細胞培養微溝道中注入溶液的方法以及貼壁細胞培養方法

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細胞培養微溝道中注入溶液的方法以及貼壁細胞培養方法
【專利摘要】本發明提供了一種細胞培養微溝道中注入溶液的方法以及貼壁細胞培養方法。細胞培養溝道位于一微流控芯片中，包括：形成于微流控芯片內的微溝道本體；以及微溝道本體左右兩側的與外界相連通的液滴入口。該細胞培養微溝道中注入溶液的方法包括：用兩支移液槍吸取不同量的溶液，分別對準兩側的液滴入口，同時向細胞培養微溝道內注入溶液，在兩側液面差的作用下，溶液依靠重力作用流入微溝道本體內。本發明基于重力作用實現貼壁細胞的片上接種、培養和染色，只需要移液槍作為接種工具，更容易為廣大細胞生物學實驗室所接受。
【專利說明】細胞培養微溝道中注入溶液的方法以及貼壁細胞培養方法

【技術領域】
[0001] 本發明涉及微流控【技術領域】，尤其涉及一種細胞培養微溝道中注入溶液的方法以及貼壁細胞培養方法。

【背景技術】
[0002] 心血管疾病（cardiovascular disease,CVD)嚴重危害人類健康和生命，全世界每年約有1670萬人死于CVD，占全球死亡率第一位，而動脈粥樣硬化是CVD的重要病理基礎。在動脈粥樣硬化形成過程中，血管平滑肌細胞（vascular smooth muscle cells, VSMC)的增殖并向內膜遷移和合成細胞外基質則是"禍首"之一。因此研究VSMC細胞的致病機制是十分重要的。
[0003] 在VSMC細胞的機制研究中，細胞培養是基本實驗模型，通過一個能模擬體內環境的體外空間，配置以無菌、適當溫度、酸堿度和一定營養條件培養細胞，使之生長繁殖并維持其結構和功能。其目標就是在體外盡可能地控制細胞外微環境的一致又能保持實驗的簡單可重復性，進而提供大量細胞層面和分子層面的信息。因此VSMC細胞體外培養的研究是十分必要的。
[0004] VSMC細胞的體外培養始于20世紀70年代，由Ross和Campbell采用貼塊法獲得成功。現階段VSMC細胞的體外培養技術，仍停留在傳統的開放的瓶皿或孔板形式。
[0005] 微流控技術是本世紀一項重要的科學技術，由于其通道尺寸與哺乳類細胞線性尺寸相比擬，多維網絡結構與生理狀態下細胞的空間特征相接近，已被廣泛用于細胞生物學研究。在芯片上，一般用外圍的泵和連接導管對微尺度的流體進行操作和控制，使灌注系統中產生穩定的流場以滿足營養物質的傳輸和廢物的排泄。
[0006] 在實現本發明的過程中，申請人:發現現有技術VSMC細胞培養方法存在如下技術缺陷：
[0007] (1)現有的微流控細胞培養技術，導管要與注射泵相連實現流量的控制，使得許多不具有注射泵實驗條件的實驗室在操作技術上形成阻礙；
[0008] (2)現有的體外培養VSMC細胞環境，相對于體內血管壁的微小尺寸和營養物質的代謝形式，差異十分明顯，客觀上難以真實反映生理狀態VSMC細胞的生物學特征。因此需要能更好地模擬活體血管壁微環境的細胞培養裝置；
[0009] (3)現有的微流控細胞培養技術，需要連接導管進行細胞接種，存在細胞吸附導管壁，導致細胞接種不均勻；導管的存在有擾動、漏液等問題，導致細胞所處微環境不穩定，實驗一致性較差。

【發明內容】

[0010](一）要解決的技術問題
[0011] 鑒于上述技術問題，本發明提供了一種細胞培養微溝道中注入溶液的方法以及貼壁細胞培養方法。
[0012] (二）技術方案
[0013] 根據本發明的一個方面，提供了一種細胞培養微溝道中注入溶液的方法。該細胞培養溝道位于一微流控芯片中，包括：形成于微流控芯片內的微溝道本體；以及微溝道本體左右兩側的與外界相連通的液滴入口。該細胞培養微溝道中注入溶液的方法包括：步驟 B :用兩支移液槍吸取不同量的溶液，分別對準兩側的液滴入口，同時向細胞培養微溝道內注入溶液，在兩側液面差的作用下，溶液依靠重力作用流入微溝道本體內。
