專利名稱：具有血管緊張素轉化酶抑制作用的肽的制作方法
技術領域：
本發明涉及用于制備血管緊張素轉化酶(ACE)抑制劑的某些特定肽，本發明還涉及有ACE抑制劑作用的食品和加工此類食品的方法。
背景技術：
高血壓被認為是引起心血管系統疾病(CVD)的主要危險因素之一，機體調節血壓的一個機理是通過腎素-血管緊張素系統來實現的。該系統通過級聯反應導致血管緊張素II的形成，血管緊張素II有強烈的收縮血管、從而增高血壓的效應。抑制該級聯反應中的關鍵酶之一血管緊張素I轉化酶(ACE)，減少血管緊張素II的形成，可起到降低血壓的作用。長期人體干預研究顯示，定期食入低劑量的ACE抑制劑可將心血管系統疾病降低25％(Gerstein等(2000)，The Lancet355，253-259)。
食品中含ACE抑制劑是眾所周知的，這樣的食品可通過對奶及其他奶制品進行發酵而制成。在一個安慰劑對照試驗中觀察到，酸奶中的VPP和IPP降低高血壓病人的血壓。(Hata，Y etal.(1966)，American Journal of Clinical Nutrition 64，767-771)一個已經上市的且宣稱“適用于輕度高血壓患者”的發酵奶制品是Calpis酸奶，經纖維二糖乳桿菌(Lactobacillus helveticus)和釀酒酵母(Saccharomyces cervisiae)發酵制成，由日本的Calpis Food Industry生產。另一個已經上市的發酵奶制品是Evolus，由芬蘭的Valio生產，號稱是“歐洲第一個有助于降低血壓的功能性食品”，經纖維二糖乳桿菌株發酵而成。該制品含有經體外證實有ACE抑制作用的生物活性肽(VPP和IPP)，這些肽由水解酪蛋白產生。
另一個在現有領域被認同的可能方法是用酶水解奶制品來生產含ACE抑制劑的食品，WO 01/85984描述了用胰蛋白酶水解乳清蛋白分離物來制備ACE抑制組合物的方法。
WO 02/19837描述了從有ACE抑制特性的乳清蛋白分離物中制備乳清蛋白水解物的方法，所用酶是中性蛋白酶。WO 02/19837的表1中列出了具有ACE抑制活性特征的肽，但沒有提及IPAVEK、IPAVE和IIAEK。
Pellegrini A等在Biochimica et Biophysica Acta-GeneralSubjects(2001)，1526(2)，第131-140頁中公開了肽片段IPAVEK有殺菌特性，但未報道此肽有ACE抑制活性。
Nagaoka，S等在Biochemical and Biophysical Communications(2001)281，11-17中公開了IIAEK有降低膽固醇作用，但也未提及其ACE抑制活性。
發明概述本發明的目的是要提供一種適合于抑制ACE的食品，進一步的目的是要提供一種具有抗高血壓作用的食品。另一個目的是要使該食品味道好，尤其是要降低苦味，另外還要使該食品的生產價格能夠被接受。還有一個目的是要使食品中含高濃度ACE抑制劑。本發明通過用5肽IIAEK、5肽IPAVF和/或6肽IPAVFK及其鹽來制備ACE抑制劑，部分達到了這些目的。
發明詳述單字母代碼常被用來表示氨基酸。IIAEK是β-乳球蛋白上第71-75位氨基酸，IPVAF是β-乳球蛋白上第78-82位氨基酸，IPVAFK是β-乳球蛋白上第78-83位氨基酸。
根據本發明，我們發現5肽IIAEK在人體腸道中是穩定的，而IPAVF和IPAVFK在人腸道中會被消化降解為具有ACE抑制作用的肽IPA。由此，5肽IIAEK、5肽IPAVF和/或6肽IPAVFK及其鹽是很合適的ACE抑制劑。最好這種ACE抑制劑能是一種功能性食品。Abubakar等在Journal of Sairy Science 81，3131-3138上撰文闡述了IPA在患有原發性高血壓的大鼠身上的抗高血壓作用，文章中顯示了IPA的ACE抑制作用。本發明中的食品正是具有抗高血壓作用的食品。
本發明提供的適合于抑制ACE的食品含有25mg/g或更多的IIAEK和/或5mg/g或更多的IPAVF和/或3mg/g或更多的IPAVFK。優選的食品應含有50mg/g或更多的IIAEK和/或10mg/g或更多的5肽IPAVF和/或6mg/g或更多的6肽IPAVFK。優選的食品是蛋白水解產物，更優選的是β-乳球蛋白的水解產物。
