具有增強子作用的家蠶BmHel-8轉座子的制作方法
【專利摘要】本發明涉及的是一種來自家蠶的具有顯著增強下游基因表達的滾環式轉座子(BmHel-8)。該增強子由SEQ?ID?NO:1所示的核苷酸序列組成。本發明是通過生物信息學方法在家蠶基因組中鑒定獲得并通過雙熒光素酶報告基因檢測方法驗證其具有增強子的功能，該發明不但有助于獲取高豐度的目的蛋白推動家蠶生物反應器的發展而且有利于家蠶品種的改良。
【專利說明】具有增強子作用的家奮BmHel-8轉座子
【技術領域】
[0001]本發明涉及的生物【技術領域】，主要是家蠶轉基因生物反應器和品種改良領域。
【背景技術】
[0002]滾環式轉座子(Helitixm)最初是在模式生物擬南芥，水稻和線蟲基因組中被發現并且被歸類為DNA類轉座子(Kapitonov and Jurka2001)。但是Helitron轉座子的序列結構和轉座機制都與其它DNA類轉座子完全不同。在轉座機制上，由于完整的Helitron轉座子編碼的轉座酶包含復制起始(Rep)和解螺旋酶(Helicase)的保守基序，所以它們被認為是以滾環式機制進行轉座的并且偏向于插入到基因組的AT 二核苷酸內。在序列結構上，它們的5’端是以TC 二核苷酸起始，3’端是以CTRR(R代表A或G)四個核苷酸終止，并且在其3’端通常具有一個頸環結構(Mendiola et al.1994)。
[0003]近年許多研究表明Helitron轉座子廣泛的發布于高等真核生物基因組內，例如在線蟲中有超過2%，青蛙中超過0.5%，蝙蝠中大約3%，玉米中大約2%和果蠅中1-5%的基因組序列是由 Helitron 轉座子組成(Kapitonov and Jurka2001, Kapitonov2006, Prithamand Feschotte2007, Du et al.2009, Yang and Bennetzen2009)。雖然 Helitron 轉座子在許多真核生物中被報道，但是Helitron轉座子在鱗翅目昆蟲基因組中卻尚未報道。最近，我們用基于結構和同源性搜索相結合的方法對家蠶的全基因組Helitron轉座子進行了鑒定和注釋，結果發現家蠶基因組中具有21個Helitron轉座子家族(被命名為BmHel-1到BmHel-21)，約占整個 家族基因組序列的4.23%。
[0004]雖然近年許多物種的Helitron轉座子相繼被報道,但是對于Helitron轉座子的研究還仍停留在全基因組鑒定上。真核生物基因組中為什么會保留如此多的Helitron轉座子序列？究竟具有什么功能？仍鮮有報道。最近我們應用雙熒光素酶報告基因檢測系統發現家蠶的BmHel-8具有顯著地增加其下游基因表達的功能。

【發明內容】

[0005]本發明是利用生物信息學，分子和細胞生物學方法在家蠶中鑒定并證實了家蠶BmHel-8轉座子起到了增強子的作用。目的在于將該元件構建到表達載體或者轉基因載體中可以有效增加目的基因表達的效果。
[0006]本發明 申請人:利用生物信息學方法在家蠶基因組中鑒定了一個Helitron轉座子BmHel-8。應用PCR和TA克隆的方法在家蠶基因組中獲得了該轉座子的序列。測序驗證為我們的目的序列。然后將該轉座子分別連接到細胞轉染載體PGL3-Basic Vector載體的報告基因的5’端，再將這兩個載體分別進行家蠶的細胞(BmN)轉染實驗，結果證實了 BmHel-8轉座子具有增強子的作用。
[0007]這不但有助于原核或真核表達獲取高豐度的目的蛋白而且對家蠶生物反應器的發展也將起到推動作用。
[0008]本發明的家蠶增強子BmHel-8通過以下步驟獲得和證實:[0009](I)家蠶BmHel-8轉座子的鑒定:首先應用基于結構和同源性搜索相結合的方法在家蠶9倍基因組序列中進行Helitron轉座子序列的搜索。結果在家蠶基因組中鑒定出BmHel-8轉座子。該轉座子的一致序列(consensus sequence)長度421bp, 5’端以ATC三核苷酸起始，3’端以CTAGT五個核苷酸終止。進一步以BmHel-8的一致序列作為問詢序列，用BLASTN程序在家蠶9倍基因組數據庫中搜尋BmHel-8的同源序列(e值〈e—6，相似度>80%，序列長度>80bp)，最終發現BmHel-8轉座子家蠶基因組中具有14656個拷貝。
