一種快速開發縊蟶微衛星分子標記的方法
【專利摘要】本發明是一種快速開發縊蟶微衛星分子標記的方法，包括縊蟶微衛星序列的查找，基因組DNA的快速提取，微衛星引物的適用性擴增和微衛星標記的基因型鑒定方法。首先，在縊蟶轉錄組數據庫中，按照微衛星分類標準，快速查找微衛星序列；其次，利用簡化的苯酚氯仿抽提法，快速提取DNA；然后，建立縊蟶微衛星引物適用性的PCR擴增方法；最后，采用FAM熒光標記引物和ABI3730核酸分析儀進行縊蟶微衛星標記的鑒定，建立了一種快速開發縊蟶微衛星分子標記的方法。此方法具有高效、快速、準確等優點。
【專利說明】一種快速開發縊蟶微衛星分子標記的方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于分子遺傳學領域，具體涉及一種快速開發縊蟶微衛星分子標記的方法。
【背景技術】
[0002]縊蟶是我國重要的灘涂貝類，其養殖歷史悠久，是我國四大海產養殖貝類之一。由于縊蟶肉質細嫩、味道鮮美、營養豐富，深受消費者喜愛，其市場價值高，養殖前景非常廣闊。目前，縊蟶的繁殖用親貝主要來源于福建和浙江一帶，長期以來容易導致苗種混雜，種質下降。采用分子標記檢測縊蟶群體遺傳多樣性和親緣關系，是了解縊蟶種質資源現狀的主要方法。
[0003]由于微衛星標記具有分布廣，多態性高，穩定性好等特點，在群體遺傳學領域應用最為廣泛。微衛星標記的開發是重要環節，目前主要有兩種辦法，一種是篩選其他物種已經開發的微衛星標記，但適用性差；另一種辦法是在DNA水平上從頭開發自身物種的微衛星標記，例如磁珠富集法和PCR法，但是這種辦法費時費力。

【發明內容】

[0004]本發明所要解決的技術問題在于針對現有微衛星標記方法所存在的問題而提供一種在新一代測序技術構建縊蟶轉錄組數據庫的基礎上發明的既簡單可行又準確可靠的快速開發縊蟶微衛星分子標記的方法。
[0005]本發明所要解決的技術問題可以通過以下技術方案來實現:
[0006]一種快速開發縊蟶微衛星分子標記的方法，包括以下步驟:`[0007]1.縊蟶微衛星序列的篩選步驟
[0008]利用新一代454測序技術獲得縊蟶轉錄組數據庫，按照兩堿基重復次數>6，三堿基重復次數>4，四、五、六堿基重復次數>3的微衛星長度標準，利用SciRoKo軟件在縊蟶轉錄組數據庫所有序列中篩選縊蟶微衛星序列，利用Primerf軟件在縊蟶微衛星序列的側翼序列設計引物；
[0009]2.縊蟶基因組DNA的提取步驟
[0010]取0.2g縊蟶外套膜組織于裂解液中，利用改良后的苯酚氯仿方法抽提DNA，用
0.8%的瓊脂糖膠電泳檢測；
[0011]3.微衛星引物的適用性擴增步驟
[0012]采用上述DNA為模板，進行PCR擴增，PCR擴增產物經1.2%瓊脂糖凝膠檢測，于凝膠成像系統下觀察并拍照記錄；
[0013]4.縊蟶適用性微衛星標記的鑒定步驟
[0014]檢測符合微衛星擴增效果的正向引物采用FAM熒光染料標記，之后進行PCR擴增，擴增產物采用ABI3730核酸分析儀檢測，并利用GeneMapper軟件(Applied Biosystems)進行基因型分析。[0015]在本發明的一個優選實施例中，所述步驟2)中，所述利用改良后的苯酚氯仿方法抽提DNA，具體如下:
[0016]A.取0.2g縊蟶外套膜組織，溶解于裂解液中，徹底裂解至澄清；
[0017]B.在裂解液中加入500uL苯酚，12000rpm離心20min ；
[0018]C.吸取上清液,加入500uL氯仿，12000rpm離心20min ；
[0019]D.吸取上清液,加入2倍體積預冷無水乙醇,靜置30min, 12000rpm離心20min ；
[0020]E.棄掉上清液，將DNA溶解于IOOuL無菌水中，_20°C保存備用。
[0021]在本發明的一個優選實施例中，所述步驟3)和4)所述PCR擴增具體如下:
[0022]PCR反應體系為25μ L，含I ΧΜΙΧ，上、下游引物各0.2 μ mol/dm3，模板DNA20ng ；PCR反應條件:94 V預變性3min，( 94 V變性30s，55 °C退火30s，72 °C延伸30s )進行30個循環，最后72°C延伸lOmin。
