專利名稱：一種人工脂質體的制備方法
技術領域：
本發明屬于藥學領域，涉及一種蛋白質藥物脂質體的制備方法，具體涉及一種人工脂質體的制備方法。
背景技術：
由于脂質體獨特的物理、生理和藥理特征，如具有備整合親水性和疏水性藥物能力、生物適應性好、毒性低、無免疫系統響應及其在作用位點活性藥物的靶向緩釋能力等， 因此，作為治療型或診斷型活性試劑，脂質體載體的研究一直以來得到廣泛的關注。自從發現脂質體以來，其產品的大小能夠從微米到納米有效地控制；部分載體系統通過表面改性后與多肽、蛋白質和抗體進行了功能性整合。目前，FDA機構已經批準如阿米卡星/HSPC/ CH/DSPG，胞壁酰二肽/DSPC/PS (1:1)等25種以上的脂質體劑型藥物在臨床試驗，部分藥品已進入臨床應用階段。脂質體的制備技術主要采取以下4種途徑水相攪拌、超聲技術(探頭超聲和水浴超聲分散技術)、反向蒸發技術以及冷凍脫水干燥技術。脂質體藥物為兼具親水基團和疏水基團的產品，分別通過以下4種不同的途徑對靶向細胞發揮作用網狀內皮組織中巨噬細胞和嗜中性粒細胞的內吞作用、藥物與細胞表面弱的疏水性(或靜電)等非選擇性作用以及藥物和細胞表面組分的選擇性作用、磷脂雙分子層插入血清細胞膜并釋放到細胞質中、月旨質體轉移到細胞內膜或亞細胞器膜中。在以上情況中，較難判斷競爭性優勢的作用途徑，同時對于1種以上的協同作用過程目前尚未清楚。對于治療型和診斷型脂質體藥物，盡管開展了廣泛深入的研究工作。然而，在具體藥品的開發應用中，脂質體仍存在明顯的不足。例如，網狀內皮組織細胞對脂質體的生物降解速率很快，導致活性藥物組分很難達到穩定、持久的緩釋和傳遞功效。為了克服以上的不足，在脂質體藥物的構建中成功采用了 2類聚合材料的改性方法通過親水性聚合材料如聚乙烯乙二醇(PEG)對現有的脂質體表面進行修飾；此外，可將預包裹的載藥脂質體整合到聚合物基質系統中，從而有效控制脂質體藥物的緩釋和傳遞。然而，在預包裹載藥脂質體與聚合基質的復合構建中，涉及的學科范圍廣泛同時技術要求嚴格，需要藥學、生物材料科學、化學、分子及細胞生物學相關的研究人員通力合作才能實現。脂質體藥物體系具有穩定性差、藥物半衰期短和體內藥物清除速率快等不足，使用親水性聚合材料改性后能夠明顯改善脂質體的藥理特性。這種方法兼具了載藥脂質體和包裹基質材料的優點，藥物的穩定性提高，同時持久的藥物傳遞能力增強。然而，使用親水性聚合材料的最大缺點在于生物適應性差。為實現載藥脂質體與聚合材料的復合構建，須將脂質體暴露在有機溶劑并進行熱超聲，導致藥物的生物活性明顯下降。當前，脂質體的構建耦合聚合基質的包裹技術是國內外制藥行業的研究熱點。這種研究不僅有望提高藥物穩定性和持久的緩釋控制，維持體內藥物水平和延長用藥的時間間隔，減小藥物對腸胃道等組織的毒副作用；同時有望高效保留藥物活力，保證臨床的治療效果。為此，構建并開發了不同的技術用來將載藥脂質體包裹進聚合性骨架結構中。總體來看，這種研究仍處于基礎的探索階段，距離臨床的成功應用仍有大量的技術難題等待解決。對現有脂質體載體的改性進行技術革新是制藥行業的另一個研究熱點。磷脂類 (PC)脂質體在國內外的報道已有很多，但PC如蛋黃卵磷脂(EPC)或大豆卵磷脂(SPC)具有構型多變(錐形和圓柱形異構)導致形成的載藥脂質體的穩定性較低。在常見的口服或靜脈滴注等給藥途徑中，盡管脂質體藥物的藥效高，但體液生理條件如酶催化使得載體的穩定性差，直接導致了藥物水平的維持和清除時間很短(通常維持數小時)，因此在臨床中需要持續給藥。專利申請人曾將EPC和SPC分別與無機離子進行雜交，得到了穩定性好、生物適應性高、等電點適中、分離和純化過程簡單且不溶的膠束納米材料(參見專利 CN102107131A)。相對于其他的脂質體系統，載體材料的制備具有條件十分溫和、工藝流程簡單等優點，產品分散性高、粒度小(約5nm，與蛋白質和藥物分子的幾何尺寸具有相同數量級)且分布均勻。蛋黃卵磷脂鋯Ur (EPC) 2)和大豆卵磷脂鋯Ur (SPC) 2)作為脂質體載體，具有以下的優點1.脂質體制備條件非常溫和，避免采用有機溶劑和熱超聲，有效地預防了蛋白質分子的構型變化和活力下降；2.脂質體藥物與基質、底物的分離過程簡單，離心和洗滌操作可方便地實現了脂質體納米顆粒的純化；3.穩定性高和機械強度適中的載體是保證脂質體藥物對于溶劑和加熱等條件維持穩定的前提；4.載體對蛋白質藥物的吸附容量大， 且通過條件選擇可進行人為控制；5.載體與蛋白質的幾何尺寸相似，吸附動力學同時兼具主動和被動2個過程，產品的制備周期短。