本申請是2013年04月16日遞交的申請號為201380019880.0，發明名稱為“用于調節免疫反應的介孔二氧化硅組合物”的分案申請。

政府支持

本申請具有政府支持，由國家健康研究院授權的第r01de019917號權利支持。政府享有本發明的某些權利。

本發明涉及生物相容性可注射性組合物。

背景技術：

需要體外操作的疫苗，例如大多數基于細胞的治療，會導致不理想的淋巴結定位以及有限的效力。

技術實現要素：

本發明為現有方法中相關的一些問題和缺陷提供了一種解決方案。因此，本發明的特點在于一種組合物，所述組合物包括介孔二氧化硅(mps)棒，所述介孔二氧化硅(mps)棒包括一種免疫細胞募集化合物和一種免疫細胞活化化合物。所述棒包括直徑在2-50納米之間的孔，例如，直徑在5-25納米之間的孔或者直徑在5-10納米之間的孔。在優選的實施方案中，所述棒包括直徑大約為8納米的孔。微棒的長度在5微米到500微米之間。在一個實施例中，所述棒的長度為5-25微米，例如，10-20微米。在其他實施例中，所述棒的長度為50微米-250微米。使用介孔二氧化硅(mps)微顆粒組合物可以實現細胞的穩固的募集，所述介孔二氧化硅(mps)微顆粒組合物的特點在于具有較高的寬高比，例如，所述棒的長度為80微米到120微米。

示例性的免疫細胞募集化合物包括粒細胞巨噬細胞-菌落刺激因子(gm-csf)。其他募集化合物的實施例包括趨化因子，例如，選自由趨化因子(c-c基序)配位體21(ccl-21,基因銀行編目號:(aa)cag29322.1(01:47496599),(na)ef064765.1(01:117606581),通過引證在此并入本文)，趨化因子(c-c基序)配位體19(ccl-19,基因銀行編目號:(aa)cag33149.1(01:48145853),(na)nm_006274.2(01:22165424),通過引證在此并入本文)，以及fms-樣酪氨酸激酶3配位體(flt3)配位體；基因銀行編目號:(aa)aai44040(01:219519004),(na)nm_004119(01:01:121114303)通過引證在此并入本文)所組成的組中。

免疫細胞活化化合物包括toll樣受體激動劑。這種激動劑包括病原相關分子模型(pamp)，例如，一種感染-模擬組合物，例如，細菌衍生的免疫調節劑(也叫做危險信號)。toll樣受體(tlr)激動劑包括核酸或者脂類組合物(例如，單磷酸脂a(mpla))。在一個實施例中，toll樣受體(tlr)激動劑包括tlr9激動劑，例如，一種胞嘧啶-鳥嘌呤低聚核苷酸(cpg-odn)、一種聚(氮丙啶)(pei)-濃縮的低聚核苷酸(odn)(例如，聚(氮丙啶)(pei)-胞嘧啶-鳥嘌呤低聚核苷酸(cpg-odn))、或者雙鏈脫氧核糖核酸(dna)。例如，所述裝置包括5微克、10微克、25微克、50微克、100微克、250微克或者500微克的胞嘧啶-鳥嘌呤低聚核苷酸(cpg-odn)。在另一個實施例中，toll樣受體(tlr)激動劑包括tlr3激動劑，例如，聚肌苷-聚胞苷酸(聚i:c)、一種聚(氮丙啶)(pei)-聚(i:c)、聚腺尿苷酸(聚(a:u))、聚(氮丙啶)(pei)-聚(a:u)、或者雙鏈核糖核酸(rna)。

脂多糖(lps)同樣可以用于實現此目的。

為了產生免疫反應，所述組合物包括此免疫反應所需要的抗原。例如，所述組合物包括腫瘤抗原。在優選的實施方案中，所述抗原包括一種腫瘤細胞溶解產物(例如，從被治療的主體中收集的腫瘤活組織切片樣品中提取的)。所述主體優選是人類患者，但是所述組合物/系統還可以用于獸醫用途，例如，用于治療功能性動物，比如狗、貓以及性能動物，例如，馬和家畜，比方說家牛、公牛、羊、山羊，等。

抗原遞呈細胞，比如樹突狀細胞(dc)，通過介孔二氧化硅(mps)裝置，那就是說，細胞不是永久居住在裝置中。向裝置中募集免疫細胞，并且使其短時間內居住在裝置中，當他們遇到抗原時被活化。然后免疫細胞(比如樹突狀細胞(dc))定位向淋巴結。他們聚集在淋巴結處，例如，一種引流淋巴結，而不是在介孔二氧化硅(mps)裝置中。在淋巴結處聚集的細胞進一步增加了對疫苗抗原的免疫反應，產生更有力的針對該抗原的細胞反應和體液反應。

因此，一種誘導對疫苗產生全身性抗原特異性免疫反應的方法包括對主體施用如上所述的介孔二氧化硅(mps)組合物。所述組合物被裝入注射器并注入受試者的身體中。例如，少量(例如，50-500微升，例如，150微升)進行皮下注射。一般地，在施用后第2天，使用細胞滲透所述裝置(介孔二氧化硅(mps)組合物)，并在施用后第5-7天，引流淋巴結中充滿從裝置中遷移出來的細胞和遷移到淋巴結組織中的細胞，這些細胞在此聚集并進一步的傳播抗原-特異性反應。因此，所述組合物可以有效用于誘導免疫細胞向淋巴結的定位。在接種疫苗治療劑之后，不比去除所述介孔二氧化硅(mps)組合物。這些組合物可以在施用位點處保存，并在此降解。例如，通過巨噬細胞隨著時間來消耗介孔二氧化硅(mps)顆粒，并直至從身體內清除。

