專利名稱：縊蟶抗菌肽基因的pcr重組制備抗菌肽的方法與用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種抗菌肽的方法與用途，特別是一種縊蟶抗菌肽基因的PCR重組制備抗菌肽的方法與用途。
背景技術(shù)：
隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的迅速發(fā)展，水產(chǎn)病害日趨嚴重，防治過程中抗生素甚至一些禁用藥物的大量長期使用，不僅威脅食品安全，而且破壞了水生環(huán)境，許多細菌產(chǎn)生了明顯的耐藥性，影響了水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)性發(fā)展。濫用抗生素也使我國水產(chǎn)品出口屢屢受阻，給水產(chǎn)業(yè)造成了巨大損失。因此尋求抗菌力強、抗菌譜廣、活性穩(wěn)定的抗菌素替代品成為防治水產(chǎn)病害的當務(wù)之急?？咕氖巧矬w內(nèi)產(chǎn)生的一類對抗外源性病原體致病作用的防御性肽類活性物質(zhì)，具有廣譜抗菌活性，同時有“傳統(tǒng)抗生素”無法比擬的優(yōu)越性不會誘導(dǎo)抗藥菌株的產(chǎn)生，有希望成為新一代抗菌劑。抗菌肽添加到養(yǎng)殖魚類的飼料中，不僅可以抑制和消滅水生環(huán)境中的病原微生物，提高魚體的免疫能力，而且可以避免抗生素在魚體中的蓄積，提高水產(chǎn)品質(zhì)量。目前國內(nèi)外研究以從生物體分離純化抗菌肽為主，此方法得到的抗菌肽量少成本較高，因此很難得以廣泛應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種新的對水產(chǎn)疾病具有防治效果的縊蟶抗菌肽基因的PCR重組制備抗菌肽的方法。

本發(fā)明所要解決的另一個技術(shù)問題是提供前述方法制得的抗菌肽的一種用途。本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是通過以下的技術(shù)方案來實現(xiàn)的。本發(fā)明是一種縊蟶抗菌肽基因的PCR重組制備抗菌肽的方法，其特點是，其步驟如下
(1)收集縊蟶血淋巴10mL，4°C、4000 rpm下離心25 min得到血淋巴細胞，棄上清液，收集沉淀物于1. 5 mL RNase-free的EP管,加入I mL Trizol,吹打混勻后室溫靜置5 min,每管加500 U L氯仿,振搖30s,冰浴3 min,然后在4°C, 12000 rpm下離心15 min,吸取上清液，轉(zhuǎn)移至另外一支RNase-free的EP管,用體積比為24 1的氯仿異戍醇抽提至無蛋白沉淀，吸取上清液，加4°C預(yù)冷的500 UL異丙醇，混勻，冰上靜置10 min,4°C, 12000 rpm離心15 min,棄上清；加I mL 4°C預(yù)冷的75%乙醇洗一次，4°C,8000 rpm離心5 min,倒掉乙醇，室溫倒置15 min，加10 mL DEPC處理水溶解，得縊蟶總RNA樣品，置于4 °C冷藏；
(2)按下述方法對縊蟶總RNA樣品進行PCR擴增
a.反轉(zhuǎn)錄cDNA合成體系建立
取20 縊蟶總RNA樣品70 °C下溫育10 min，迅速冰上冷卻，得到變性總RNA，備用；按下述方法建立反轉(zhuǎn)錄cDNA合成體系
權(quán)利要求
1.一種縊蟶抗菌肽基因的PCR重組制備抗菌肽的方法，其特征在于，其步驟如下 (1)收集縊蟶血淋巴10mL，4°C、4000 rpm下離心25 min得到血淋巴細胞，棄上清液，收集沉淀物于1. 5 mL RNase-free的EP管,加入I mL Trizol,吹打混勻后室溫靜置5 min,每管加500 μ L氯仿,振搖30s,冰浴3 min,然后在4°C, 12000 rpm下離心15 min,吸取上清液，轉(zhuǎn)移至另外一支RNase-free的EP管,用體積比為24 1的氯仿異戍醇抽提至無蛋白沉淀，吸取上清液，加4°C預(yù)冷的500 μ L異丙醇，混勻，冰上靜置10 min,4°C, 12000 rpm離心15 min,棄上清；加I mL 4°C預(yù)冷的75%乙醇洗一次，4°C,8000 rpm離心5 min,倒掉乙醇，室溫倒置15 min，加10 mL DEPC處理水溶解，得縊蟶總RNA樣品，置于4 °C冷藏； (2)按下述方法對縊蟶總RNA樣品進行PCR擴增 a.反轉(zhuǎn)錄cDNA合成體系建立 取20 μ I縊蟶總RNA樣品70 °C下溫育10 min，迅速冰上冷卻，得到變性總RNA，備用；按下述方法建立反轉(zhuǎn)錄cDNA合成體系
2.權(quán)利要求1所述的縊蟶抗菌肽基因的PCR重組制備抗菌肽的方法所制得在含抗菌肽的上清液在制備抑制泥鰍病害抗菌肽制劑中的用途。
全文摘要
本發(fā)明是一種縊蟶抗菌肽基因的PCR重組制備抗菌肽的方法，它以縊蟶血竇淋巴細胞為材料，從中提取總RNA，設(shè)計特異引物，采用嵌套PCR方法，獲得258bp大小的scp基因，將其插入pPICZαA表達載體，轉(zhuǎn)入畢赤酵母GS115,得到表達菌株LGS-3，通過表達條件優(yōu)化，獲得其最佳表達條件為溫度28℃，甲醇濃度1%，誘導(dǎo)表達時間為72h。誘導(dǎo)表達的產(chǎn)物抗菌肽對凡隆氣單胞菌具有較強的抑制活性。將其應(yīng)用于泥鰍養(yǎng)殖，飼料中添加0.5%的抗菌肽制劑，可使泥鰍在投放凡隆氣單胞菌的情況下存活率提高48%左右，產(chǎn)量的增加28.55%左右。
文檔編號C12N15/81GK103045604SQ201210547250
公開日2013年4月17日 申請日期2012年12月17日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月17日
發(fā)明者李聯(lián)泰, 安賢惠, 朱明 申請人:淮海工學(xué)院