為實現藥物的有效傳遞和安全使用，使用脂質體構建耦合聚合物骨架包裹技術開發新型緩釋藥物具有非常重要的意義。盡管脂質體技術適用于活性藥物的緩釋和傳遞等代謝動力學，然而廣泛應用在藥劑學時仍然有明顯的不足，主要集中在脂質體藥物的藥效和生物適應性二個方面。具體表現為血漿半衰期短、穩定性差、活力下降、毒副作用強和長期的緩釋和傳遞控制能力低等。聚合材料的表面改性或復合包裹技術能夠克服脂質體藥物的部分缺點；但是，一方面加劇了包裹藥物的構型轉變(如蛋白質藥物的熔融和纖維化)以及活力下降，另一方面對機體組織的細胞造成了一定的代謝負荷。此外，聚合骨架復合包裹的技術要求極高，需要相關的多學科研究人員通力協作才有可能實現。在為數不多的研究報道中，改性或包裹的脂質體產品的制備工藝繁雜、條件苛刻且工藝周期長。

發明內容
本發明的目的是提供一種人工脂質體的制備方法。本發明是通過以下技術方案實現的
一種人工脂質體的制備方法，以納米球形顆粒的蛋黃卵磷脂鋯& (EPC)2或者大豆卵磷脂鋯&(SPC)2作為載體，以苦瓜蛋白MAP30、首烏蛋白GAP31、脂肪酶CRL、或者牛血清白蛋白BSA作為包裹蛋白，其中載體與包裹蛋白的質量比為74. 3-77. 7:22. 3-25. 7，制備時， 在蛋黃卵磷脂鋯ττ (EPC) 2或者大豆卵磷脂鋯ττ (SPC) 2的載體材料中加入磷酸鹽緩沖溶液， 在溫度為4°C，轉速為3500rpm的條件下攪拌得到無色、透明的分散液，將包裹蛋白溶解在磷酸鹽緩沖溶液中，然后緩慢滴加至分散液液中，在低溫條件下快速攪拌至形成穩定的脂質體，離心分離出蛋白質后反復洗滌并離心，經低溫冷凍干燥得固體產品，固體產品低溫保存或無菌生理鹽水封存后置于低溫條件下儲藏，即得成品。
進一步地，所述的載體與包裹蛋白的質量比為75-77:23-25。蛋黃卵磷脂鋯(ττ (EPC) 2)和大豆卵磷脂鋯(& (SPC) 2)作為脂質體載體，具有以下的優點1.脂質體制備條件非常溫和，避免采用有機溶劑和熱超聲，有效地預防了蛋白質分子的構型變化和活力下降；2.脂質體藥物與基質、底物的分離過程簡單，離心和洗滌操作可方便地實現了脂質體納米顆粒的純化；3.穩定性高和機械強度適中的載體是保證脂質體藥物對于溶劑和加熱等條件維持穩定的前提；4.載體對蛋白質藥物的吸附容量大，且通過條件選擇可進行人為控制；5.載體與蛋白質的幾何尺寸相似，吸附動力學同時兼具主動和被動2個過程，產品的制備周期短。脂質體包裹的蛋白質分別選擇治療型天然植物藥物、脂肪水解酶和免疫診斷試齊U，天然植物蛋白質粗提物分別來自苦瓜種籽和何首烏，為核糖體失活I-型的抗癌藥物； 脂肪酶用于水解血液中膽固醇、甘油酯和非游離脂肪酸。本發明免使用水溶性聚合骨架的包裹基質，在脂質體制備中未使用任何有機溶劑、未進行超聲處理等工藝條件，構建這種藥物脂質體具有重要的臨床、醫學意義，具有廣泛的開發應用價值。脂質體的制備方法采取水相懸浮吸附技術，在低溫和攪拌條件下制得人工產品， 載體粒度約為5nm，和蛋白質大小具有相同的數量級。載體粒度小，導致脂質體中蛋白含量大；同時，制備過程中存在主動和被動2種吸附作用。制備過程在一定的吸附動力學條件下實施，設計考察工藝，正交篩選并優化動力學的影響因子。一方面有利于獲得組成穩定、蛋白質含量高的脂質體產品；另一方面，有利于考察影響蛋白質藥物緩釋的具體因素。脂質體藥物在進入體液環境后，鹽度、PH和脂質體(蛋白質)濃度的梯度變化，藥物進行有效釋放和傳遞。其中，蛋白質分子的釋放過程呈現主動擴散的特性；同時，穩定的生理酶催化條件有效地促進載體材料的降解，藥物釋放同時具有侵蝕的擴散特性。本發明方法具有工藝簡單、條件溫和、重復性高等特點，采用的載體類型為蛋黃卵磷脂鋯^"(EPC)2或者大豆卵磷脂鋯^(SPC)2的納米球形顆粒，制備的重復性好且粒度分布均勻，載體對蛋白質藥物、酶分子有很高的吸附容量，脂質體中蛋白質含量高達 22. 3-25. 7%，比常見人工脂質體的蛋白包裹效率高1-2個數量級，采用如附圖1的構型吸附，蛋白質分子均勻分布在聚合載體的疏水性特殊區域，避免形成蛋白質團聚結構，這種定位、有序構型分布有利于提高蛋白質的生物可利用度；脂質體結構穩定、結合牢固，其穩定儲藏時間長達6-10個月，對熱的耐受性溫度高達60-80°C。


圖1為人工脂質體復合物的構型示意圖2為苦瓜蛋白質藥物MAP30在蛋黃卵磷脂鋯(Zr (EPC)2)納米載體的吸附動力學實驗
結果；
圖3為苦瓜蛋白質藥物MAP30在大豆卵磷脂鋯(Zr(SPC)2)納米載體的吸附動力學實驗
結果；
圖4為首烏蛋白質藥物GAP31在蛋黃卵磷脂鋯(Zr (EPC)2)納米載體的吸附動力學實驗