制備疫苗的方法包括，提供一種介孔二氧化硅棒懸浮液，將所述棒與疫苗抗原、免疫細胞募集化合物和免疫細胞活化化合物相接觸。所述疫苗抗原一種腫瘤細胞溶解產物，所述募集化合物包括粒性白細胞巨噬細胞集落刺激因子(gm-csf)，并且所述活化化合物包括胞嘧啶-鳥嘌呤低聚核苷酸(cpg-odn)。有時候，在將所述棒與一個或一個以上下列化合物相接觸之前用羥基乙酸或者乳酸修飾所述棒：疫苗抗原、募集化合物或者活化化合物。選擇性的，所述介孔二氧化硅(mps)組合物/裝置是使用介孔二氧化硅(mps)棒、一種免疫細胞募集化合物和一種免疫細胞活化化合物(選擇性地，與羥基乙酸或者乳酸修飾)來制備的，被儲存和/或運往應用位點，因此，在施用前，向棒懸浮液中加入病人特異性腫瘤抗原制劑或者溶解產物，例如，在對病人施用前1、2、6、12、24或者48小時之前加入。

所述裝入介孔二氧化硅(mps)組合物中的化合物是被加工或者純化的。例如、多聚核苷酸、多肽或者其他試劑，可以被純化和/或分離。具體地說，如這里所使用的，“分離的”或者“純化的"核苷酸分子、多聚核苷酸、多肽或者蛋白質是指在通過重組技術產生時基本上不含有其他細胞物質或者培養基的物質，或者是指通過化學合成的化學前體物或者其他化學試劑。純化后的化合物按重量計算(干重)占所關心化合物的至少60％。優選的，所述制劑按重量計算占所關心化合物的至少75％，更優選的占至少90％，并且最優選的占至少99％。例如，純化后的化合物按重量計算占理想化合物的至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，98％，99％，或者100％(重量/重量)。可以通過任何適當的標準方法來測量純度，例如，通過柱形色譜法、薄層色層分析法、或者高效液相色譜(hplc)進行分析。純化后的或者分離的多聚核苷酸(核糖核酸(rna)或者脫氧核糖核酸(dna))不含有那些在其天然存在形式中存在的側鏈基因或者序列。純化的也用于定義一種滅菌程度，這種滅菌程度可以安全的對人類主體給藥，例如，不具有傳染性或者毒劑。就腫瘤抗原而言，所述抗原可以被純化或者處理成一種腫瘤細胞溶解產物。

同樣，“基本上純的”是指從其天然伴隨的成分中分離出來的核苷酸或者多肽。通常，當核苷酸和多肽按重量計算不含有至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、或者甚至至少99％的蛋白質和其天然伴隨存在的有機分子時，這種核苷酸和多肽是基本上純的。

小分子是質量小于2000道爾頓的化合物。優選的，所述小分子的分子質量小于1000道爾頓，更優選的，小于600道爾頓，例如，所述化合物的分子質量小于500道爾頓、400道爾頓、300道爾頓、200道爾頓或者100道爾頓。

過渡術語“包括(comprising)”與“包含(including)”、“含有(containing)”或者“具有...的特征”是同義詞，都屬于包括性的或者開放式定義，不排除其他未列出的成分或者方法步驟。相反，術語“由。。。組成”不包括任何在權利要求中沒有特別指出的成分、步驟或者組分。術語“基本上由…組成"將權利要求的范圍限制在指定的材料或者步驟，“以及那些本質上不影響要求保護的發明的本質和新穎特性的材料或者步驟"。

從下面關于本發明優選的實施方案的表述中，以及從權利要求書中，本發明的其他特點和優勢將變得顯而易見。除非另有定義，這里使用的所有科技用語與本發明所屬領域普通技術人員通常的理解具有相同的含義。雖然與這里描述的方法和材料相似的任何方法和材料都可以被用于實施或者檢測本發明，但是下面描述的是適當的方法和材料。這里應用的所有公開的外國專利和專利申請在此通過引證全部并入本文。genbank和ncbi指明的登記號碼也通過引證在此全部并入本文。這里引用的其他出版的參考文獻、文件、原稿和科學文獻通過引證在此全部并入本文。如果出現矛盾，以本發明說明書包括定義為準。此外，這里所述的材料、方法和實施例只起到說明作用，并不作為限制。

附圖說明

圖1是介孔二氧化硅(mps)棒的電鏡照片。這些棒的隨機堆疊和自組裝可產生能夠進行細胞過濾的3d空間。

圖2是一種棒狀圖，顯示了具有不同長度的介孔二氧化硅(mps)棒的表面標記物表達作用。將100微克具有不同長度的介孔二氧化硅(mps)棒與骨髓衍生的樹突狀細胞一起培養18小時。作為發炎作用的標記物，通過用細胞表面受體cdllc(樹突狀細胞標記物)、mhcii(抗原呈遞標記物)和cd86(共刺激受體)染色來確定被活化的細胞的百分比。隨著長度的增加，所述棒的炎癥性質也增加。由于理想的腳手架顯示炎癥性質(與plg腳手架參照相似)，在后續的實驗中使用長度為30微米到100微米或120微米之間的棒。

圖3是一系列圖，顯示了介孔二氧化硅(mps)棒在小鼠中的作用。圖3a是一種圖，顯示了在用5毫克羅丹明標記的介孔二氧化硅(mps)棒對c57bl/6j小鼠進行皮下注射5天后切除的腳手架注射位點。皮下小囊顯示所述棒被定位并且自組裝產生3d微環境。圖3b是切除的腳手架位點的電鏡照片，顯示了過濾進入腳手架位點的細胞。圖3c顯示了從介孔二氧化硅(mps)腳手架上分離的細胞的活/死成像，說明活細胞被募集。