[0010](2)家蠶BmHel-8轉座子序列的獲得:以家蠶大造品系的基因組DNA為模板，BmHel-8轉座子的核苷酸序列設計特異性引物(上游引物為:5’ -GGTACCATCTATATATTAATACGTGAAGCA-3’ ；下游引物為:5，-CTCGAGACTAGAGGTCCCGCAGTAG-3，下劃線分別為限制性內切酶KpnI和XhoI酶切位點)進行PCR擴增，獲取目的條帶，PCR產物回收后與PMD-19-T載體連接轉化入大腸桿菌DH5 α感受態細胞，獲得陽性克隆后送往上海生工生物工程公司測序，測序結果表明擴增的序列與預期的結果一致。
[0011](3)將目的片段構建到細胞轉染載體
[0012]將含有目的片段(BmHel-8)的T克隆載體和細胞轉染載體pGL3_Basic Vector分別用限制性內切酶KpnI和XhoI進行雙酶切，分別回收目的片段和載體骨架，電泳檢測后，用DNA連接酶將目的片段BmHel-8與細胞轉染載體連接，并轉化大腸桿菌DH5 α感受態細胞，篩選獲得含有BmHel-8重組質粒的克隆，然后將擴大培養的菌液送往上海生工生物工程公司測序，測序結果與第一次測得的序列一致，獲得正確的克隆；
[0013](4)細胞轉染結果 [0014]將構建好的具有BmHel-8轉座子插入和沒有BmHel-8轉座子插入的細胞轉染載體分別與內參質粒和轉染試劑一同轉入家蠶的卵巢細胞系(BmN)內，轉染后的細胞27°C培養24~48個小時候后，用熒光素酶活性檢測儀來檢測這兩種報告基因的表達量。
[0015]本發明的優點是:
[0016]目前對于家蠶的研究已進入后基因組即功能基因組時代，根據已有的報道大量與家蠶抗性和絲蛋白產量相關的基因被鑒定。然而尋找到合適的增強子來增加這些基因在家蠶中的表達以期獲得抗病力強和高產繭絲的家蠶品種變得尤為迫切。所以我們發明的這一增強子不但有望推動家蠶優良品種的繁育而且可能對家蠶生物反應器的發展起到推動作用。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0017]圖1為雙熒光素酶報告基因檢測結果。
【具體實施方式】
[0018]實施例1:
[0019]家蠶BmHel-8轉座子的鑒定:應用基于結構和同源性搜索相結合的方法在家蠶9倍基因組序列中進行Helitron轉座子序列的搜索。結果在家蠶基因組中鑒定出BmHel-8轉座子。該轉座子的一致序列(consensus sequence)長度421bp (見SEQ ID NO:1)。
[0020]實施例2:
[0021]家蠶BmHel-8轉座子對下游基因表達增強作用的鑒定:為了探測BmHel-8是否對鄰近基因的表達具有調控作用，我們進行了雙熒光素酶報告基因轉染實驗。我們首先將家蠶的A3啟動子序列構建到螢火蟲熒光素酶報告基因載體(pGL3Basic Vector)的報告基因的5’端，然后再將BmHel-8的序列構建到A3啟動子的前面。然后將這個構建好的載體和內參載體(海腎熒光素酶報告基因)共轉染家蠶卵巢細胞(BmN)，轉染48小時后測酶活。結果發現當熒光素酶報告基因的5’ 端插入了 BmHel-8時，顯著的增加了報告基因的表達量(Ρ〈0.01)(見附圖1)。
【權利要求】
1.具有增強子作用的BmHel-8轉座子，其特征在于該轉座子是家蠶來源的，序列組成如 SEQ ID NO:1 所示。
2.根據權利要求1的增強子，其中所說的增強子來源于家蠶BmHel-8轉座子。
3.根據權利要求1或2，其中所說的家蠶是家蠶大造品系。
4.根據權利 要求1中的增強子BmHel-8轉座子在構建家蠶重組表達載體并提高外源或內源基因表達產物的產率中的應用。
【文檔編號】C12N15/85GK103923891SQ201410190464
【公開日】2014年7月16日 申請日期:2014年5月7日 優先權日:2014年5月7日
【發明者】張澤, 韓民錦 申請人:重慶大學