結果；
圖5為首烏蛋白質藥物GAP31在大豆卵磷脂鋯(Zr(SPC)2)納米載體的吸附動力學實驗結果；
圖6為脂肪酶Candida Rugosa Lipase (CRL)在蛋黃卵磷脂鋯(Zr (EPC) 2)納米載體的吸附動力學實驗結果；
圖7為脂肪酶Candida Rugosa Lipase (CRL)在大豆卵磷脂鋯(Zr (SPC) 2)納米載體的吸附動力學實驗結果；
圖8為牛血清白蛋白(BSA)在蛋黃卵磷脂鋯(Zr (EPC)2)納米載體的吸附動力學實驗結
果；
圖9為牛血清白蛋白(BSA)在大豆卵磷脂鋯(Zr (SPC)2)納米載體的吸附動力學實驗結^ ο實施例1
制備苦瓜蛋白MAP30與蛋黃卵磷脂鋯& (EPC)2的復合脂質體苦瓜蛋白(來自種子)粗提物，經SDS-PAGE凝膠電泳確認分子量為30 kDa，準確稱量6. 8 mg MAP30溶解在1. 0 ml 磷酸鹽緩沖液(pH 7.2，10 mM + 100 mM NaCl)中保存備用；蛋黃卵磷脂鋯納米載體(5nm， 球形顆粒)依專利(CN102107131A)中方法制備。準確稱量201. 6 μg & (EPC) 2顆粒載體，力口入1.49 ml磷酸鹽緩沖液(pH 7. 2)，在4 °C條件下高速攪拌(3500 rpm)至載體完全懸浮分散，再加入0.01 ml MAP30 蛋白儲備液，分別攪拌0. 5,1. 0,4. 0,7. 0,10. 0,12. 0,15. 0,18. 0、 20. 0和24. 0小時，高速離心(12000 rpm)20min后分離上清液。固體顆粒使用0. Iml磷酸鹽緩沖溶液洗滌后離心，重復3次，合并上清液測定殘余蛋白質量，確定最佳吸附時間。準確稱量201. 6 μg Zr (EPC) 2顆粒載體，分別加入1. 49 ml不同pH磷酸鹽緩沖液 CpH 5. 00,5. 49,5. 89,6. 39,6. 92,7. 56,8. 06,8. 52,9. 02 和 9. 90)，在 4 0C 條件下高速攪拌 (3500 rpm)至載體完全懸浮分散，再加入0.01 ml MAP30蛋白儲備液，攪拌15. 0小時，高速離心(12000 rpm)20min后分離上清液。固體顆粒使用0. Iml相應pH磷酸鹽緩沖溶液洗滌后離心，重復3次，合并上清液測定殘余蛋白質量，確定最佳吸附酸度。分別稱量12. 6,37. 8,63. 0,75. 6,100. 8,126. 0,138. 6,165. 0,189. 0,201. 6,226. 8 和252.0 μg Zr (EPC)2顆粒載體，加入1.49 ml磷酸鹽緩沖溶液(pH 8. 52)，在4 °C條件下高速攪拌(3500 rpm)至載體完全懸浮分散，再加入0.01 ml MAP30蛋白儲備液，攪拌15. 0 小時，高速離心(12000 rpm) 20min后分離上清液。固體顆粒使用0. Iml磷酸鹽緩沖溶液 CpH 8. 52)洗滌后離心，重復3次，合并上清液測定殘余蛋白質量，計算蛋白質吸附容量。實例1人工脂質體產品
冷凍干燥3天得產品白色粉末，不溶于水和極性有機溶劑；最大蛋白質含量對應的吸附時間為15小時，最佳pH 8. 52，蛋白質的最大百分含量M.0 士 1. 0% ；在注射生理鹽水和磷酸鹽緩沖液中分散后得無色透明懸浮液；固相條件下，蛋白質熱脫附溫度為80 0C (5小時以內)；在模擬體外的生理條件下，脂質體穩定(蛋白質脫附率< 5%)的時間達9個月； 用于核糖體失活型高效抗癌藥物穩定劑型的構建和開發，能夠用于如I-型HIV的治療。圖2為苦瓜蛋白質藥物MAP30在蛋黃卵磷脂鋯(Zr (EPC)2)納米載體的吸附動力學實驗結果；其中實驗條件T= 4 °C，攪拌速率3500 rpm，攪拌時間15 h，和磷酸鹽緩沖溶液(pH 8.52，10mM)。Ce和X分別表示上清液蛋白質殘余濃度和蛋白吸附量占總蛋白量的比例。實施例2制備苦瓜蛋白MAP30與大豆卵磷脂鋯& (SPC)2的復合脂質體準確稱量苦瓜蛋白6. 8 mg溶解在1. 0 ml磷酸鹽緩沖液(pH 7. 2，10 mM + 100 mM NaCl)中保存備用；大豆卵磷脂鋯納米載體(5nm，球形顆粒)依專利(CN102107131A)中方法制備。準確稱量201. 6 μg &(SPC)2顆粒載體，加入1.49 ml磷酸鹽緩沖液(pH 7. 2)，在4 °C條件下高速攪拌(3500 rpm)至載體完全懸浮分散，再加入0. 01 ml MAP30蛋白儲備液，分別攪拌0. 5,1. 0,4. 0,7. 