[0023]本發明中微衛星序列的來源，不同于微衛星的從頭開發技術，而是借助了高通量測序技術獲得的轉錄組數據庫，直接從數據庫中查找微衛星序列，可以快速獲得大量的微衛星序列；其次，本發明中DNA提取方案，在傳統的苯酚氯仿抽提法，進行適當簡化，節約了時間和成本，其提取結果可以用于后續微衛星引物的擴增。再次，本發明中微衛星的PCR擴增反應體系進行了簡化，直接采用PCR擴增混合液(mix)，減少了加樣步驟，尤其在進行大批量PCR擴增時，節約了大量時間；最后，本發明中微衛星的分型鑒定，不是采用傳統的聚丙烯酰胺凝膠電泳技術，而是采用ABI3730核酸分析儀檢測，精確度可達lbp，提高了準確性和精確性。
【具體實施方式】:
[0024]1.縊蟶微衛星序列的篩選
[0025]采集縊蟶外套膜，鰓，肝胰腺，水管，足和性腺6個組織，利用新一代454測序技術，獲得縊蟶轉錄組數據庫。按照兩堿基重復次數>6，三堿基重復次數>4，四、五、六堿基重復次數>3的微衛星長度標準，利用SciRoKo軟件在所有轉錄組序列中篩選微衛星序列。利用Primer3軟件在微衛星側翼序列設計引物。
[0026]2.縊蟶基因組DNA的提取。
[0027]取0.2g縊蟶外套膜組織，溶解于裂解液中，徹底裂解至澄清；在裂解液中加入500uL苯酹，12000rpm離心20min ;吸取上清液,加入500uL氯仿，12000rpm離心20min ;吸取上清液，加入1000uL預冷無水乙醇,靜置30min, 12000rpm離心20min ;棄掉上清液，將DNA溶解于IOOuL無菌水中，用0.8%的瓊脂糖膠電泳檢測。
[0028]3.微衛星引物的適用性擴增
[0029]采用上述DNA作為模板，篩選適用的微衛星引物。PCR反應體系為20 μ L，含1ΧΜΙΧ，上、下游引物各0.2 μ mol/dm3，模板DNA20ng ；PCR反應條件:94 °C預變性3min，(94°C變性30s，55。。退火30s，72。。延伸30s)進行30個循環，最后72°C延伸IOmin ;PCR擴增產物經1.2%瓊脂糖凝膠檢測，EB染色，于凝膠成像系統下觀察并拍照記錄。
[0030]4.縊蟶適用性微衛星標記的鑒定
[0031]將上述初步篩選適用的微衛星引物，將其正向引物進行FAM熒光染料標記，進行PCR擴增，擴增條件和反應體系同上，PCR反應產物采用ABI3730核酸分析儀檢測，用GeneMapper 軟件(Applied Biosystems)進行基因型分析。
【權利要求】
1.一種快速開發縊蟶微衛星分子標記的方法，其特征在于，包括以下步驟: 0.縊蟶微衛星序列的篩選步驟 利用新一代454測序技術獲得縊蟶轉錄組數據庫，按照兩堿基重復次數>6，三堿基重復次數>4，四、五、六堿基重復次數>3的微衛星長度標準，利用SciRoKo軟件在縊蟶轉錄組數據庫所有序列中篩選縊蟶微衛星序列，利用Primerf軟件在縊蟶微衛星序列的側翼序列設計引物； 2).縊蟶基因組DNA的提取步驟 取0.2g縊蟶外套膜組織于裂解液中，利用改良后的苯酚氯仿方法抽提DNA，用0.8%的瓊脂糖膠電泳檢測； 3).微衛星引物的適用性擴增步驟 采用上述DNA為模板，進行PCR擴增，PCR擴增產物經1.2%瓊脂糖凝膠檢測，于凝膠成像系統下觀察并拍照記錄； 4).縊蟶適用性微衛星標記的鑒定步驟 檢測符合微衛星擴增效果的正向引物采用FAM熒光染料標記，之后進行PCR擴增，擴增產物采用ABI3730核酸分析儀檢測，并利用GeneMapper軟件(Applied Biosystems)進行基因型分析。
2.如權利要求1所述的快速開發縊蟶微衛星分子標記的方法，其特征在于，所述步驟2)中，所述利用改良后的苯酚氯仿方法抽提DNA，具體如下: A.取0.2g縊蟶外套膜組織，溶解于裂解液中，徹底裂解至澄清； B.在裂解液中加入500uL苯酚，12000rpm離心20min； C.吸取上清液,加入500uL氯仿，12000rpm離心20min； D.吸取上清液，加入2倍體積預冷無水乙醇，靜置30min，12000rpm離心20min； E.棄掉上清液，將DNA溶解于IOOuL無菌水中，_20°C保存備用。
3.如權利要求1所述的快速開發縊蟶微衛星分子標記的方法，其特征在于，所述步驟3)和4)所述PCR擴增具體如下: PCR反應體系為25 4 1^，含1.MIX，上，下游引物各0.2 umol.dm ;PCR反應條件:94°C預變性3min，(94°C變性30s，55°C退火30s，72°C延伸30s)進行30個循環，最后 72°C延伸 IOmin0
【文檔編號】C12N15/10GK103509792SQ201310503959
【公開日】2014年1月15日 申請日期:2013年10月23日 優先權日:2013年10月23日
【發明者】牛東紅, 李家樂, 謝淑媚, 王劦, 趙弘剛 申請人:上海海洋大學