一種活體提取縊蟶dna的方法
【專利摘要】本發明公開的一種活體提取縊蟶DNA的方法，其包括如下步驟：1）縊蟶出水管組織的剝離；2）出水管組織基因組DNA的提取；3)提取DNA的檢測。采用本發明方法是從縊蟶能夠再生的出水管組織中提取DNA，從而避免殺死縊蟶或者影響縊蟶的生長發育。采用本發明方法提取縊蟶的DNA可以檢測其基因型，在縊蟶科研和育種中具有重要的應用價值。在家系培育中，親本十分珍貴，對親本的傷害影響其生產性能的考察和種質利用。采用本發明方法可以檢測家系親本的基因型，從而預測子代的生產性能，篩選家系，提高縊蟶育種效率。
【專利說明】一種活體提取縊蟶DNA的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及提取生物DNA的方法，特別涉及一種活體提取縊蟶DNA的方法。
【背景技術】
[0002]溢経(Sinonovacula constricta Lamarck)為我國重要灘涂貝類,是四大海產養殖貝類之一。據統計，我國貝類養殖產量占海水養殖總產量的82%。灘涂貝類年產量近200萬噸，其中縊蟶產量達70萬噸，約占我國灘涂貝類養殖總產量的30%。雖然我國縊蟶養殖有800多年的歷史，但是苗種都是來自于野生種，培育生長速度快、經濟性狀良好的優良品種是保障縊蟶養殖業持續發展的重要途徑。[0003]但是單獨進行傳統的選擇育種，其選育周期較長，而且其表型性狀容易受到環境的影響，因此借助分子標記輔助育種的技術手段，在基因水平上篩選與生長性狀相關的分子標記，從而可以加快育種速度和準確度。尤其是在微衛星及SNP標記的開發中，檢測縊蟶基因型是進行縊蟶生長性狀與分子標記關聯分析的關鍵。而縊蟶DNA的提取是必不可少的環節，傳統提取DNA的方法需要處死縊蟶，獲取其外套膜。這對其生長性狀的檢測以及接下來的種質利用造成極大的影響。

【發明內容】

[0004]本發明所要解決的技術問題在于針對現有傳統縊蟶DNA提取方法所存在的問題而提供一種既能獲取DNA又無需殺死縊蟶活體提取縊蟶DNA的方法，在縊蟶育種中具有重要的應用價值。
[0005]本發明所要解決的技術問題可以通過以下技術方案來實現:
[0006]一種活體提取縊蟶DNA的方法，包括如下步驟:
[0007]I)縊蟶出水管組織的剝離:
[0008]1.1)把待取組織的縊蟶放入水溫20_30°C的海水培養桶內暫養，并在縊蟶外殼粘上帶號碼的標記；
[0009]1.2)需要提取DNA時，將待取組織的縊蟶放置在冰上，麻醉待其出水管伸出后用剪刀剪取縊蟶出水管，長度為0.3-1.0cm，放入相應的第一離心管并記好編號；
[0010]2)出水管組織基因組DNA的提取:
[0011]往收集在離心管中的出水管組織中加入DNA提取液，渦旋離心15-30s，加入DNA提取液1/10倍體積的120mg/ml蛋白酶K，震蕩混勻，在56°C放置，直至組織完全溶解得到第一溶液；
[0012]3)向第一溶液中加入DNA提取液1.0_1.2倍體積的苯酚溶液翻轉使其充分混勻的第二溶液；將所得的第二溶液放入離心機以10000-12000rpm離心10min_20min得到第一上
清液，將第一上清液轉移到第二離心管；
[0013]4)加入等體積的氯仿/異丙醇混合溶液，充分混勻后放入離心機10000-12000rpm離心10min-20min得到第二上清液；所述氯仿/異丙醇混合溶液中氯仿與異丙醇的體積比為24:1 ;之后向第二上清液中加入兩倍體積的-20°C無水乙醇；以10000-12000rpm離心10-15min后用75%乙醇洗滌2次，倒掉離心管中液體，室溫晾干得到晾干物；加入40-120 μ I無菌水，4 °C冰箱內過夜溶解。
[0014]5)提取DNA的檢測:
[0015]用1.0%的瓊脂糖凝膠檢測DNA片段大小，DNA大分子條帶清晰。
[0016]分光光度計顯示所得DNA的濃度在50-3000ng/ μ 1，0D260/0D280在1.7-1.9。
[0017]在本發明的一個優選實施例中，所述步驟I)的海水培養桶是指圓形塑料桶，內加比重為1.015的海水，底下鋪泥，泥的顆粒直徑Φ〈150 μ m，厚度5-lOcm。
[0018]由于采用了如上的技術方案，本發明的方法與現有技術相比，具有如下顯著的技術效果:
[0019]1.采用本發明方法是從縊蟶能夠再生的出水管組織中提取DNA，從而避免殺死縊蟶或者影響縊蟶的生長發育。