0、 10. 0,12. 0,15. 0,18. 0,20. 0 和 24. 0 小時，高速離心(12000 rpm) 20min 后分離上清液。固體顆粒使用0. Iml磷酸鹽緩沖溶液洗滌后離心，重復3次，合并上清液測定殘余蛋白質量， 確定最佳吸附時間。準確稱量201. 6 Pg &(SPC)2 顆粒載體，分別加入 pH 為 5. 00、5. 49、5. 89、6. 39、 6. 92,7. 56,8. 06,8. 52,9. 02和9. 90磷酸鹽緩沖液(1. 49 ml),在4 °C條件下高速攪拌 (3500 rpm)至載體完全懸浮分散，再加入0.01 ml MAP30蛋白儲備液，攪拌15. 0小時，高速離心(12000 rpm)20min后分離上清液。固體顆粒使用0. Iml相應pH磷酸鹽緩沖溶液洗滌后離心，重復3次，合并上清液測定殘余蛋白質量，確定最佳吸附酸度。分別稱量12. 6,37. 8,63. 0,75. 6,100. 8,126. 0,138. 6,165. 0,189. 0,201. 6,226. 8 和252.0 μg Zr (SPC)2顆粒載體，加入1.49 ml磷酸鹽緩沖溶液(pH 9. 02)，在4 °C條件下高速攪拌(3500 rpm)至載體完全懸浮分散，再加入0.01 ml MAP30蛋白儲備液，攪拌15. 0 小時，高速離心(12000 rpm) 20min后分離上清液。固體顆粒使用0. Iml磷酸鹽緩沖溶液 CpH 9. 02)洗滌后離心，重復3次，合并上清液測定殘余蛋白質量，計算蛋白質吸附容量。實例2人工脂質體產品
冷凍干燥3天得產品白色粉末，不溶于水和極性有機溶劑；產品中蛋白質吸附最大的時間為15小時，最佳pH 9. 02，蛋白質的最大百分含量對.4 士 1. 2% ；在注射生理鹽水和磷酸鹽緩沖液中分散后得無色透明懸浮液；固相條件下，蛋白質熱脫附溫度為72 0C (5小時以內)；在模擬體外的生理條件下，脂質體穩定(蛋白質脫附率彡5%)的時間達6個月；用于核糖體失活型高效抗癌藥物穩定劑型的構建和開發，用于I-型HIV的治療。附圖3為苦瓜蛋白質藥物MAP30在大豆卵磷脂鋯(Zr (SPC)2)納米載體的吸附動力學實驗結果。實驗條件T= 4 °C，攪拌速率3500 rpm，攪拌時間15 h，和磷酸鹽緩沖溶液 (pH 9.02，10mM)。Ce和X分別表示上清液蛋白質殘余濃度和蛋白吸附量占總蛋白量的比例。實施例3
制備首烏蛋白GAP31與蛋黃卵磷脂鋯&(EPC)2的復合脂質體首烏蛋白粗提物來自何首烏，經SDS-PAGE凝膠電泳確認分子量為31 kDa。準確稱量5. 8 mg GAP31溶解在1. 0 ml 磷酸鹽緩沖液(pH 7.2，10 mM + 100 mM NaCl)中保存備用；蛋黃卵磷脂鋯納米載體(5nm， 球形顆粒)依專利(CN102107131A)中方法制備。準確稱量201. 6 μg & (EPC)2顆粒載體，力口入1.49 ml磷酸鹽緩沖液(pH 7. 2)，在4 °C條件下高速攪拌(3500 rpm)至載體完全懸浮分散，再加入 0.01 ml GAP31 蛋白儲備液，分別攪拌 0. 5、1. 0、4. 0、7. 0、10. 0、12. 0、15. 0、18. 0、 20. 0和24. 0小時，高速離心(12000 rpm)20min后分離上清液。固體顆粒使用0. Iml磷酸鹽緩沖溶液洗滌后離心，重復3次，合并上清液測定殘余蛋白質量，確定最佳吸附時間。準確稱量201. 6 μg Zr (EPC) 2顆粒載體，分別加入1. 49 ml不同pH磷酸鹽緩沖液 CpH 4. 50,5. 00,5. 49,5. 89,6. 39,6. 98,7. 56,8. 06,8. 52,9. 02 和 9. 90)，在 4。(條件下高速攪拌(3500 rpm)至載體完全懸浮分散，再加入0. 01 ml GAP31蛋白儲備液，攪拌20. 0小時，高速離心(12000 rpm) 20min后分離上清液。固體顆粒使用0. Iml相應pH磷酸鹽緩沖溶液洗滌后離心，重復3次，合并上清液測定殘余蛋白質量，確定最佳吸附酸度。分別稱量12. 6,37. 8,63. 0,75. 6,100. 8,126. 0,138. 6,165. 0,189. 0,201. 6,226. 8 和252.0 μg Zr (EPC)2顆粒載體，加入1.49 ml磷酸鹽緩沖溶液(pH 5. 00)，在4 °C條件下高速攪拌(3500 rpm)至載體完全懸浮分散，再加入0.01 ml GAP31蛋白儲備液，攪拌20. 0 小時，高速離心(12000 rpm) 20min后分離上清液。固體顆粒使用0. Iml磷酸鹽緩沖溶液 CpH 5. 00)洗滌后離心，重復3次，合并上清液測定殘余蛋白質量，計算蛋白質吸附容量。實例3人工脂質體產品