圖4a是線狀圖，顯示了粒細胞巨噬細胞-菌落刺激因子(gm-csf)從介孔二氧化硅(mps)棒中的釋放。1微克粒細胞巨噬細胞-菌落刺激因子(gm-csf)被裝載入介孔二氧化硅(mps)棒中，與0.1bsa/pbs一起培養。定時收集上清液，然后使用elisa(r&d公司)測定粒細胞巨噬細胞-菌落刺激因子(gm-csf)。粒細胞巨噬細胞-菌落刺激因子(gm-csf)從介孔二氧化硅(mps)棒中連續釋放。圖4b是棒狀圖，顯示了在體外骨髓衍生的樹突狀細胞(bmdc)中與介孔二氧化硅(mps)共培養的表面標記物表達。100微克的未修飾的、氨基-、硫醇-、氯-、和膦酸修飾的介孔二氧化硅(mps)棒與10⁶/毫升骨髓衍生的樹突狀細胞(bmdc)一起培養18小時。然后對細胞進行分析，確定mhcii類和共刺激性分子cd86的表達。介孔二氧化硅(mps)刺激骨髓衍生的樹突狀細胞(bmdc)中mhcii和cd86的增加的表達作用表示介孔二氧化硅(mps)棒是炎癥性的，并且這一性質可以被表面修飾的介孔二氧化硅(mps)棒所調節。

圖5a是棒狀圖，顯示了通過裝載粒性白細胞巨噬細胞集落刺激因子(gm-csf)的介孔二氧化硅(mps)棒募集的樹突狀細胞。皮下注射5毫克/小鼠裝載有或者不裝載有1微克/小鼠粒性白細胞巨噬細胞集落刺激因子(gm-csf)的介孔二氧化硅(mps)棒。從腳手架位點捕獲細胞并進行cd1lc受體(樹突狀細胞(dc)標記物)染色。裝載有粒性白細胞巨噬細胞集落刺激因子(gm-csf)的介孔二氧化硅(mps)腳手架能夠比空白介孔二氧化硅(mps)腳手架募集更多的樹突狀細胞(dc)。圖5b是一種棒狀圖，描述了樹突狀細胞(dc)的表面標記物表達。裝載粒性白細胞巨噬細胞集落刺激因子(gm-csf)和胞嘧啶-鳥嘌呤低聚核苷酸(cpg-odn)的介孔二氧化硅(mps)腳手架比不裝載胞嘧啶-鳥嘌呤低聚核苷酸(cpg-odn)的腳手架活化更多的樹突狀細胞(dc)。

圖6a-b是棒狀圖，顯示了腳手架位點處的(圖6a)b220+細胞百分比，或者(圖6b)b220+細胞總數。皮下注射5毫克/小鼠裝載有或者不裝載有1微克/小鼠粒性白細胞巨噬細胞集落刺激因子(gm-csf)、100微克胞嘧啶-鳥嘌呤低聚核苷酸(cpg-odn)和130微克卵清蛋白的介孔二氧化硅(mps)棒。從腳手架位點定時捕獲細胞并進行b220受體(b細胞標記物)染色。在第3天，裝載有粒性白細胞巨噬細胞集落刺激因子(gm-csf)、胞嘧啶-鳥嘌呤低聚核苷酸(cpg-odn)和卵清蛋白的介孔二氧化硅(mps)腳手架能夠募集更多的b細胞。

圖7a-c是流式細胞儀散點圖(圖7a)和棒狀圖(圖7b-c)，描述了樹突狀細胞(dc)表面上存在mhc-i-siinfekl(seqidno:l)標記物。裝載有粒性白細胞巨噬細胞集落刺激因子(gm-csf)、胞嘧啶-鳥嘌呤低聚核苷酸(cpg-odn)和模型抗原卵清蛋白的介孔二氧化硅(mps)腳手架能夠誘導抗原特異性樹突狀細胞(dc)擴散，定位到引流淋巴結(dln)。用樹突狀標記物cd1lc和標記物標記物mhc-i-siinfekl對dln細胞進行染色顯示，在mhc-i復合物中，一部分卵清蛋白(肽序列siinfekl)存在于細胞表面上。

圖8a-b是棒狀圖，顯示由于介孔二氧化硅(mps)腳手架形成的次級淋巴小結。在裝載有粒性白細胞巨噬細胞集落刺激因子(gm-csf)、胞嘧啶-鳥嘌呤低聚核苷酸(cpg-odn)和模型抗原卵清蛋白的介孔二氧化硅(mps)腳手架能夠誘導次級淋巴小結，定位活化的抗原初始化b細胞。用b220(b細胞標記物)和gl7次級淋巴小結標記物)對dln進行染色，研究次級淋巴小結的形成，所述次級淋巴小結中存在特有的b細胞，這種特有的b細胞被活化并且包括在身體過成熟和同型體轉換過程中。

圖9a-b是一種棒狀圖，描述了裝載有粒性白細胞巨噬細胞集落刺激因子(gm-csf)、胞嘧啶-鳥嘌呤低聚核苷酸(cpg-odn)和模型抗原卵清蛋白的介孔二氧化硅(mps)腳手架能夠誘導cd8+細胞毒性t細胞(ctls)的擴散，所述cd8+細胞毒性t細胞可以特異性識別模型抗原。用cd8(殺傷t細胞標記物)和mhci-四聚體-siinfekl抗體對脾細胞染色，顯示t細胞是否能夠識別mhci復合物上呈遞的特異性抗原。