[0014] 根據本發明的另一個方面，還提供了一種貼壁細胞培養方法。該貼壁細胞培養方法包括：步驟A :提供包括若干條細胞培養微溝道的微流控芯片，其中，每一條細胞培養微溝道包括：形成于微流控芯片內的微溝道本體以及微溝道本體兩側的液滴入口；步驟B :對細胞培養微溝道進行表面修飾，以便于貼壁細胞的接種；步驟C :將吸壁細胞懸液用培養液調整至預設濃度，用兩支移液槍吸取不同量的吸壁細胞懸液，分別對準左右兩側的液滴入口，同時向細胞培養微溝道內注入吸壁細胞懸液，在兩側液面差的作用下，吸壁細胞懸液依靠重力作用流入微溝道本體內；以及步驟D :在細胞培養微溝道內對吸壁細胞進行培養，每間隔預設時間，用移液槍吸出每個液滴入口處的培養液，并用兩支移液槍在兩端的液滴入口同時滴入新鮮的培養液。
[0015] (三）有益效果
[0016] 從上述技術方案可以看出，本發明細胞培養微溝道中注入溶液的方法以及貼壁細胞培養方法具有以下有益效果：
[0017] (1)與已經報道需要的注射泵的微流控細胞培養方法相比，基于重力作用實現 VSMC細胞的片上接種、培養和染色，只需要移液槍作為接種工具，更容易為廣大細胞生物學實驗室所接受:；
[0018] (2)將微流控技術與傳統VSMC細胞的培養技術相結合，在微流控技術中實現襯底修飾、VSMC細胞的均勻片上培養和VSMC細胞染色，為VSMC細胞體外培養提供更接近生理環境的方法；
[0019] (3)與已經報道需要的導管的微流控細胞培養方法相比，基于重力作用實現細胞的片上接種與培養，由于沒有導管的擾動以及細胞吸附導管壁等問題，可以實現接種密度可控的微流控片上培養。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0020] 圖1為根據本發明實施例基于微流控技術的VSMC細胞培養方法的流程圖；
[0021] 圖2為圖1所示VSMC細胞培養方法中微流控芯片的示意圖；
[0022] 圖3為微流控芯片制作的流程圖；
[0023] 圖4為微流控芯片制作過程中器件的剖視圖；
[0024] 圖5為在細胞培養微溝道中形成修飾層的示意圖；
[0025] 圖6為細胞培養微溝道內細胞的分布情況；
[0026] 圖7為細胞培養微溝道內細胞的分布情況的統計分布；
[0027] 圖8為對細胞培養微溝道內細胞進行染色前后的細胞狀態顯微圖。

【具體實施方式】
[0028] 為使本發明的目的、技術方案和優點更加清楚明白，以下結合具體實施例，并參照附圖，對本發明進一步詳細說明。需要說明的是，在附圖或說明書描述中，相似或相同的部分都使用相同的圖號。附圖中未繪示或描述的實現方式，為所屬【技術領域】中普通技術人員所知的形式。另外，雖然本文可提供包含特定值的參數的示范，但應了解，參數無需確切等于相應的值，而是可在可接受的誤差容限或設計約束內近似于相應的值。實施例中提到的方向用語，例如"上"、"下"、"前"、"后"、"左"、"右"等，僅是參考附圖的方向。因此，使用的方向用語是用來說明并非用來限制本發明的保護范圍。
[0029] 本發明將微流控芯片技術與VSMC細胞的培養技術結合，在VSMC細胞體外微環境的重建上實現更好的模擬VSMC細胞體內生長的微環境。本發明還完全使用重力法完成片上培養VSMC細胞的過程。所謂重力法，就是在本發明中，使用移液槍直接向芯片滴入試劑，并且依靠重力作用使試劑流入細胞培養微溝道，也同樣使用移液槍取出廢液。
[0030] 一、第一實施例
[0031] 在本發明的一個示例性實施例中，提供了一種細胞培養微溝道中注入溶液的方法。
[0032] 該細胞培養溝道位于一微流控芯片中，包括：形成于微流控芯片內的微溝道本體；以及微溝道本體左右兩側的與外界相連通的液滴入口