冷凍干燥3天得產品白(淡黃)色粉末，不溶于水和極性有機溶劑；蛋白質在載體吸附的穩定時間為20小時，緩沖液的最佳pH=5. 00，產品中蛋白質的最大百分含量23. 5 士 1. 2% ；在注射生理鹽水和磷酸鹽緩沖液中分散后得無(淺黃)色透明懸浮液；固相條件下，蛋白質熱脫附溫度為78 0C (5小時以內)；在模擬體外的生理條件下，脂質體穩定(蛋白質脫附率< 5%)的時間達10個月；用于核糖體失活型高效抗癌藥物穩定劑型的構建和開發， 殺滅如I-型HIV病毒。附圖4為首烏蛋白質藥物GAP31在蛋黃卵磷脂鋯(Zr (EPC)2)納米載體的吸附動力學實驗結果。實驗條件T= 4 °C，攪拌速率3500 rpm，攪拌時間20 h，和磷酸鹽緩沖溶液 (pH 5.00，10mM)。Ce和X分別表示上清液蛋白質殘余濃度和蛋白吸附量占總蛋白量的比例。實施例4
制備首烏蛋白GAP31與大豆卵磷脂鋯&(SPC)2的復合脂質體首烏蛋白粗提物來自何首烏，SDS-PAGE凝膠電泳確認其分子量為31 kDa。準確稱量5. 8 mg GAP31溶解在1. 0 ml 磷酸鹽緩沖液(pH 7.2，10 mM + 100 mM NaCl)中保存備用；大豆卵磷脂鋯納米載體(5nm， 球形顆粒)依專利(CN102107131A)中方法制備。準確稱量201. 6 μg & (SPC)2顆粒載體，力口入1.49 ml磷酸鹽緩沖液(pH 7. 2)，在4 °C條件下高速攪拌(3500 rpm)至載體完全懸浮分散，再加入 0. 01 ml GAP31 蛋白儲備液，分別攪拌0. 5,1. 0,4. 0,7. 0,10. 0,12. 0,15. 0,18. 0、 20. 0和24. 0小時，高速離心(12000 rpm)20min后分離上清液。固體顆粒使用0. Iml磷酸鹽緩沖溶液洗滌后離心，重復3次，合并上清液測定殘余蛋白質量，確定最佳吸附時間。準確稱量201. 6 μg Zr (SPC) 2顆粒載體，分別加入1. 49 ml不同pH磷酸鹽緩沖液 CpH 5. 00,5. 49,5. 89,6. 39,6. 98,7. 56,8. 06,8. 52,9. 02 和 9. 90)，在 4 0C 條件下高速攪拌 (3500 rpm)至載體完全懸浮分散，再加入0.01 ml GAP31蛋白儲備液，攪拌15. 0小時，高速離心(12000 rpm)20min后分離上清液。固體顆粒使用0. Iml相應pH磷酸鹽緩沖溶液洗滌后離心，重復3次，合并上清液測定殘余蛋白質量，確定最佳吸附酸度。分別稱量12. 6,37. 8,63. 0,75. 6,100. 8,126. 0,138. 6,165. 0,189. 0,201. 6,226. 8 和252.0 μg Zr (SPC)2顆粒載體，加入1.49 ml磷酸鹽緩沖溶液(pH 5. 89)，在4 °C條件下高速攪拌(3500 rpm)至載體完全懸浮分散，再加入0.01 ml GAP31蛋白儲備液，攪拌15. 0 小時，高速離心(12000 rpm) 20min后分離上清液。固體顆粒使用0. Iml磷酸鹽緩沖溶液 CpH 5. 89)洗滌后離心，重復3次，合并上清液測定殘余蛋白質量，計算蛋白質吸附容量。實例4人工脂質體產品冷凍干燥3天得產品白(淺黃)色粉末，不溶于水和極性有機溶劑；蛋白質在載體吸附的穩定時間為15小時，緩沖液的最佳pH=5. 89，產品中蛋白質的最大百分含量23. 8 士 1. 2% ；在注射生理鹽水和磷酸鹽緩沖液中分散后得無(淺黃)色透明懸浮液；固相條件下，蛋白質熱脫附溫度為75 0C (5小時以內)；在模擬體外的生理條件下，脂質體穩定(蛋白質脫附率< 5%)的時間達8個月；用于核糖體失活型高效抗癌藥物穩定劑型的構建和開發，滴注殺滅如I-型HIV等病毒。附圖5為首烏蛋白質藥物GAP31在大豆卵磷脂鋯(Zr (SPC)2)納米載體的吸附動力學實驗結果。實驗條件T= 4 °C，攪拌速率3500 rpm，攪拌時間15 h，和磷酸鹽緩沖溶液 (pH 5.89，10mM)。Ce和X分別表示上清液蛋白質殘余濃度和蛋白吸附量占總蛋白量的比例。實施例5
