一種高耐鹽魯氏接合酵母的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種高耐鹽魯氏接合酵母A（ZygosaccharomycesrouxiiA）菌株，其保藏編號為CCTCC?NO：M2013310。該菌株具有高耐鹽特性、較好的生長穩(wěn)定性、能產生較濃郁的醇厚與酯香風味的特征，可用于高鹽稀態(tài)醬油釀造，縮短發(fā)酵周期，提高醬油風味與品質。
【專利說明】一種高耐鹽魯氏接合酵母
【技術領域】
[0001 ] 本發(fā)明屬于微生物【技術領域】,涉及一種高耐鹽魯氏接合酵母iZygosaccharomycesrouxi1、。該菌株可以在醬油釀造高鹽環(huán)境下生長繁殖，能產生醇厚、酯香的醬油風味，提高醫(yī)油品質。
【背景技術】 [0002]醬油是我國一種傳統(tǒng)的發(fā)酵調味品，深受我國及世界人民的喜愛。醬油是曲霉、酵母菌及細菌等微生物綜合作用的產品，發(fā)酵時這些微生物產生的酶和代謝產物形成醬油的色香味成分，其中最重要的是酵母菌和乳酸菌，它們的主要作用是發(fā)酵糖類產生小分子醇、醛、酸、酯、酚類等風味物質，這是醬油風味產生的主要途徑。
[0003]醬醅中分離出的酵母菌有7個屬，32個種，其中與醬油質量關系最密切的是魯氏接合酵母rouxii)、易變球擬酵母Fersa蒙奇球擬酵母ffiogii)、多變假絲酵母等。魯氏酵母是最常見的耐高滲透壓酵母，其特點是能生長在含糖量極高的物料中，也能在含18%食鹽的培養(yǎng)基質中快速繁殖，主要作用是進行酒精發(fā)酵，與此同時進行各種香氣成分如酯類的合成、甘油及多元醇的合成等。
[0004]高鹽稀態(tài)發(fā)酵工藝是在我國傳統(tǒng)發(fā)酵工藝上改進的，同時又吸收消化了日本的許多先進技術，發(fā)酵周期為3-6個月，醬油產品氨基酸態(tài)氮生成率高，約為全氮的60%左右，醬油風味好。在高鹽稀態(tài)醬醪發(fā)酵過程中，為了提高醬油的風味，一般都要添加耐鹽產香酵母，從而改善醬油釀造用米曲霉發(fā)酵風味的單一及不飽和性，全面提高醬油的風味及檔次。魯氏酵母的添加技術已經成熟，應用比較廣泛，呈味效果已得到公認。
[0005]然而，人工添加的酵母可能不適應醬油釀造過程中的高鹽環(huán)境，并不能很好地發(fā)揮作用。因此篩選耐高鹽的醬油酵母菌株是改善醬油風味、提高醬油質量的重要手段之一。

【發(fā)明內容】

[0006]鑒于現(xiàn)有技術的不足，本發(fā)明的目的在于提供一株耐高鹽的應用于醬油釀造的產醇、產酯酵母菌株。該菌株可以在醬油釀造高鹽環(huán)境下生長繁殖，能產生醇厚、酯香的醬油風味，提高醬油品質。根據其形態(tài)特征、生理生化特征及其26S rRNA基因序列在Genbank中的檢索結果，鑒定菌株A為魯氏接合酵母iZygosaccharmyces rouxi1、。
[0007]本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的:
一種高耐鹽魯氏接合酵母A {Zygosaccharomyces rouxii J )菌株，已于2013年07月02日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為CCTCC NO:M2013310。
[0008]上述的高耐鹽魯氏接合酵母A菌株的26S rRNA核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
[0009]本發(fā)明所提供的高耐鹽魯氏接合酵母A (.Zygosaccharomyces rouxii J)菌株具有以下形態(tài)特征:直徑約5 μ m，球形，不運動，以出芽方式進行無性繁殖。在YEH)瓊脂培養(yǎng)基上28 °C培養(yǎng)48h后，為乳白色，不透明，圓形菌落。[0010]本發(fā)明所提供的高耐鹽魯氏接合酵母A {Zygosaccharomyces rouxii J)菌株的全細胞脂肪酸主要以油酸、棕櫚酸、棕櫚油酸和硬脂酸形式存在。在含鹽培養(yǎng)基上培養(yǎng)，菌株A不飽和脂肪酸含量增加，其全細胞脂肪酸主要以油酸、亞油酸、棕櫚油酸和棕櫚酸形式存在。