通過優化發酵或水解條件，具有生物活性的IIAEK、IPAVF和IPAVFK分子的生產可以達到最大化。熟練的技術人員要想使產品產量最大化，就應該知道怎樣調節加工過程中的各種參數，如水解時間、水解溫度、酶的類型和濃度等。
最好IIAEK、IPAVF和IPAVFK的摩爾產率能夠高。IIAEK的摩爾產率的定義為生產得到的IIAEK的摩爾量除以水解前原料中總β-乳球蛋白中IIAEK片段的摩爾量。IPAVF或IPAVFK的摩爾產率也通過同樣的計算獲得。注意IIAEK序列和IPAVFK序列存在于β-乳球蛋白中。
優選的IIAEK摩爾產率是90-100％；對IPAVF來說是30-100％，更優選的是50-100％，最優選的是80-100％；對IPAVFK來說是15-100％，更優選的是30-100％，最優選的是50-100％。
就水解物優化方法而言，需要了解活性肽前體的特性。然而在復雜的水解產物或發酵產物中，檢測和鑒別具有生物學活性的肽是一項很具挑戰性的工作。因為，通常在含有數千種肽的復雜樣品中，僅有幾個具有生物學活性的肽以相對低水平的存在。傳統的鑒定手段利用重復循環高效液相(HPLC)分離和生物化學評價，既耗時，又易使樣品活性喪失。現在所用的是在線聯接在HPLC分級分離系統上的連續流生物化學檢測系統，HPLC的柱流出液一部分被導入連續流的ACE生物化學檢測系統，另一部分被導向化學分析系統(質譜儀)。粗制水解產物經HPLC分離后，其化合物的生物學活性的經在線生物化學檢測系統檢測，并由質譜儀持續記錄其質譜信息。這樣，當某個肽經生物化學檢測系統檢出陽性信號時，其結構信息能立即獲得。
本發明中的食品被定義為適合于人體食入、加入了有效量的本發明β-乳球蛋白水解產物、從而獲得了明顯的ACE抑制效應的產品。
本發明的食品最好依據包含下列步驟的加工過程來制備(a)用酶水解的方法來水解含有β-乳球蛋白的乳清蛋白底物獲得乳清蛋白水解產物；(b)從乳清蛋白水解物中分離富含5肽IIAEK、5肽IPAVF和/或6肽IPAVFK的組分；(c)通過干燥從b)步驟得到的組分，獲得固體狀態的富含5肽IIAEK、5肽IPAVF和/或6肽IPAVFK的組分；(d)將從c)步驟得到富含5肽IIAEK、5肽IPAVF和/或6肽IPAVFK的固體用作食品生產中的食品成份。
酶水解步驟(a)可以是任何一種酶法處理乳清蛋白底物，導致β-乳球蛋白水解釋放出IPAVFK、IPAVF和IIAEK中的一種或多種肽的過程。
乳清蛋白底物可以是任何一種含有充足量的β-乳球蛋白的物質。合適的底物的實例為奶、乳清、乳清粉、乳清粉濃縮物、乳清粉分離物或β-乳球蛋白等，優選有高含量的β-乳球蛋白的底物，如乳清蛋白分離物(WPI)。
酶可以是任何一種能夠水解β-乳球蛋白從而導致IIAEK、IPAVF和/或IPAVFK中的一種或多種釋放出來的酶。優選的酶的實例是胰蛋白酶，更優選的酶是胰蛋白酶與糜蛋白酶的混合物。
分離步驟(b)(或濃縮步驟(b))可以用專業技術人員所知的任何一種方法來完成，例如過濾、離心或色譜分離以及將這些方法合并使用。優選的分離步驟(b)是用超濾(UF)和/或納米過濾(NF)的技術來實施的。過濾過程中使用的膜的孔徑及電荷可用來控制5肽IIAEK、5肽IPAVF和/或6肽IPAVFK的分離。Poilot等在Journal of MembraneScience 158(1999)105-114上報道了利用帶電荷的UF/NF膜分級分離乳清蛋白水解物的方法。WO 00/42066對電透析的方法有所描述。
干燥步驟(c)涉及到對從步驟(b)得到的組合物進行干燥，獲得富含5肽IIAEK、5肽IPAVF和/或6肽IPAVFK的過程，可用常規方法，如噴霧干燥或冷凍干燥的方法來完成該步驟。
從步驟(b)獲得的富含肽的組分在下面的文章中用ACE-組分表示，從步驟(c)獲得固體在后面的文章中用ACE-固體表示。該ACE-組分和/或ACE-固體可適于用作食品成份。
本發明的食品及其衍生食品可以被巴斯德消毒或滅菌。
本發明的食品可以是任何一種類型的食品，除食品本身外還可含有適當量的常用的其品成份，如香料、糖、水果、礦物質、維生素，穩定劑及增稠劑。