制備脂肪酶CRL與蛋黃卵磷脂鋯^(EPC)2的復合脂質體脂肪酶Rugosa Lipase, CRL)購自Sigma公司，其中蛋白質含量為2. 84% (質量百分比)，SDS-PAGE凝膠電泳確認分子量約為60 kDa。準確稱量120. 42 mg粗酶溶解在磷酸鹽緩沖液(pH 7.2，10 mM + 100 mM NaCl)，離心分離并洗滌不溶物，上清液收集并調節總體積為1.0 ml (CRL濃度為 3.42 mg/ml)，保存備用；蛋黃卵磷脂鋯納米載體(5nm，球形顆粒)依專利(CN102107131A) 中方法制備。準確稱量900 μg & (EPC) 2顆粒載體，加入1.4 ml磷酸鹽緩沖液(pH 7.40)， 在4 °C條件下高速攪拌(3500 rpm)至載體完全懸浮分散，再加入0. 1 ml CRL蛋白儲備液， 分別攪拌 0. 6,1. 5,3. 5,7. 5、11. 0,14. 0、19. 0 和 24. 0 小時，高速離心(12000 rpm)20min 后分離上清液。固體顆粒使用0. Iml磷酸鹽緩沖溶液洗滌后離心，重復3次，合并上清液測定殘余蛋白質量，確定最佳吸附時間。準確稱量MO μg Zr (EPC) 2顆粒載體，分別加入1. 4 ml不同pH磷酸鹽緩沖液(pH 7.40、8.59、9.73和10.43)，在4 °C條件下高速攪拌(3500 rpm)至載體完全懸浮分散，再加入0.1 ml CRL蛋白儲備液，攪拌14.0小時，高速離心(12000 rpnO20min后分離上清液。 固體顆粒使用0. Iml相應pH磷酸鹽緩沖溶液洗滌后離心，重復3次，合并上清液測定殘余蛋白質量，確定最佳吸附酸度。分別稱量50、100、200、350、500 和 750 Pg Zr (EPC) 2 顆粒載體，加入 1. 4 ml 磷酸鹽緩沖溶液(pH 8. 59)，在4 ° C條件下高速攪拌(3500 rpm)至載體完全懸浮分散，再加入 0.1 ml CRL蛋白儲備液，攪拌14.0小時，高速離心(12000 rpm) 20min后分離上清液。固體顆粒使用0. Iml磷酸鹽緩沖溶液(pH 8. 59)洗滌后離心，重復3次，合并上清液測定殘余蛋白質量，計算蛋白質吸附容量。實例5人工脂質體產品
冷凍干燥3天得產品白色粉末，不溶于水和極性有機溶劑；產品中蛋白質吸附的穩定時間為14小時，最佳pH 8. 59，蛋白質的最大百分含量23. 9 士 1. 2% ；固相條件下，脂質體中的蛋白質熱脫附溫度為64 0C (5小時以內)；在磷酸緩沖溶液中，脂質體穩定(蛋白質脫附率< 5%)的時間達6個月；用于構建和開發新型、高效的生物酶，催化脂肪水解和酯交換合成的反應。附圖6為脂肪酶Candida Rugosa Lipase (CRL)在蛋黃卵磷脂鋯(& (EPC) 2)納米載體的吸附動力學實驗結果。實驗條件T= 4 °C，攪拌速率3500 rpm，攪拌時間14 h，和磷酸鹽緩沖溶液(pH 8.59，10mM)。Ce和X分別表示上清液蛋白質殘余濃度和蛋白吸附量占總蛋白量的比例。實施例6
制備脂肪酶CRL與大豆卵磷脂鋯^(SPC)2的復合脂質體脂肪酶Rugosa Lipase, CRL)購自Sigma公司，蛋白質的質量百分比為2. 84%，SDS-PAGE凝膠電泳確認分子量約為60 kDa。準確稱量120. 42 mg粗酶溶解在磷酸鹽緩沖液(pH 7.2，10 mM + 100 mM NaCl)，離心分離并洗滌不溶物，上清液收集并調節總體積為1.0 ml (CRL濃度為3. 42 mg/ ml)，保存備用；大豆卵磷脂鋯納米載體(5nm，球形顆粒)依專利(CN102107131A)中方法制備。準確稱量900 μg & (SPC)2顆粒載體，加入1.4 ml磷酸鹽緩沖液(pH 7. 40)，在4冗條件下高速攪拌(3500 rpm)至載體完全懸浮分散，再加入0.1 ml CRL蛋白儲備液，分別攪拌 0. 6,1. 5,3. 5,7. 5、11. 0,14. 0,19. 0 和 24. 0 小時，高速離心(12000 rpm)20min 后分離上清液。固體顆粒使用0. Iml磷酸鹽緩沖溶液洗滌后離心，重復3次，合并上清液測定殘余蛋白質量，確定最佳吸附時間。準確稱量1. 26 mg & (SPC)2顆粒載體，分別加入1. 4 ml不同pH磷酸鹽緩沖液(pH 7.40、8.59、9.73和10.43)，在4 °C條件下高速攪拌(3500 rpm)至載體完全懸浮分散，再加入0.1 ml CRL蛋白儲備液，攪拌19. 0小時，高速離心(12000 rpnO20min后分離上清液。 固體顆粒使用0. Iml相應pH磷酸鹽緩沖溶液洗滌后離心，重復3次，合并上清液測定殘余蛋白質量，確定最佳吸附酸度。分別稱量50、100、200、350、500 和 750 Pg Zr (SPC) 2 顆粒載體，加入 1. 4 ml 磷酸