[0033] 本實施例中，細胞培養微溝道中注入溶液的方法包括：
[0034] 步驟S102 :用一支移液槍吸取浸潤緩沖液，對準微溝道本體一側的液滴入口，向細胞培養微溝道內注入，是細胞培養微溝道完全被該浸潤緩沖液浸潤，而后靜置預設時間，以提高細胞培養微溝道的親水性；
[0035] 本步驟中，浸潤緩沖液為磷酸鹽緩沖液，預設時間至少為1小時。
[0036] 步驟S104 :用兩支移液槍吸取不同量的溶液，分別對準微溝道本體左右兩側的液滴入口，同時向細胞培養微溝道內注入溶液，在兩側液面差的作用下，溶液依靠重力作用流入微溝道本體內。
[0037] 本實施例中，其中一支移液槍吸取溶液的量為20 μ 1，另外一支移液槍吸取溶液的量為10μ 1或15μ 1。需要說明的是，兩支移液槍必須全部吸附溶液并向細胞培養溝道內注入，而不能只有一只移液槍吸取溶液。
[0038] 本實施例與已經報道需要的注射泵的微流控細胞培養方法相比，基于重力作用實現VSMC細胞的片上接種、培養和染色，只需要移液槍作為接種工具，更容易為廣大細胞生物學實驗室所接受。此外，本實施例與已經報道需要的導管的微流控細胞培養方法相比，基于重力作用實現細胞的片上接種與培養，由于沒有導管的擾動以及細胞吸附導管壁等問題，可以實現接種密度可控的微流控片上培養。
[0039] 至此，本實施例細胞培養微溝道中注入溶液的方法介紹完畢。
[0040] 二、第二實施例
[0041] 在本發明的另一個示例性實施例中，提供了一種基于微流控技術的VSMC細胞培養方法。圖1為根據本發明實施例基于微流控技術的VSMC細胞培養方法的流程圖。請參照圖1，本實施例微流控技術的VSMC細胞培養方法包括：
[0042] 步驟S202 :提供包括若干條細胞培養微溝道的微流控芯片，其中，每一條細胞培養微溝道包括：形成于微流控芯片內的微溝道本體以及微溝道本體兩側的液滴入口；
[0043] 圖2為圖1所示VSMC細胞培養方法中微流控芯片的示意圖。其中，A為俯視圖； B為縱剖面示意圖。請參照圖2,微流控芯片包括4個細胞培養微溝道。每個細胞培養微溝道的縱剖面呈U型結構。在細胞培養微溝道中，微溝道本體形成于微流控芯片中，呈為長方體形狀，微溝道本體兩端分別設置液滴入口，液滴入口為圓形。其中液滴入口的直徑大于微溝道本體的寬度。其中，微溝道的長度為lcm，高度為ΙΟΟμπι，寬度為800μπι。液滴入口的直徑是4mm，高度為2mm，其可以容納約20 μ L的溶液。
[0044] 其中，微流控芯片的制作流程包括SU 8-5種子層的制作和SU 8-2100陽模的制作，以及PDMS的澆注、翻模、打孔和與玻璃基底的鍵合，其流程圖如圖3 :
[0045] 子步驟S202a :光刻膠SU 8-5制作種子層；
[0046] 載玻片在丙酮、乙醇和去離子水中依次清洗，烘干后表面均勻旋轉涂敷一層 SU-85,曝光形成種子層，見圖4中A所不。
[0047] 子步驟S202b :光刻膠SU 8-2100制作陽模；
[0048] 種子層上再均勻旋轉涂敷一層SU 8-2100,放上掩模版曝光，如圖4中B所示；顯影、堅膜得到細胞培養微溝道陽模，見圖4中C所示。
[0049] 子步驟S202c :PDMS的澆注、翻模、打孔與鍵合；
[0050] 細胞培養微溝道陽模燒注聚二甲基娃氧燒（polydimethylsiloxane，PDMS)固化、翻模得到細胞培養微溝道的PDMS翻模，在細胞培養微溝道兩端打孔后，鍵合PDMS翻模與載玻片，VSMC細胞培養芯片的制作，見圖4中D、E、F所示。
[0051] 步驟S204 :對微流控芯片中細胞培養微溝道進行表面修飾，以便于后期VSMC細胞的接種；
[0052] 該步驟S204具體包括：
[0053] 子步驟S104a :對微流控芯片進行紫外光照射滅菌；