圖10a-c是直方圖，顯示了裝載有粒性白細胞巨噬細胞集落刺激因子(gm-csf)、胞嘧啶-鳥嘌呤低聚核苷酸(cpg-odn)和模型抗原卵清蛋白的介孔二氧化硅(mps)腳手架能夠誘導抗原特異性cd8+ctls在dln和脾中的克隆擴散。從ot-i小鼠中注射的脾細胞被追蹤染料cfse染色，追蹤染料cfse的熒光性隨著細胞每次分裂減半。完全裝載的疫苗組中脾和dln中cfse染色的脾細胞的熒光下降顯示ova-特異性ctl增殖。

圖11a-c是直方圖，顯示了裝載有粒性白細胞巨噬細胞集落刺激因子(gm-csf)、胞嘧啶-鳥嘌呤低聚核苷酸(cpg-odn)和模型抗原卵清蛋白的介孔二氧化硅(mps)腳手架能夠誘導抗原特異性cd4+ths在dln和脾中的克隆擴散。從ot-ii小鼠中注射的脾細胞被追蹤染料cfse染色，追蹤染料cfse的熒光性隨著細胞每次分裂減半。完全裝載的疫苗組中和只裝載抗原的介孔二氧化硅(mps)組的脾和dln中cfse染色的脾細胞的熒光下降顯示ova-特異性cd4+th細胞增殖。

圖12a-b是直方圖，顯示了抗原滴定度被定義為抗體-血清溶液被稀釋并仍然保持可檢測的抗體數量的程度。所述抗卵清蛋白血清抗體被滴定。裝載有粒性白細胞巨噬細胞集落刺激因子(gm-csf)、胞嘧啶-鳥嘌呤低聚核苷酸(cpg-odn)和卵清蛋白的介孔二氧化硅(mps)腳手架能夠引發有力的和長時間的th1和th2抗體反應。單獨裝載有卵清蛋白的介孔二氧化硅(mps)可以引發有效的th2反應，顯示了介孔二氧化硅(mps)材料本身的輔助潛力。

圖13a-b是線性圖，顯示了粒性白細胞巨噬細胞集落刺激因子(gm-csf)以一種控制并持續的方式從介孔二氧化硅(mps)微粒中釋放。a)1微克粒性白細胞巨噬細胞集落刺激因子(gm-csf)被裝載入5毫克介孔二氧化硅(mps)棒中并在0.1bsa/pbs中培養。定時收集上清液并使用酶聯免疫吸附測定(r&d公司)測定粒性白細胞巨噬細胞集落刺激因子(gm-csf)。雖然劑量較小，但是粒性白細胞巨噬細胞集落刺激因子(gm-csf)連續地從介孔二氧化硅(mps)棒中釋放。b)1微克粒性白細胞巨噬細胞集落刺激因子(gm-csf)被裝載入5毫克的含有ova和cpg的介孔二氧化硅(mps)中。然后皮下注射入c57bl/6j小鼠中。在各個時間點，收獲包圍注射的顆粒腳手架的組織并分析粒性白細胞巨噬細胞集落刺激因子(gm-csf)水平。粒性白細胞巨噬細胞集落刺激因子(gm-csf)的水平維持一周。

圖14a-b是照片，和圖14c是棒狀圖。具有更高寬高比的介孔二氧化硅(mps)微粒能夠募集更多的細胞。圖14a顯示了長度或者在10微米和20微米之間、或者在80微米和120微米的介孔二氧化硅(mps)微粒的掃描電鏡圖像。較長的棒使組合物具有更大面積或者更大的棒間空間。圖14b顯示了從小鼠中捕獲的介孔二氧化硅(mps)組合物。將5微克介孔二氧化硅(mps)微粒皮下注射入小鼠中，在注射后第7天收獲腳手架位點。圖14c是一種棒狀圖，列舉了從腳手架中分離的細胞。具有更高寬高比的介孔二氧化硅(mps)微粒能夠募集更多的細胞。

圖15a-b是條形圖。作為對粒性白細胞巨噬細胞集落刺激因子(gm-csf)的反應，樹突狀細胞(dc)被介孔二氧化硅(mps)微粒募集。將粒性白細胞巨噬細胞集落刺激因子(gm-csf)(0納克、500納克、1000納克、3000納克)裝載入介孔二氧化硅(mps)微粒中，并將其皮下注射入小鼠中。在注射后第7天，收獲腳手架并用流式細胞儀分析。圖15a顯示，隨著粒性白細胞巨噬細胞集落刺激因子(gm-csf)劑量的增加，募集的cdllc+cdllb+樹突狀細胞(dc)增加。圖15b顯示，隨著粒性白細胞巨噬細胞集落刺激因子(gm-csf)劑量的增加，募集的成熟cdllc+mhcii+樹突狀細胞(dc)同樣增加。

圖16是一種棒狀圖，顯示了粒性白細胞巨噬細胞集落刺激因子(gm-csf)能夠增加募集的樹突狀細胞(dc)向著引流淋巴結的流通。將裝載有alexa647標記的卵清蛋白(ova)、或者alexa647標記的ova和1微克粒性白細胞巨噬細胞集落刺激因子(gm-csf)的介孔二氧化硅(mps)微粒皮下注射入小鼠體內。在注射后第7天，收獲引流管淋巴結(dln)并用流式細胞儀分析。在加入了抗原(ova)的情況下，流向腳手架并吸收ova的alexa647+cd11c+樹突狀細胞(dc)有適度增加。然而，粒性白細胞巨噬細胞集落刺激因子(gm-csf)的加入使從腳手架流向dln的樹突狀細胞顯著增加。