鹽緩沖溶液(pH 8. 59)，在4 ° C條件下高速攪拌(3500 rpm)至載體完全懸浮分散，再加入 0.1 ml CRL蛋白儲備液，攪拌19.0小時，高速離心(12000 rpm) 20min后分離上清液。固體顆粒使用0. Iml磷酸鹽緩沖溶液(pH 8. 59)洗滌后離心，重復3次，合并上清液測定殘余蛋白質量，計算蛋白質吸附容量。實例6人工脂質體產品
冷凍干燥3天得產品白色粉末，不溶于水和極性有機溶劑；產品中蛋白質吸附的穩定時間為19小時，最佳pH 8. 59，蛋白質的最大百分含量1 士 1. ;固相條件下，脂質體中的蛋白質熱脫附溫度為60 0C (5小時以內)；在磷酸緩沖溶液中，脂質體穩定(蛋白質脫附率< 5%)的時間達6個月；用于構建和開發新型、高效的生物催化劑，促進脂肪水解和酯交換合成的反應。附圖7為脂肪酶Candida Rugosa Lipase (CRL)在大豆卵磷脂鋯(Ir (SPC) 2)納米載體的吸附動力學實驗結果。實驗條件T= 4 °C，攪拌速率3500 rpm，攪拌時間19 h，和磷酸鹽緩沖溶液(pH 8.59，10mM)。Ce和X分別表示上清液蛋白質殘余濃度和蛋白吸附量占總蛋白量的比例。實施例7
制備牛血清白蛋白BSA與蛋黃卵磷脂鋯&(EPC)2的復合脂質體牛血清白蛋白購自 Sigma公司，分子量為66. 5 kDa，蛋白質含量為90%。準確稱量3. 80 mg BSA溶解在1.0 ml 磷酸鹽緩沖液(pH 7. 2，10 mM + 100 mM NaCl)中保存備用(BSA濃度為3. 42 mg/ml)；蛋黃卵磷脂鋯納米載體(5nm，球形顆粒)依專利(CN102107131A)中方法制備。準確稱量1. 1 mg Zr (EPC) 2顆粒載體，加入1.4 ml磷酸鹽緩沖液(pH 7. 2)，在4 ° C條件下高速攪拌(3500rpm)至載體完全懸浮分散，再加入0. 1 ml BSA蛋白儲備液，分別攪拌0. 6、1. 5、3. 5、7. 5、 11. 0,14. 0,19. 0和24. 0小時，高速離心(12000 rpm)20min后分離上清液。固體顆粒使用
0. Iml磷酸鹽緩沖溶液洗滌后離心，重復3次，合并上清液測定殘余蛋白質量，確定最佳吸附時間。準確稱量MO μg Zr (EPC) 2顆粒載體，分別加入1. 4 ml不同pH磷酸鹽緩沖液(pH 7.40、8.59、9.73和10.43)，在4 °C條件下高速攪拌(3500 rpm)至載體完全懸浮分散，再加入0.1 ml BSA蛋白儲備液，攪拌19.0小時，高速離心(12000 rpnO20min后分離上清液。 固體顆粒使用0. Iml相應pH磷酸鹽緩沖溶液洗滌后離心，重復3次，合并上清液測定殘余蛋白質量，確定最佳吸附酸度。分別稱量40、80. 5、16U82、402. 5 和 603. 8 ^g Zr (EPC) 2 顆粒載體，加入 1. 4 ml 磷酸鹽緩沖溶液(pH 8. 59)，在4 ° C條件下高速攪拌(3500 rpm)至載體完全懸浮分散，再加入0.1 ml BSA蛋白儲備液，攪拌19.0小時，高速離心(12000 rpnO20min后分離上清液。 固體顆粒使用0. Iml磷酸鹽緩沖溶液(pH 8. 59)洗滌后離心，重復3次，合并上清液測定殘余蛋白質量，計算蛋白質吸附容量。實例7人工脂質體產品
冷凍干燥3天得產品白色粉末，不溶于水和極性有機溶劑；產品中最大蛋白質含量的吸附時間為19小時，最佳pH 8. 59，蛋白質的最大百分含量對.5 士 1.2%;固相條件下，蛋白質熱脫附溫度為70 0C (5小時以內)；在模擬體外的生理條件下，脂質體穩定(蛋白質脫附率(5%)的時間達9個月；用于構建和開發新型、穩定的免疫診斷試劑，用于生物和醫學檢測。附圖8為牛血清白蛋白(BSA)在蛋黃卵磷脂鋯(Zr(EPC)2)納米載體的吸附動力學實驗結果。實驗條件T= 4 °C，攪拌速率3500 rpm，攪拌時間19 h，和磷酸鹽緩沖溶液(pH 8. 59，10mM)。Ce和X分別表示上清液蛋白質殘余濃度和蛋白吸附量占總蛋白量的比例。實施例8