[0011]根據耐鹽性能實驗結果，本發(fā)明所提供的高耐鹽魯氏接合酵母A{Zygosaccharomyces rouxii A )菌株的耐鹽范圍(以 NaCl 計)為 0_24%。
[0012]根據溫度生長實驗結果，本發(fā)明所提供的高耐鹽魯氏接合酵母AiZygosaccharomyces rouxii J )菌株的生長溫度范圍為:6_39°C。
[0013]本發(fā)明所述高耐鹽魯氏接合酵母A (.Zygosaccharomyces rouxii J )菌株在20%NaCl的YEH)培養(yǎng)基中培養(yǎng)產生的醇厚、酯香風味明顯優(yōu)于YETO培養(yǎng)基，用于醬油釀造可改善醬油風味，提高醬油品質。 [0014]本發(fā)明所述高耐鹽魯氏接合酵母A {Zygosaccharomyces rouxii J )菌株在YEF1D培養(yǎng)基28°C培養(yǎng)24h，連續(xù)傳代數代培養(yǎng)，其培養(yǎng)特征及形態(tài)特征均無明顯變化，生物學性狀穩(wěn)定。
[0015]與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明所述高耐鹽魯氏接合酵母rouxiiJ )菌株具有如下有益的技術效果:
(I)根據實施例3表2的食鹽耐受性實驗可以看出，本發(fā)明所述魯氏接合酵母菌株在20%氯化鈉存在情況下生長情況良好，在24%氯化鈉存在情況下仍能保持一定的生長量，在26%氯化鈉存在情況下仍能生長。這說明本發(fā)明的魯氏接合酵母菌株食鹽耐受性強，完全適合工業(yè)上高鹽稀態(tài)釀造醬油生產中的應用。
[0016](2)本發(fā)明所述魯氏接合酵母菌株在35°C下生長情況良好，在39°C仍能保持一定的生長量。這說明本發(fā)明的魯氏接合酵母菌株具有一定的溫度耐受性，適合工業(yè)上在高鹽稀態(tài)釀造醬油生產中的應用。
[0017](3)根據實施例4，本發(fā)明所述魯氏接合酵母菌株在含18%氯化鈉的YEH)培養(yǎng)基28°C培養(yǎng)4d后，產生香氣物質，具有較濃郁的醇厚、酯香風味。
[0018](4)本發(fā)明所述魯氏接合酵母菌株由于耐鹽性高，在高鹽稀態(tài)醬油釀造中能縮短發(fā)酵周期，并產生醇厚、酯香的醬油風味，為醬油的工業(yè)生產提供了優(yōu)良菌株。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0019]圖1為本發(fā)明所述魯氏接合酵母A在1000倍顯微鏡菌體形態(tài)圖。
[0020]圖2為本發(fā)明所述魯氏接合酵母A基于26S rRNA基因發(fā)育樹圖。
【具體實施方式】
[0021]以下結合【具體實施方式】對本發(fā)明進行詳細描述。實施例僅為舉例說明，本發(fā)明的范圍并不以具體實施方法為限，而是由權利要求的范圍加以限定。
[0022]實施例1:本發(fā)明魯氏接合酵母A的26S rRNA鑒定實驗
酵母基因組DNA的提取和純化利用Sambrook et al.(1989)方法。以提取并檢測合格的染色體 DNA 為模板，選用 NL I (5’ -GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3 ’ )和 NL4(5，-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3’)作為引物，26s rRNA基因序列的PCR擴增按 Solieri L.etal.(2007)方法操作，基因序列測定由上海英駿公司完成。利用Clustalxl.8，MEGA 5.0軟件(Tamura et al.2011)，根據26S rRNA基因序列相似度分析的結果，選取相關菌株的26SrRNA 基因序列,分別采用 neigbor-joining (鄰位相接法，NJ) (Saitou and Nei 1987)算法得到相應的系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2)。構建的系統(tǒng)發(fā)育樹表明菌株A在Zygosaccharomyces屬進化樹一個分枝上,與Z /PoMii種的菌株在一個類群內而與其他種處于不同的分枝。說明菌株A屬于魯氏接合酵母iZygosaccharmyces rouxii)。