優選的食品含50-200mmol/kg K+和/或15-60mmol/kg Ca2+和/或6-25mmol/kg Mg2+；更優選的是含100-150mmol/kg K+和/或30-50mmol/kg Ca2+和/或10-25mmol/kg Mg2+；最優選的是含110-135mmol/kg K+和/或35-45kg mmol/kg Ca2+和/或13-20mmol/kg Mg2+。
優選的該食品類型為果汁類食品、乳制品、冰凍甜食類食品或涂抹醬/人造黃油等。這些優選食品類型將在下面舉例詳述。
·果汁類食品本發明中的果汁類食品例子有加入了ACE-固體和/或ACE-組分的柑橘鼠水果如桔子和葡萄柚汁、熱帶水果汁、香蕉汁、桃汁、梨汁和草莓汁。
·乳類制品本發明中的乳類制品實例有加入了ACE-固體和/或ACE-組分的牛奶、乳制涂抹醬、乳酪、牛奶飲料和酸奶。該類食品作為奶類飲料時，也可加入香精和其他添加劑。乳類制品也可通過將ACE-固體和/或ACE-組分加入水中或加入乳制品中而制得。
一個酸奶制品組合物的實例是約含50-80％重量的水、0.1-15％重量的ACE-固體、0-15％重量的乳清蛋白粉、0-15％重量的糖(例如蔗糖)、0.01-1％重量的酸奶培養物、0-20％重量的水果、0.05-5％重量的維生素和礦物質、0-2％重量的香精和0-5％重量的穩定劑(附型劑增稠劑或凝膠劑)。
典型的酸奶制品的大小可以為50-250克，通常是80-200克。
·冰凍甜食制品在本發明中，術語冰凍甜食包括了含冷凍甜食奶，如冰淇淋、凍酸奶、果汁飲料、雪糕、冰牛奶以及凍蛋奶凍、冰棍、grannitas和凍果泥。
在冰凍甜食中，優選的固體(如糖、脂肪和香料等)成份的重量比應是3％；更優選的固體成份重量比應是10-70％，例如40-70％。典型的冰淇淋含有0-20％重量的脂肪、0.1-20％重量的ACE-固體和甜味劑、0-10％重量的脫脂奶成份和選擇性成份，如乳化劑、穩定劑、防腐劑、調味成份、維生素、礦物質等，其余為水。典型的冰淇淋會充氣超過體積的20-200％，更確切的是40-200％，并被凍至-2至-200℃，更確切的是凍至-10至-30℃。冰淇淋通常還含有約0.1％重量的鈣。
·其他食品本發明中的其他食品可由專業人員根據常識，使用水解的β-乳球蛋白或水解的β-乳球蛋白衍生產物，如適當量的水解β-乳球蛋白干粉作為成份制備。這樣的食品實例有烘烤類食品、乳類食品和點心等。
最好食品是含油和水的乳劑，例如涂抹醬。油和水的乳劑在此定義為含有油和水的乳劑，包括水包油(O/W)乳劑和油包水(W/O)乳劑及更復雜的乳劑，如水包油包水(W/O/W/O/W)乳劑。這里定義的油包括脂肪。優選的食品是涂抹醬、冰凍甜食或調味汁。本發明中優選的涂抹醬含有30-90％重量的植物油。涂抹醬的pH值最好為4.2-6.0。
實施例實施例1材料和方法高分辨篩選-質譜檢測(HRS-MS)用Kiadis(Leiden，the Netherlands)公司開發的高分辨篩選系統對Davisco國際食品(Le Sueur，MN，USA)生產的一種水解乳清蛋白分離物BiozateTM進行ACE抑制活性分析。該系統由HPLC、檢測生物活性的連續流ACE生物檢測裝置和進行化學鑒別的質譜儀組成。該梯度HPLC系統由4個Agilent 1100系列的液相色譜(LC)泵(Walbronn，Germany)組成。其中兩個泵用于傳送進行色譜分離的溶液，另外兩個泵用于添加補充溶液(make-up)到柱流出液中，以調節并補償色譜分離過程中有機調節劑百分比和流速的變化。用于梯度色譜分離的水溶液和有機調節溶液分別由0％-95％的甲醇組成。與此類似，用作柱后補充溶液的水溶液及有機溶液由0％-35％的甲醇組成。所有溶液中均含有0.05％的三氟乙酸(TFA)。除非另有說明，色譜分離在室溫下進行，使用的色譜柱為Alltech Ultima型號、體積2.1*250mm、填充有5μm、100大小的顆粒的碳18(C18)柱(Alltech Amsterdam，theNetherlands)。通過分析柱的液體流速為200μl/min。柱后補償后保持液流總流速恒定在1ml/min，液流中含10％乙腈。樣品生物活性曲線用2-95％的甲醇/0.05三氟乙酸梯度進行。分析時使用400μl含0.5％Biozate溶液(W/V)。