制備牛血清白蛋白BSA與大豆卵磷脂鋯&(SPC)2的復合脂質體牛血清白蛋白購自 Sigma公司，分子量為66. 5 kDa，蛋白質含量為90%。準確稱量3. 80 mg BSA溶解在1.0 ml 磷酸鹽緩沖液(pH 7. 2，10 mM + 100 mM NaCl)中保存備用(BSA濃度為3. 42 mg/ml)；大豆卵磷脂鋯納米載體(5nm，球形顆粒)依專利(CN102107131A)中方法制備。準確稱量1. 1 mg Zr (SPC) 2顆粒載體，加入1.4 ml磷酸鹽緩沖液(pH 7. 2)，在4 ° C條件下高速攪拌(3500 rpm)至載體完全懸浮分散，再加入0. 1 ml BSA蛋白儲備液，分別攪拌0. 6、1. 5、3. 5、7. 5、 11. O、14. O、19. O和24. O小時，高速離心(12000 rpm)20min后分離上清液。固體顆粒使用 0. Iml磷酸鹽緩沖溶液洗滌后離心，重復3次，合并上清液測定殘余蛋白質量，確定最佳吸附時間。準確稱量1. 26 mg & (SPC)2顆粒載體，分別加入1. 4 ml不同pH磷酸鹽緩沖液(pH 7.40、8.59、9.73和10.43)，在4 °C條件下高速攪拌(3500 rpm)至載體完全懸浮分散，再加入0.1 ml BSA蛋白儲備液，攪拌Μ. O小時，高速離心(12000 rpnO20min后分離上清液。 固體顆粒使用0. Iml相應pH磷酸鹽緩沖溶液洗滌后離心，重復3次，合并上清液測定殘余蛋白質量，確定最佳吸附酸度。分別稱量40、80. 5、16U82、402. 5 和 603. 8 μδ Zr (SPC) 2 顆粒載體，加入 1. 4 ml磷酸鹽緩沖溶液(pH 8. 59)，在4 ° C條件下高速攪拌(3500 rpm)至載體完全懸浮分散，再加入0.1 ml BSA蛋白儲備液，攪拌Μ. 0小時，高速離心(12000 rpnO20min后分離上清液。 固體顆粒使用0. Iml磷酸鹽緩沖溶液(pH 8. 59)洗滌后離心，重復3次，合并上清液測定殘余蛋白質量，計算蛋白質吸附容量。實例8人工脂質體產品
冷凍干燥3天得產品白色粉末，不溶于水和極性有機溶劑；產品中蛋白質吸附穩定時間為M.0小時，最佳pH 8. 59，蛋白質的最大百分含量對.2 士 1.2%;固相條件下，蛋白質熱脫附溫度為68 0C (5小時以內)；在模擬體外的生理條件下，脂質體穩定(蛋白質脫附率 ^ 5%)的時間達9個月；用于構建新型、穩定的生物和醫學免疫診斷試劑盒。附圖9為牛血清白蛋白(BSA)在大豆卵磷脂鋯(Zr(SPC)2)納米載體的吸附動力學實驗結果。實驗條件T= 4 °C，攪拌速率3500 rpm，攪拌時間M h，和磷酸鹽緩沖溶液(pH 8. 59，10mM)。Ce和X分別表示上清液蛋白質殘余濃度和蛋白吸附量占總蛋白量的比例。
權利要求
1.一種人工脂質體的制備方法，其特征是以納米球形顆粒的蛋黃卵磷脂鋯ττ (EPC) 2或者大豆卵磷脂鋯^(SPC)2作為載體，以苦瓜蛋白ΜΑΡ30、首烏蛋白GAP31、脂肪酶CRL、或者牛血清白蛋白BSA作為包裹蛋白，其中載體與包裹蛋白的質量比為74. 3-77. 7:22. 3-25. 7， 制備時，在蛋黃卵磷脂鋯ττ (EPC) 2或者大豆卵磷脂鋯ττ (SPC) 2的載體材料中加入磷酸鹽緩沖溶液，在溫度為4°C，轉速為3500rpm的條件下攪拌得到無色、透明的分散液，將包裹蛋白溶解在磷酸鹽緩沖溶液中，然后緩慢滴加至分散液液中，在低溫條件下快速攪拌至形成穩定的脂質體，離心分離出蛋白質后反復洗滌并離心，經低溫冷凍干燥得固體產品，固體產品低溫保存或無菌生理鹽水封存后置于低溫條件下儲藏，即得成品。
2.根據權利要求1所述的一種人工脂質體的制備方法，其特征是所述的載體與包裹蛋白的質量比為75-77:23-25。
全文摘要
本發明公開了一種人工脂質體的制備方法，屬于藥學領域，涉及一種蛋白質藥物脂質體的制備方法。以納米球形顆粒的蛋黃卵磷脂鋯或者大豆卵磷脂鋯作為載體，以苦瓜蛋白MAP30、首烏蛋白GAP31、脂肪酶CRL、或者牛血清白蛋白BSA作為包裹蛋白，其中載體與包裹蛋白的質量比為74.3-77.7:22.3-25.7，制備時，在載體材料中加入磷酸鹽緩沖溶液，在溫度為4℃，轉速為3500rpm的條件下攪拌得到無色、透明的分散液，將包裹蛋白溶解在磷酸鹽緩沖溶液中，然后緩慢滴加至分散液液中，在低溫條件下快速攪拌至形成穩定的脂質體，離心分離出蛋白質后反復洗滌并離心，經低溫冷凍干燥即得成品。本發明方法具有工藝簡單、條件溫和、重復性高，蛋白質吸附容量大，脂質體結構穩定的特點。
文檔編號A61K38/38GK102552145SQ20121002325
公開日2012年7月11日 申請日期2012年2月2日 優先權日2012年2月2日
發明者喬元彪 申請人:呂梁學院