圖17a-c是散點圖，圖17d是棒狀圖。胞嘧啶-鳥嘌呤低聚核苷酸(cpg-odn)從介孔二氧化硅(mps)微粒腳手架中的局部運輸能夠增加活化的樹突狀細胞的循環。介孔二氧化硅(mps)微粒裝載有1微克粒性白細胞巨噬細胞集落刺激因子(gm-csf)、300微克ova和100微克胞嘧啶-鳥嘌呤低聚核苷酸(cpg-odn)。然后將其皮下注射入小鼠中。在注射后7天收獲dlns并分析。用cdllc和cd86染色淋巴結細胞。胞嘧啶-鳥嘌呤低聚核苷酸(cpg-odn)能夠從介孔二氧化硅(mps)腳手架中局部釋放，因此它的加入能夠進一步增加dln中活化的、成熟樹突狀細胞(dc)的百分比和數目。

圖18a-c是照片，圖18d是棒狀圖。蛋白質以控制且持續的方式從介孔二氧化硅(mps)微粒腳手架中釋放。將alexa647標記的卵清蛋白(或者處于緩沖溶液中，或者裝載在介孔二氧化硅(mps)微粒上)皮下注射到老鼠側面。使用ivis測定各個時間點的相對熒光。如果在緩沖溶液中注射，所述蛋白質在小于1天的時間里從注射部位擴散。但是，如果裝載在介孔二氧化硅(mps)微粒上，所述蛋白質以一種持續的方式從局部腳手架位點釋放，例如，超過一周的時間(2、3、4、5、7或者更多天)。

圖19a-b是線性圖，顯示了抗體滴定度。抗體滴定度被定義為抗體-血清溶液被稀釋但始終包含可檢測數量抗體的程度。使用30微克ova、10微克胞嘧啶-鳥嘌呤低聚核苷酸(cpg-odn)和1微克粒性白細胞巨噬細胞集落刺激因子(gm-csf)，或著以可溶形式、或者裝載在5毫克介孔二氧化硅(mps)微粒中，對小鼠接種。滴定抗卵白蛋白血清抗體。裝載有粒性白細胞巨噬細胞集落刺激因子(gm-csf)、胞嘧啶-鳥嘌呤低聚核苷酸(cpg-odn)和ova的介孔二氧化硅(mps)可以引發有力的、長時間的th1和th2抗體反應，分別如igg2a和iggl抗體的高滴定度所示。更令人難忘的是，這些反應在單次注射接種超過200天后仍然明顯。該反應可以與使用氫氧化鋁傳遞的ova相比，這是美國唯一獲批的助劑。雖然介孔二氧化硅(mps)疫苗能夠誘導th1和th2抗體反應，由于其能夠裝載小的細胞因子、蛋白質和dna，通過硫酸鋁誘導的反應是完全th2偏移的。介孔二氧化硅(mps)疫苗用途非常廣泛，并且容易精確的轉變和控制，誘導特異性免疫反應。

圖20a-d是一種散點圖，顯示了使用介孔二氧化硅(mps)疫苗接種能夠誘導t卵泡輔助細胞的擴增。用cfse染色ot-ii脾細胞并適應性傳遞進入thy1.1+受體小鼠中。然后用介孔二氧化硅(mps)和溶菌酶、介孔二氧化硅(mps)和ova，和包括粒性白細胞巨噬細胞集落刺激因子(gm-csf)和cpg的全形式疫苗接種受體小鼠。在疫苗接種三天后，收獲dln并分析適應性傳遞的細胞。這里顯示，接種介孔二氧化硅(mps)和ova的小鼠，接種全形式疫苗的小鼠能夠產生強壯的卵泡t輔助細胞群，這是直接負責“輔助”b細胞分化并成熟為完全功能性抗原特異性抗體分泌的漿細胞。

圖21a-d是一種線狀圖，顯示了使用介孔二氧化硅(mps)疫苗接種能夠誘導cd4+t輔助細胞的克隆擴增。用cfse染色ot-ii脾細胞并適應性傳遞進入thy1.1+受體小鼠中。然后用介孔二氧化硅(mps)和溶菌酶、介孔二氧化硅(mps)和ova，和包括粒性白細胞巨噬細胞集落刺激因子(gm-csf)和cpg的全形式疫苗接種受體小鼠。在疫苗接種三天后，收獲dln并分析適應性傳遞的細胞。據這里所顯示，介孔二氧化硅(mps)和ova，以及全型疫苗都能夠誘導cd4+t輔助細胞有效的顆粒擴增，顯示全身性抗原特異性反應。

圖22a-b是一種線性圖，顯示了介孔二氧化硅(mps)微粒羥基乙酸和乳酸修飾作用幫助生物活性粒性白細胞巨噬細胞集落刺激因子(gm-csf)的釋放。^1微克的粒性白細胞巨噬細胞集落刺激因子(gm-csf)被裝載入5毫克的羥基乙酸或者乳酸修飾的介孔二氧化硅(mps)棒中，并在0.1bsa/pbs中培養。周期性收集上清液并使用酶聯免疫吸附測定(r&d公司)粒性白細胞巨噬細胞集落刺激因子(gm-csf)。與從未修飾的介孔二氧化硅(mps)微粒中釋放的粒性白細胞巨噬細胞集落刺激因子(gm-csf)相比，羥基乙酸和乳酸修飾作用能夠使生物活性粒性白細胞巨噬細胞集落刺激因子(gm-csf)的累積釋放增加超過20倍。