[0054] 子步驟S204b :用移液槍對準細胞培養微溝道一側的液滴入口，向其中注入磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered sal ine，PBS)，使細胞培養微溝道完全浸潤，而后靜置至少 1小時；
[0055] 為了保證后續加入其他試劑時，試劑會依靠重力作用流入溝道，本實施例中，加入 PBS后靜置至少1小時，使細胞培養微溝道內親水性能良好。
[0056] 子步驟S204c :用移液槍將液滴入口處的PBS緩沖液吸出；
[0057] 除液滴入口處的PBS緩沖液之外，微溝道本體內還會殘存部分的PBS緩沖液。
[0058] 子步驟S204d:用兩支移液槍同時吸取含有修飾分子的溶液，左側移液槍吸取 20 μ 1，右側移液槍吸取10 μ 1，分別對準細胞培養微溝道左右兩側的液滴入口，同時向細胞培養微溝道內注入溶液，如圖5中Α所示。
[0059] 本實施例中，特意將左側移液槍和右側移液槍注入液體的量設計為不同。從而細胞培養微溝道兩側存在液面差，溶液會依靠重力作用流入細胞培養微溝道，直至兩液滴入口液面平衡。
[0060] 子步驟S204e :根據實驗需要，靜置一段時間，使溶液中的修飾分子沉降于細胞培養微溝道底面，形成修飾層，如圖5中B所示；
[0061] 靜置時間需要根據修飾分子的類型和實驗需要進行設計。在靜置時間較長的情況下，該溶液會自動揮發。在靜置時間較短的情況下，需要將該溶液吸出。而如果液滴入口處和微溝道本體內的溶液全部風干，則需要重新執行子步驟S204b和S204c。
[0062] 子步驟S204f :用兩支移液槍同時吸取杜爾伯科改良伊戈爾培養基（Dulbecco Modified Eagle Medium，DMEM)溶液，左側移液槍吸取20 μ 1，右側移液槍吸取10 μ 1，分別對準細胞培養微溝道左右兩側的液滴入口，同時打出溶液，靜置至少1小時，而后吸出DMEM 溶液。
[0063] 該子步驟的目的是為后期VSMC細胞接種提供合適環境。
[0064] 步驟S206 :將VSMC細胞懸液調整濃度至106個/ml，用兩支移液槍同時吸取VSMC 細胞懸液，左側20 μ 1，右側15 μ 1，分別對準細胞培養微溝道左右兩側的液滴入口，同時向細胞培養微溝道內注入VSMC細胞懸液；
[0065] 其中，VSMC細胞懸液為將VSMC細胞用DMEM溶液稀釋后的懸液。
[0066] 值得注意的是，細胞接種至細胞培養微溝道以后，將芯片原地靜置約5min，待細胞培養微溝道內溶液穩定、細胞沉降，便可將芯片放于顯微鏡下觀察記錄接種的密度和均勻程度等情況。
[0067] 本發明技術中，在細胞培養微溝道的一側設置了位置標記，如圖6所示，方形小標記的數量代表細胞培養微溝道位置的序號。這不是必要的，但在這里可以清楚地分析細胞培養微溝道內細胞的分布情況。圖6中A、B、C依次為1號位置、5號位置和8號位置。本發明技術中，設計了 8個位置，經過統計，位置1?8的細胞密度（細胞個數/mm2) 依次為 105. 00±18· 09 ;100· 18±20· 79 ;94· 64±13· 74 ;100· 89±16· 99 ;91· 61±16· 34 ; 94. 64± 15. 88 ;91. 79±9. 73 ;89. 64±8. 15 ;全部結果均值為 96. 00± 16. 30 (統計中數據組數η彡3)。上述結果的柱狀圖見圖7 :
[0068] 步驟S208 :對VSMC細胞進行培養，每間隔12小時，就用移液槍吸出每個液滴入口處的DMEM，并用液滴在兩端的液滴入口同時滴入20 μ 1新鮮DMEM，為VSMC細胞提供必要的營養物質；
[0069] 同時加入相同液量DMEM的目的是消除細胞培養微溝道兩端液面差，保證細胞培養微溝道內沒有液體流動，即VSMC細胞不會被流體剪切力作用而影響生長。培養72小時后，細胞狀態顯微圖見圖8中A。
