驟如下:
[0015](I)制備效應細胞溶液,并通過活細胞染色法判斷細胞存活狀態,進行細胞計數后注入效應細胞腔室，活細胞被截留在濾膜上，通過細胞計數控制截留在了濾膜上的細胞數大于14.
[0016](2)待測液與效應細胞持續充分反應后，溶液通過濾膜達到組胺反應池，與事先通過反應液注射孔引入的熒光衍生液充分反應3-5分鐘，然后置于熒光顯微鏡下觀察熒光強度，判斷組胺產生情況從而判定反應液中是否含有過敏原。反應結束后，加入終止液洗去細胞
[0017](3)配置系列濃度的組胺溶液，直接與熒光衍生液反應，通過熒光顯微鏡觀察熒光濃度，繪制組胺濃度與熒光強度，獲得檢測范圍。
[0018]所述細胞優選鼠源肥大細胞與肺中性粒細胞
[0019]所述熒光反應液優選含有鄰苯二甲醛的堿性溶液
[0020]所述終止液優選含有1% triton xlOO的2mol/L朽1檬酸鹽溶液。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0021]截留細胞數量與組胺釋放量關系圖。說明大于14細胞后組胺產生量與細胞數量呈正比且熒光強度易觀察。

【具體實施方式】
[0022]實施方式一:濾膜上細胞截留數量與組胺釋放量比較
[0023]密度梯度離心制備肥大細胞后，細胞計數，微晶片37°C孵育，充滿鹽溶液。通過連接管利用微吸管注入數微升的不同濃度的細胞懸浮液，該管利用毛細管連到注射泵，緩沖注射將細胞注射到效應細胞腔室。為了檢測細胞是否泄露，細胞引入后，注入甲苯胺藍，使用顯微鏡觀察組胺反應池腔室。此外，收集流速為ΙΟμΙ/min洗脫液10分鐘，用甲苯胺藍染色，看有無細胞泄露。5μ1/π?η引入熒光衍生液(含有0.5%鄰苯二甲醛，I %甲醇與
0.6mol/LNaOH)反應3min，熒光顯微鏡下觀察熒光密度，計算截留細胞量與組胺釋放的關系ο
【權利要求】
1.一種用于過敏原快速篩查的活細胞系統，具體結構如下: (1)配套裝置有四層二甲基硅氧烷微晶片構成的三個腔室組成，各腔室通過硅烷毛細管相連接，第一層腔室有多個接口可以連接流動注射儀或注射器，第二層腔室為效應細胞腔室，第三層腔室為組胺反應池腔室。其中第一腔室為回行結構以增加液路長度。 (2)在(I)中的反應細胞腔室含有0.45 μ m的微孔濾膜，濾膜上方與第一腔室通過硅烷毛細管相連，下方與反應池腔室相連，含有細胞的溶液從第一腔室到達效應細胞腔室后，細胞被截留濾膜上，液體則可以通過濾膜從廢液孔中排出。 (3)在(I)中的組胺反應池腔室與效應細胞腔室相通，待測溶液通過檢測孔到達效應細胞腔室反應后，反應溶液通過濾膜到達組胺反應池腔室。
2.所述微晶片材料優選為_■甲基娃氧燒、甲基娃氧燒。
3.一種用于過敏原快速篩查的活細胞檢測方法，具體步驟如下: (1)制備效應細胞溶液，并通過活細胞染色法判斷細胞存活狀態，進行細胞計數后注入效應細胞腔室，活細胞被截留在濾膜上，通過細胞計數控制截留在了濾膜上的細胞數大于14 ； (2)待測液與效應細胞持續充分反應后，溶液通過濾膜達到組胺反應池，與事先通過反應液注射孔引入的熒光衍生液充分反應，然后置于熒光顯微鏡下觀察熒光強度，判斷組胺產生情況從而判定反應液中是否含有過敏原； (3)配置系列濃度的組胺溶液，直接與熒光衍生液反應，通過熒光顯微鏡觀察熒光濃度，繪制組胺濃度與熒光強度，獲得檢測范圍。
4.所述細胞優選鼠源肥大細胞與肺中性粒細胞。
5.所述熒光反應液優選含有鄰苯二甲醛的堿性溶液。
【文檔編號】C12M1/00GK104232466SQ201310244315
【公開日】2014年12月24日 申請日期:2013年6月20日 優先權日:2013年6月20日
【發明者】劉永信 申請人:天津默斯生物科技有限公司