圖23a-d是散點圖，顯示了羥基乙酸修飾的介孔二氧化硅(mps)能夠增加募集的樹突狀細胞(dc)和成熟樹突狀細胞(dc)的百分比。在37度下，5毫克未修飾的或者羥基乙酸修飾的介孔二氧化硅(mps)微粒裝載有1微克粒性白細胞巨噬細胞集落刺激因子(gm-csf)1小時，然后皮下注射入小鼠中。在第7天收獲腳手架并分析。這里證實，修飾的介孔二氧化硅(mps)幾乎使募集的cdllc+cdllb+樹突狀細胞(dc)的百分比加倍，并且，cdllc+cd86+成熟樹突狀細胞(dc)百分比顯著增加。這些結果顯示，介孔二氧化硅(mps)微粒良好的表面修飾能力允許進行進一步募集細胞的表型操作，從而誘導更有效的免疫反應。

具體實施方式

可注射的介孔二氧化硅(mps)-基的微棒在體內隨機自組裝形成3d腳手架。設計該系統從而使該系統釋放細胞因子，募集并短時間內收容免疫細胞，用抗原呈遞他們并用危險信號活化他們。在募集并短時間收容所述細胞或者結構中含有所述細胞之后，這些免疫細胞從裝置結構中遷移出來并定位到淋巴結中。因此，所述組合物是一種細胞在其中來回交流/循環的組合物，他們的免疫活化狀態通過裝置運輸的結果而改變/調節。

在淋巴結中發現抗原特異性樹突狀細胞群落的顯著擴增以及次級淋巴小結的形成，這是通過使用本發明的裝置，在淋巴結中引入卵泡t輔助細胞來實現的。在脾中，抗原識別性cd8+ctl群落也被發現顯著增加了。該系統同樣誘導抗原特異性cd4和cd8t細胞的克隆擴增。除了細胞免疫反應顯著擴增之外，還檢測到產生大量耐受性抗體和平衡性th1/th2反應。

用于調節免疫細胞流通和重新編碼的可注射性介孔二氧化硅微棒-基腳手架系統的基本元素包括：

·介孔二氧化硅(mps)微棒的寬高比(10納米橫截面積除以100微米長度)防止其被吸收，并因此允許局部形成三維結構。

·8納米孔徑，允許吸附那些能夠通過控制的并且連續的方式擴散而傳遞的小分子。

·高表面面積與體積比，允許控制各種細胞因子、危險信號和抗原的裝載。

·介孔二氧化硅(mps)微棒的炎癥性質能夠促進免疫細胞募集，并且不需要其他炎癥性細胞因子。

·介孔二氧化硅(mps)棒表面化學修飾能力的多功能性，可以調節所述棒的性質以及蛋白質與棒的結合方式。

·粒性白細胞巨噬細胞集落刺激因子(gm-csf)的控制釋放可以調節免疫細胞流向腳手架位點。

·胞嘧啶-鳥嘌呤低聚核苷酸(cpg-odn)的控制釋放能夠活化募集的樹突狀細胞。

·募集免疫細胞在腳手架位點可以吸收錨定蛋白質抗原。

據發現，孔徑為大約5-10納米，例如8納米時，對于小分子以及蛋白質的裝載效率達到最佳，例如，粒性白細胞巨噬細胞集落刺激因子(gm-csf)(其分子直徑為大約3納米)。

將懸浮在緩沖液中的微棒進行皮下注射，所述棒隨機堆疊成一種三維結構，所述棒的末端相互之間形成物理接觸，并且在此接觸之間形成一種微空隙。

mps

通過將四乙基原硅酸酯與一種由膠束棒制成的模板發生反應來合成介孔二氧化硅納米顆粒。所得結果是一系列納米尺寸的球或者棒，其中充滿規則排列的小孔。通過溶劑洗滌調節合適的ph值，并因此除去模板。在另一個技術中，所述介孔顆粒可以使用簡單的溶膠-凝膠法或者噴霧干燥法合成。四乙基原硅酸酯還可以與其他的聚合物單體(作為模板)一起使用。其他方法包括美國專利公開號20120264599和20120256336中所描述的那些方法，通過引證在此并入本文。

粒性白細胞巨噬細胞集落刺激因子(gm-csf)

粒性白細胞巨噬細胞集落刺激因子(gm-csf)是一種蛋白質，由巨噬細胞、t細胞、肥大細胞、內皮細胞和成纖維細胞所分泌。具體地說，粒性白細胞巨噬細胞集落刺激因子(gm-csf)是一種細胞因子，可以起到白細胞生長因子的功能。粒性白細胞巨噬細胞集落刺激因子(gm-csf)刺激干細胞產生粒性白細胞和單核細胞。單核細胞從血流中出來，移入組織，并隨后成熟進入巨噬細胞。

這里描述的腳手架裝置包括并且釋放粒性白細胞巨噬細胞集落刺激因子(gm-csf)多肽，用于將宿主樹突狀細胞(dc)吸引到所述裝置中。預計的粒性白細胞巨噬細胞集落刺激因子(gm-csf)多肽是從體內分離的，或者是體內或者體外合成的。內生的粒性白細胞巨噬細胞集落刺激因子(gm-csf)是從健康的人類組織中分離出來的。在將模板dna轉染或者轉化進入宿主有機體或者細胞(例如，哺乳動物或者培養的人細胞系)中之后，體內合成性粒性白細胞巨噬細胞集落刺激因子(gm-csf)多肽。做為選擇，合成性粒性白細胞巨噬細胞集落刺激因子(gm-csf)多肽是使用聚合酶鏈式反應(pcr)或者其他本領域內已知的方法體外合成的sambrook,j.,fritsch,e.f.,和maniatis,t.,molecularcloning:alaboratorymanual(分子克隆：一種實驗操作手冊).coldspringharborlaboratorypress(冷泉港冷泉出版社),ny,第1,2,3卷(1989),通過引證在此并入本文)。