[0023]實施例2:本發(fā)明魯氏接合酵母A全細胞脂肪酸組分特征分析實驗
酵母繁殖時是依靠其細胞膜脂肪酸的飽和度來適應周圍環(huán)境中的酒精、食鹽、高溫等不利因素的。為了分析菌株A的脂肪酸成分，首先將菌株A接種于YEH)肉湯中，28°C培養(yǎng)至對數生長期后期，收集適當菌體，根據《the protocol of the Sherlock MicrobialIdentification System (MIDI))) (version 6.0.)描述的方法提取菌體脂肪酸甲基化酯，最后用Agilent 6890N GC氣相色譜通過MIDI Sherlock YEAST6數據庫分析脂肪酸成分(Sasser，1990)。本發(fā)明所述菌株A全細胞脂肪酸組分如表1所示。菌株A全細胞脂肪酸主要以油酸、棕櫚酸、棕櫚油酸和硬脂酸形式存在。在含鹽(18% NaCl)培養(yǎng)基上培養(yǎng)，菌株A不飽和脂肪酸含量增加，C18脂肪酸含量增加，其全細胞脂肪酸主要以油酸、亞油酸、棕櫚油酸和棕櫚酸形式存在。與現(xiàn)有魯氏接合酵母在其高氯化鈉濃度YEH)培養(yǎng)基上培養(yǎng)相t匕，菌株A的C18脂肪酸含量提高了 5%以上，不飽和脂肪酸含量提高了 10%以上。
[0024]表1菌A主要脂肪酸成分
【權利要求】
1.一種高耐鹽魯氏接合酵母A iZygosaccharomyces rouxii J)菌株,其保藏編號為CCTCC NO:M2013310o
2.根據權利要求1所述的高耐鹽魯氏接合酵母A菌株，其特征在于:所述菌株的26SrRNA核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
3.根據權利要求1或2所述的高耐鹽魯氏接合酵母A菌株，其特征在于:所述菌株的直徑約5 μ m,球形，不運動，以出芽方式進行無性繁殖，在YEH)瓊脂培養(yǎng)基28°C培養(yǎng)48h后為乳白色、不透明的圓形菌落。
4.根據權利要求1所述的高耐鹽魯氏接合酵母A菌株，其特征在于:所述菌株的全細胞脂肪酸主要以油酸、棕櫚酸、棕櫚油酸和硬脂酸形式存在，在含鹽培養(yǎng)基上培養(yǎng)，全細胞不飽和脂肪酸含量增加，其全細胞脂肪酸主要以油酸、亞油酸、棕櫚油酸和棕櫚酸形式存在。
5.根據權利要求1所述的高耐鹽魯氏接合酵母A菌株，其特征在于:所述菌株的氯化鈉耐受濃度為0-24%。
6.根據權利要求1所述的高耐鹽魯氏接合酵母A菌株，其特征在于:所述菌株的葡萄糖耐受濃度為0-60%。
7.根據權利要求1所述的高耐鹽魯氏接合酵母A菌株，其特征在于:所述菌株的生長溫度范圍為6-39 °C。
8.根據權利要求1所述的高耐鹽魯氏接合酵母A菌株，其特征在于:所述菌株的生長pH 范圍為 4.0-7.0。
9.根據權利要求·1所述的高耐鹽魯氏接合酵母A菌株，其特征在于:所述菌株在含食鹽的YEro培養(yǎng)基中培養(yǎng)，產生香氣物質，具有較濃郁的醇厚、酯香風味。
10.根據權利要求1所述的高耐鹽魯氏接合酵母A菌株，其特征在于:所述菌株在YEro培養(yǎng)基30°C培養(yǎng)24h，連續(xù)傳代數代培養(yǎng)，其培養(yǎng)特征及形態(tài)特征均無明顯變化，生物學性狀穩(wěn)定。
【文檔編號】C12R1/645GK103589651SQ201310362802
【公開日】2014年2月19日 申請日期:2013年8月20日 優(yōu)先權日:2013年8月20日
【發(fā)明者】陳雄, 代俊, 王志 申請人:湖北工業(yè)大學