通過三通管，梯度流出液以50μl/min的速度導入連續流生物檢測裝置。200μl/min的流速導入型號為Micromass QTOF-micro的質譜儀(Almere，The Netherlands)，750μl/min的流速導入廢液管。
在連續流生物檢測裝置中，樣品的ACE抑制作用是通過基于底物轉化模式的生物檢測試驗來檢測的。檢測的第一步，將從分析色譜柱洗脫出的化合物與目標蛋白ACE混合，并相互作用60秒鐘，第二步，將某種內源性淬滅(internally quenched)熒光底物，即abz-FRK(dnp)P-OH，加入以上混合物，使其與ACE相互作用120秒鐘。分別在320nm的激發波長和420nm的發射波長下持續監測熒光信號。展示出ACE抑制活性的化合物，酶底物的轉化速率會暫時降低，在生化讀出儀器上就會記錄到一個負峰。將熒光底物abz-FRK(DNP)P-OH(10μm)和酶溶液ACE(0.0375U/ml)，溶于pH7.5的200mM Tris，300mM NaCl，0.5％Tween的溶液中，分別轉入Pharmacia公司出品的50ml進樣環(superloop)(Uppsala Sweden)。置兩個進樣環于4℃的Spark Mistral恒溫箱(Emmen，The Netherlands)中。將Agilent1100系列的液相色譜泵與進樣環連接，以25μl/min的速流替換生物試劑。親合反應在開放管狀的、盤繞的、內徑0.5mm的聚四氟乙烯(PTEE)反應圈內進行。反應圈放置于溫度為50℃的Shimadzu CTO10A vp恒溫箱中(Den Bosch，The Netherlands)。其熒光信號用Agilent1100系列的熒光檢測儀(Waldbronn，Germany)檢測。部分色譜柱流出液被導入OTOF micro MS質譜儀，質譜儀設定為電噴霧電離(ESI)正離子全掃描模式(EIS posivive ion full scan)。其去溶劑的溫度和離子源的溫度分別為300和80℃。毛細管，樣品錐(cone)和提取電壓設為3000、50和2.5伏。樣品錐和去溶劑氣流速度相當于50和450l/hr。在此種條件下，大多數的肽顯示出相當程度地片段化，有利用結構的解析。咖啡因作為鎖定質量完成準確質量測定，以10μl/min的流速持續輸入。每天用稀釋的磷酸溶液校正質譜儀。Biozate樣品中的IIAEK、IPAVF和IPAVFK的定量用Micromass Quattro II MS質譜儀完成，質譜儀設置為正電噴霧模式，多反應檢測模式。所用HPLC方法和上面描述的一樣。MS(ESI+)參數如下樣品錐電壓37V，毛細管電壓4KV，干燥氮氣流速300L/hr。離子源溫度和噴霧器溫度分別為100℃和250℃。合成的肽用于制備校正線；IIAEK的母離子573.4，最大的子離子分別是227.2和347.2；IPAVF的母離子546.3，最大的子離子分別是282.2和433.1；IPAVFK的母離子674.4，最大的子離子分別是282.2和501.2。
體外胃腸道消化試驗為考察這些肽在人體胃腸道的穩定性，模擬了一個典型胃和小腸的條件來對BiozateTM進行研究，將5.0g BiozateTM、2.1g NaCl，0.1gNaH2PO4、0.45g脂肪酶和2.9g胃蛋白酶溶于900ml純凈水(Millipore Q水)中，用HCl調節pH至3.5，然后在37℃溫度條件下用槳攪拌(50轉/分)60分鐘，模擬胃內條件。繼之，將9.0g胰蛋白酶加入到模擬胃液中，用NaHCO3將pH上調到6.8，在37℃的溫度條件下繼續攪拌(50轉/分)120分鐘，模擬小腸液。在此體外胃腸消化過程中，按不同時間點采集樣品。收集到的樣品直接在95℃加熱30分鐘后放-20℃凍存。