[0020]2.采用本發明方法提取縊蟶的DNA可以檢測其基因型，在縊蟶科研和育種中具有重要的應用價值。在家系培育中，親本十分珍貴，對親本的傷害影響其生產性能的考察和種質利用。
[0021]3.采用本發明方法可以檢測家系親本的基因型，從而預測子代的生產性能，篩選家系，提高縊蟶育種效率。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0022]圖1為縊蟶DNA1.0%瓊脂糖電泳圖片示意圖。
[0023]圖2為縊蟶DNA1.0%瓊脂糖電泳跑膠結果示意圖。
[0024]圖3為剪去出水管后的縊蟶存活率示意圖。
【具體實施方式】
[0025]實施例1:
[0026]為了證實從同一個個體外套膜和出水管中提取的DNA是一樣的，該實施例1采用I對普通引物分別對5個縊蟶的外套膜和出水管中提取的DNA進行PCR檢測。
[0027]1.縊蟶外套膜和出水管的獲取
[0028]在上海海洋大學省部共建水產種質資源發掘與利用教育部重點實驗室，選用寧波長街產縊蟶作為實驗素材，在水溫25°C，比重1.015的海水培養桶內暫養20個縊蟶，3天后隨機挑選5個縊蟶。縊蟶的出水管標記為sl-5 ;縊蟶的外套膜標記為ml-5。
[0029]2.DNA 的提取
[0030]往收集在離心管中的出水管組織中加入250 μ I DNA提取液，渦旋離心15s，加入20μ 120mg/ml蛋白酶K，震蕩混勻，在56°C放置，直至組織完全溶解。加入250 μ I苯酚溶液輕微翻轉IOmin使其充分混勻。將上一步所得溶液放入離心機12，OOOrpm離心20min,將上清液轉移到新離心管。加入等體積氯仿/異丙醇(24:1),充分混勻IOmin,以12，OOOrpm離心20min。之后向上清液中加入兩倍體積的無水乙醇(_20°C )。以12，OOOrpm離心lOmin。用75%乙醇洗滌2次，倒掉離心管中液體，室溫晾干。加入50 μ I無菌水，4°C冰箱內過夜溶解。1.0%瓊脂糖電泳檢測DNA完整度(參見圖1)。分光光度計檢測DNA濃度與OD值，見表[0031 ] 表1分光光度計檢測DNA結果
【權利要求】
1.一種活體提取縊蟶DNA的方法，其特征在于，包括如下步驟: 1）縊蟶出水管組織的剝離: . 1.1)把待取組織的縊蟶放入水溫20-30°C的海水培養桶內暫養，并在縊蟶外殼粘上帶號碼的標記；. 1.2)需要提取DNA時，將待取組織的縊蟶放置在冰上，麻醉待其出水管伸出后用剪刀剪取縊蟶出水管，長度為0.3-1.0cm，放入相應的第一離心管并記好編號； 2)出水管組織基因組DNA的提取: 往收集在離心管中的出水管組織中加入DNA提取液，渦旋離心15-30s，加入DNA提取液1/10倍體積的120mg/ml蛋白酶K，震蕩混勻，在56°C放置，直至組織完全溶解得到第一溶液； 3)向第一溶液中加入DNA提取液1.0-1.2倍體積的苯酚溶液翻轉使其充分混勻的第二溶液；將所得的第二溶液放入離心機以10000-12000rpm離心10_20min得到第一上清液，將第一上清液轉移到第二離心管； 4)加入等體積的氯仿/異丙醇混合溶液，充分混勻后放入離心機10000-12000rpm離心10-20min得到第二上清液；所述氯仿/異丙醇混合溶液中氯仿與異丙醇的體積比為24:1 ;之后向第二上清液中加入兩倍體積的-20°C無水乙醇；以10000-12000rpm離心10_20min后用75%乙醇洗滌2次，倒掉離心管中液體，室溫晾干得到晾干物；加入40-120 μ I無菌水，4°C冰箱內過夜溶解。 5)提取DNA的檢測: 用1.0%的瓊脂糖凝膠檢測DNA片段大小，DNA大分子條帶清晰。 分光光度計顯示所得DNA的濃度在50-3000ng/y 1，0D260/0D280在1.7-1.9。
2.如權利要求1所述的活體提取縊蟶DNA的方法，其特征在于，所述步驟I)的海水培養桶是指圓形塑料桶，內加比重為1.015的海水，底下鋪泥，泥的顆粒直徑Φ〈150 μ m，厚度5_10cmo
【文檔編號】C12N15/10GK103602669SQ201310630359
【公開日】2014年2月26日 申請日期:2013年11月29日 優先權日:2013年11月29日
【發明者】李家樂, 王劦, 牛東紅, 沈和定, 李多, 王澤
申請人:上海海洋大學