粒性白細胞巨噬細胞集落刺激因子(gm-csf)多肽被修飾以增加體內蛋白質的穩定性。做為選擇，對粒性白細胞巨噬細胞集落刺激因子(gm-csf)多肽進行設計使其具有更多或者更少的免疫原性。內原性的成熟人粒性白細胞巨噬細胞集落刺激因子(gm-csf)多肽是糖基化的，據報道，在氨基酸殘基23(白氨酸)、27(天門冬酰胺)于是39(谷氨酸)處糖基化(參見美國專利第5,073,627號)。相對于糖基化狀態，在一個或者一個以上的氨基酸殘基上修飾本發明的粒性白細胞巨噬細胞集落刺激因子(gm-csf)多肽。

粒性白細胞巨噬細胞集落刺激因子(gm-csf)多肽是重組的。做為選擇，粒性白細胞巨噬細胞集落刺激因子(gm-csf)多肽是哺乳動物粒性白細胞巨噬細胞集落刺激因子(gm-csf)多肽的人源化衍生物。可以衍生粒性白細胞巨噬細胞集落刺激因子(gm-csf)多肽的示范性的哺乳動物種類包括，但是不局限于，小鼠、大鼠、倉鼠、荷蘭豬、白鼬、貓、狗、猴子或者靈長類動物。在一種優選的實施方案中，粒性白細胞巨噬細胞集落刺激因子(gm-csf)是一種重組人蛋白質(peprotech公司，編目號300-03)。做為選擇，粒性白細胞巨噬細胞集落刺激因子(gm-csf)是一種重組鼠科(小鼠)蛋白質(peprotech公司，編目號＃_315-03)。最后，粒性白細胞巨噬細胞集落刺激因子(gm-csf)是重組體小鼠蛋白質人源化的衍生物。

人重組粒性白細胞巨噬細胞集落刺激因子(gm-csf)(peprotech公司，編目＃_300-03)(由下列多肽序列編碼(seqidno：2))：

maparspspstqpwehvnaiqearrllnlsrdtaaemnetvevisemfdlqeptclqtrlelykqglrgsltklkgpltmmashykqhcpptpetscatqiitfesfkenlkdfllvipfdcwepvqe

鼠重組粒性白細胞巨噬細胞集落刺激因子(gm-csf)(peprotech公司，編目＃_315-03)(由下列多肽序列編碼(seqidno：3))：

maptrspttvtrpwkhveaikealnllddmpvtlneevevvsnefsfkkltcvqtrlkifeqglrgnftklkgalnmtasyyqtycpptpetdcetqvttyadfidslkthltdipfeckkpvqk

人內原性的粒性白細胞巨噬細胞集落刺激因子(gm-csf)(由下列mrna序列(ncbi登記號nm_000758和seqidno：4)編碼)：

人內原性的粒性白細胞巨噬細胞集落刺激因子(gm-csf)(由下列氨基酸序列(ncbi登記號np_000749.2和seqidno：5)編碼)：

mwlqsllllgtvacsisaparspspstqpwehvnaiqearrllnlsrdtaaemnetvevisemfdlqeptclqtrlelykqglrgsltklkgpltmmashykqhcpptpetscatqiitfesfkenlkdfllvipfdcwepvqe

胞嘧啶-鳥嘌呤(cpg)低聚核苷酸(cpg-odn)序列

cpg位點是脫氧核糖核酸(dna)區域，在此區域中，基質線性序列沿著其長度方向胞嘧啶核苷緊挨著鳥苷酸(″p″表示他們之間存在的磷酸鍵，并將他們與胞嘧啶-鳥嘌呤互補堿基對相區別)。cpg位點在dna甲基化過程中發揮關鍵作用，這是細胞用來靜止基因表達的一些內源性機制中的一個。啟動子元素內cpg位點的甲基化能夠使基因靜止。在癌癥的情況下，已知腫瘤抑制基因通常是靜止的，而致癌基因或者癌癥誘導基因被表達。重要地，已經證實腫瘤抑制基因(預防癌癥形成的基因)啟動子區域中的cpg位點是被甲基化的，而在某些癌癥中致癌基因啟動子區域中的cpg位點是低甲基化的或者未甲基化的。toll樣受體(tlr)-9受體結合dna中未甲基化的cpg位點。

這里描述的疫苗組合物包括cpg低聚核苷酸。cpg低聚核苷酸是從體內分離的，或者是體內或者體外合成的。示范性的內源性cpg低聚核苷酸來源包括，但是不局限于，微生物、細菌、真菌、原生蟲、病毒、霉菌或者寄生蟲。或者，內源性的cpg低聚核苷酸是從哺乳動物良性或者惡性贅生性腫瘤中分離出來的。合成的cpg低聚核苷酸是在將模板dna轉染或者轉化入宿主有機體內之后，在體內合成的。做為選擇，合成性cpg低聚核苷酸是使用聚合酶鏈式反應(pcr)或者其他本領域內已知的方法體外合成的(sambrook,j.,fritsch,e.f.,和maniatis,t.,molecularcloning:alaboratorymanual(分子克隆：一種實驗操作手冊).coldspringharborlaboratorypress(冷泉港冷泉出版社),ny,第1,2,3卷(1989),通過引證在此并入本文))。