[0070] 步驟S210 :對細胞培養微溝道內的VSMC細胞進行α肌動蛋白的細胞免疫染色，其染色步驟與參數包括：
[0071] 染色子步驟S210a :4%多聚甲醒固定15min ;
[0072] 染色子步驟321013:用？85配置3%的過氧化氫封閉液,封閉151]^11 ;
[0073] 染色子步驟S210c :用PBS配置0. 3%的曲拉通X-100透膜液透膜15min ;
[0074] 染色子步驟S210d :用PBS配置10%山羊血清，37°C孵育60min ;
[0075] 染色子步驟 S210e :-抗：PBS = i : 100,37°C孵育一抗 60min ;
[0076] 染色子步驟S210f :37°C孵育二抗60min ;
[0077] 染色子步驟S210g :二氨基聯苯胺四鹽酸顯色5min。
[0078] 上述染色子步驟S110a-S110g，本實施例有以下兩點關鍵說明：
[0079] 其中，上述每一染色子步驟均依靠重力作用實現，每一染色子步驟換液時的方法為，先吸出液滴入口中所有溶液，再用左邊移液槍吸取目標溶液20 μ 1,右邊移液槍吸取目標溶液10 μ 1，同時滴入液滴入口。并且先加一次，允許溶液穩定2min，吸出液滴入口的溶液后再復加一次，其中染色子步驟S210e復加兩次，保證一抗濃度不被稀釋。
[0080] 除染色子步驟S210e之外，其他每一染色子步驟進行之前均用PBS溶液沖洗。其中染色子步驟S210f之前沖洗3次，其余沖洗2次。沖洗方法是用說明1中所述換液方法，每次沖洗靜置5min。
[0081] 本發明技術染色情況在圖8中B所示。免疫染色是細胞染色中較為復雜的染色方法，VSMC細胞在染色前和染色后形態上基本沒有變化，因此，本發明技術可以用在有關 VSMC細胞的其他很多種染色。
[0082] 至此，已經結合附圖對本實施例進行了詳細描述。依據以上描述，本領域技術人員應當對本發明基于微流控技術的VSMC細胞培養方法有了清楚的認識。
[0083] 此外，上述對各元件和方法的定義并不僅限于實施例中提到的各種具體結構、形狀或方式，本領域普通技術人員可對其進行簡單地更改或替換，例如：
[0084] (1)細胞培養微溝道不局限為矩形，可以替換為梯形、蛇形等雙入口結構；液滴入口也不局限于圓形，可以替換為正方形、三角形等。
[0085] (2)細胞接種的密度不局限于106個/ml，可以用任意實驗需求的細胞密度來代替。
[0086] (3)長時間VSMC細胞培養過程中，換液時間不局限于12小時，可以為實驗需要的任意時間間隔。
[0087] (4) VSMC細胞的染色可以用其他任何實驗需要的染色來代替α肌動蛋白的細胞免疫染色，如：鈣黃綠素熒光染色、增殖細胞核抗原免疫染色等；
[0088] (5)上述實施例均以VSMC細胞為例進行說明，但本發明并不以此為限，任何貼壁細胞，均可以采用第二實施例方式進行培養，此處不再重述。
[0089] 綜上所述，本發明將微流控技術與傳統貼壁細胞的培養技術相結合，在微流控技術中實現襯底修飾、VSMC的均勻片上培養和VSMC染色，為VSMC體外培養提供更接近生理環境的方法。尤其是，基于重力作用實現細胞的片上接種與培養，由于沒有導管的擾動以及細胞吸附導管壁等問題，可以實現接種密度可控的微流控片上培養。
[0090] 以上所述的具體實施例，對本發明的目的、技術方案和有益效果進行了進一步詳細說明，所應理解的是，以上所述僅為本發明的具體實施例而已，并不用于限制本發明，凡在本發明的精神和原則之內，所做的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發明的保護范圍之內。
【權利要求】