IIAEK、IPAVF和IPAVFK的ACE抑制活性測定IIAEK、IPAVF(K)的ACE抑制活性采用了經過某些改良的、Araujo等(2000)的方法來測定。ACE作用于熒光底物(Abz-FRK(Dnp)P-OH)的活性檢測在含有100mM NaCl，pH7.0的0.1M Tris緩沖液中進行。向白色透明的96孔板((Packerd Bioscience)各反應孔中加入150μl 3.75μM的底物、20μl 0.00625U/ml的ACE及40μl肽樣品。用帶2個分液器的Fluostar熒光檢測儀(BMG)測定激發波長320nm處和發射波長420nm處的熒光來連續追蹤ACE活性。作為標準使用的卡托普利(終濃度為1nM)抑制30％的ACE活性。
結果和討論水解樣品的高分辨篩選-質譜(HRS-MS)分析結果顯示，BiozateTM所含的ACE抑制效果的重要肽有IIAEK(β-乳球蛋白第71-75位氨基酸)、IPAVF和IPAVFK(β-乳球蛋白第78-73位氨基酸)，其濃度分別為18.2、4.1和2.31mg/g。測得的IIAEK、IPAVF和IPAVFK的IC50(50％抑制濃度)分別是20、300和120μM。
眾所周知，奶蛋白和奶蛋白水解物中含有大量的具有ACE抑制活性的肽前體。被食入后，這些蛋白在人胃腸道經過各種消化酶解過程，在體內釋放出具有ACE抑制活性的肽。為了評價被食入后這些已鑒別肽的降解以及新的活性肽的形成，在人造的典型人體胃腸道的條件下對BiozateTM進行研究。按一定時間點從該胃腸道模型系統采樣。樣品用在線HPLC生物檢測-質譜系統(HPLC-Bioassay-MS)或高分辨篩選-質譜系統(HRS-MS)進行分析(表1)。結果顯示，IIAEK是一個非常重要的肽，因為它對胃腸道消化有很強的抗性，因此是非常有潛力的降血壓的肽。IPAVF和IPAVFK是活性肽IPA的重要前體。IPA的IC50為50μM。從文獻得知，IPA在患原發性高血壓的大鼠體內有抗高血壓作用(Abubadar等，1998)表1.實施例1結果。BiozateTM經人工胃腸道系統消化后得到的IIAEK、IPAVF、IPAVFK和IPA濃度(mg/L)
參考文獻Araujo，M.C.，Melo，R.L.，Cesari，M.H.，Juliano，M.A.，Juliano，L.，Carmona，A.K.(2000)Peptidase specificity characterization of C- and N-terminalCatalytic sites of Angiotensin I-converting enzyme.Biochemistry398519-852權利要求
1.5肽IIAEK、5肽IPAVF和/或6肽IPAVFK及其鹽在制備血管緊張素轉化酶抑制劑上的用途。
2.權利要求1的用途，其中所述血管緊張素轉化酶抑制劑是功能性食品。
3.權利要求1或2的用途，其中所述肽是IPAVFK，并用于制備抗菌產品。
4.權利要求1-3中任一項的用途，其中所述肽是IIAEK，并用于制備高膽固醇產品。
5.適于抑制血管緊張素轉化酶的食品，所述食品包含25mg/g或更多量的IIAEK，和/或5mg/g或更多量的5肽IPAVF，和/或3mg/g或更多量的6肽IPAVFK。
6.權利要求5的食品，其中IIAEK的量為50mg/g或更多，和/或5肽IPAVF的量為10mg/g或更多，和/或6肽IPAVFK的量為6mg/g或更多。
7.權利要求5或6的食品的制備方法，所述方法涉及下述步驟a)含有β-乳球蛋白的乳清蛋白底物經酶水解形成乳清蛋白水解產物；b)從乳清蛋白水解產物分離出富含5肽IIAEK、5肽IPAVF和/或6肽IPAVFK的組分；c)將從b)步驟獲得的組分進行干燥，得到富含5肽IIAEK、5肽IPAVF和/或6肽IPAVFK的固體；d)將c)步驟中制備的固體用作食品制備中的成份。
8.權利要求7的方法，其中用于酶解的酶是胰蛋白酶。
9.權利要求8的方法，其中用于酶解的酶是胰蛋白酶和糜蛋白酶的混合物。
全文摘要
5肽IIAEK、5肽IPAVF和6肽IPAVFK及其鹽在制備血管緊張素轉化酶抑制劑上的用途。
文檔編號A61K38/01GK1784146SQ200480011858
公開日2006年6月7日 申請日期2004年4月23日 優先權日2003年5月5日
發明者J·G·M·詹森, J·沙克 申請人:荷蘭聯合利華有限公司