1. 一種細胞培養微溝道中注入溶液的方法，其特征在于：該細胞培養溝道位于一微流控芯片中，包括：形成于微流控芯片內的微溝道本體；以及微溝道本體左右兩側的與外界相連通的液滴入口；該細胞培養微溝道中注入溶液的方法包括：步驟B :用兩支移液槍吸取不同量的溶液，分別對準兩側的液滴入口，同時向細胞培養微溝道內注入溶液，在兩側液面差的作用下，溶液依靠重力作用流入微溝道本體內。
2. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述細胞培養微溝道呈U型結構；微溝道本體的縱剖面為矩形，液滴入口的橫切面為圓形，其中液滴入口的直徑大于微溝道本體的寬度。
3. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟B之前還包括：步驟A :用一支移液槍吸取浸潤緩沖液，對準微溝道本體一側的液滴入口，向細胞培養微溝道內注入浸潤緩沖液，使細胞培養微溝道完全被該浸潤緩沖液浸潤，而后靜置預設時間。
4. 根據權利要求2所述的方法，其特征在于，所述步驟B中，所述浸潤緩沖液為磷酸鹽緩沖液，所述預設時間至少為1小時。
5. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟B中，其中一支移液槍吸取溶液的量為20 μ 1，另外一支移液槍吸取溶液的量為10 μ 1或15 μ 1。
6. -種貼壁細胞培養方法，其特征在于，基于微流控技術，包括：步驟A :提供包括若干條細胞培養微溝道的微流控芯片，其中，每一條細胞培養微溝道包括：形成于微流控芯片內的微溝道本體以及微溝道本體兩側的液滴入口；步驟B :對細胞培養微溝道進行表面修飾，以便于貼壁細胞的接種；步驟C :將吸壁細胞懸液用培養液調整至預設濃度，用兩支移液槍吸取不同量的吸壁細胞懸液，分別對準左右兩側的液滴入口，同時向細胞培養微溝道內注入吸壁細胞懸液，在兩側液面差的作用下，吸壁細胞懸液依靠重力作用流入微溝道本體內；以及步驟D:在細胞培養微溝道內對吸壁細胞進行培養，每間隔預設時間，用移液槍吸出每個液滴入口處的培養液，并用兩支移液槍在兩端的液滴入口同時滴入新鮮的培養液。
7. 根據權利要求6所述的貼壁細胞培養方法，其特征在于，所述步驟B包括：子步驟B1 :對微流控芯片進行紫外光照射滅菌；子步驟B2 :用移液槍對準細胞培養微溝道一側的液滴入口，向其中注入磷酸鹽緩沖液，使細胞培養微溝道完全浸潤，而后靜置至少1小時；子步驟B3 :用移液槍將液滴入口處的磷酸鹽緩沖液吸出；子步驟Μ :用兩支移液槍吸取不同量的含有修飾分子的溶液，分別對準兩側的液滴入口，同時向細胞培養微溝道內注入含有修飾分子的溶液；子步驟Β5 :靜置預設時間，使溶液中的修飾分子沉降于細胞培養微溝道底面，形成修飾層；以及子步驟Β6 :用兩支移液槍吸取不同量的培養液，分別對準細胞培養微溝道左右兩側的液滴入口，同時注入培養液，靜置至少1小時，而后吸出培養液。
8. 根據權利要求6所述的貼壁細胞培養方法，其特征在于，所述貼壁細胞為VSMC細胞。
9. 根據權利要求8所述的貼壁細胞培養方法，其特征在于，所述步驟D之后還包括：步驟E，對細胞培養微溝道內的VSMC細胞進行α肌動蛋白的細胞免疫染色。
10.根據權利要求9所述的貼壁細胞培養方法，其特征在于，所述步驟Ε的染色步驟包括：用移液槍分別吸出液滴入口中所有溶液；用兩支移液槍吸取不同量的目標溶液，分別對準細胞培養微溝道左右兩側的液滴入口，同時向細胞培養微溝道內注入目標溶液。
【文檔編號】C12N5/077GK104099248SQ201410342000
【公開日】2014年10月15日申請日期:2014年7月17日優先權日:2014年7月17日
【發明者】陳健, 衛元晨, 陳峰, 張韜, 陳德勇, 賈鑫, 王軍波, 郭偉申請人:中國科學院電子學研究所

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