呈遞cpg低聚核苷酸用于樹突狀細胞的胞內吸收。例如，使用無保護的cpg低聚核苷酸。術語“無保護的”用于描述一種分離的內源性或者合成的多聚核苷酸(或者低聚核苷酸)，其上不含有額外的取代基。在另一個實施方案中，cpg低聚核苷酸與一種或者一種以上化合物相結合，增加細胞吸收的效率。做為選擇或者另外，cpg低聚核苷酸與一種或者一種以上的化合物結合，增加腳手架和/或樹突狀細胞內低聚核苷酸的穩定性。在細胞吸收之前，選擇性地濃縮cpg低聚核苷酸。例如，使用聚(氮丙啶)(pei)濃縮cpg低聚核苷酸，所述聚(氮丙啶)(pei)是一種陽離子聚合物，能夠增加樹突狀細胞的細胞吸收的效率。

cpg低聚核苷酸可以被分成多個種類。例如，本發明組合物、方法和裝置中包括的示范性的cpg-odns是刺激性的、中性的或者抑制性的。這里的術語“刺激性的”用于描述一類能夠活化tlr9的胞嘧啶-鳥嘌呤低聚核苷酸(cpg-odn)序列。這里的術語“中性的”用于描述一類不能活化tlr9的胞嘧啶-鳥嘌呤低聚核苷酸(cpg-odn)序列。這里的術語“抑制的”用于描述一類能夠抑制tlr9的胞嘧啶-鳥嘌呤低聚核苷酸(cpg-odn)序列。術語“活化的tlr9”描述了一種方法，使用此方法tlr9能夠引起細胞內的信號傳導。

刺激性胞嘧啶-鳥嘌呤低聚核苷酸(cpg-odn)可以進一步被分成三種類型，a、b和c，這些類型在免疫刺激活性方面有所不同。a類刺激性cpg低聚核苷酸(odns)的特點在于包括磷酸二酯中心性cpg的回文結構部分和一種硫代磷酸3'聚-g線。在tlr9活化之后，這些胞嘧啶-鳥嘌呤低聚核苷酸(cpg-odn)誘導漿樣樹突狀細胞(pdc)中產生高產量的ifn-α。a類胞嘧啶-鳥嘌呤低聚核苷酸(cpg-odn)微弱地刺激tlr9-依賴性的nf-κb信號傳導。

b型刺激性胞嘧啶-鳥嘌呤低聚核苷酸(cpg-odn)包括一種全硫代磷酸主鏈，具有一種或者一種以上cpg二核苷酸。在tlr9活化后，這些cpg-odns有力的刺激b細胞。與a類胞嘧啶-鳥嘌呤低聚核苷酸(cpg-odn)不同，b類胞嘧啶-鳥嘌呤低聚核苷酸(cpg-odn)微弱地刺激ifn-α分泌。

c類刺激性胞嘧啶-鳥嘌呤低聚核苷酸(cpg-odn)包括a和b類的特征。c類胞嘧啶-鳥嘌呤低聚核苷酸(cpg-odn)包括一種全硫代磷酸主鏈和一種包括cpg的回文結構部分。與a類胞嘧啶-鳥嘌呤低聚核苷酸(cpg-odn)相似，c類胞嘧啶-鳥嘌呤低聚核苷酸(cpg-odn)誘導pdc產生大量的ifn-α。與b類胞嘧啶-鳥嘌呤低聚核苷酸(cpg-odn)相似，c類胞嘧啶-鳥嘌呤低聚核苷酸(cpg-odn)誘導強烈的b細胞刺激。

示范性的刺激性cpgodns包括，但是不局限于，odn1585、odn1668、odn1826、odn2006、odn2006-g5、odn2216、odn2336、odn2395、odnm362(都來自invivogen)。本發明還包括前述cpg低聚核苷酸(odns)任何人源化的版本。在一個優選的實施方案中，本發明的組合物、方法和裝置包括odn1826(其序列從5'到3'是tccatgacgttcctgacgtt，其中cpg元素用黑體表示，seqidno:10)。

不刺激tlr9的中性或者參照cpgodns被包括在本發明中。這些低聚核苷酸(odns)包括與其刺激性對應物相同的序列，但是不含有cpg二核苷酸，而是含有gpc二核苷酸。

本發明所包括的示范性的中性或者參照cpgodns包括，但是不局限于，odn1585參照物、odn1668參照物、odn1826參照物、odn2006參照物、odn2016參照物、odn2336參照物、odn2395參照物、odnm362參照物(都來自invivogen)。本發明還包括前述cpg低聚核苷酸(odns)任何人源化的版本。

抗原

這里所描述的組合物、方法和裝置中包括腫瘤抗原或者其他抗原。在施用這種裝置的患者體內，抗原引發保護性免疫或者產生治療免疫反應。優選的腫瘤抗原是腫瘤細胞溶解產物(參見，例如，aliet.al,2009,naturematerials8,151-158；通過引證在此并入本文)。例如，從人類患者(或者非人動物)中提取全腫瘤樣品或者腫瘤活組織切片樣品，并使用膠原酶消化，降解胞外基質。然后，所述腫瘤細胞經歷三次冷凍融化過程循環，其中，細胞在液氮中冷凍，然后在水浴中解凍。該過程產生腫瘤抗原，然后將腫瘤抗原與粒性白細胞巨噬細胞集落刺激因子(gm-csf)和cpgodn一起裝載在介孔二氧化硅(mps)顆粒上。例如，腫瘤細胞溶解產物抗原的疫苗劑量是獲得1x10⁶個腫瘤細胞。在制備mps顆粒之后，將此顆粒懸浮在生理學可接受性緩沖液(例如，pbs)中，然后向棒的懸浮液中加入募集化合物(例如，粒性白細胞巨噬細胞集落刺激因子(gm-csf))、活化化合物(例如，cpg)和抗原。在室溫下搖動混合物整夜，然后冷凍干燥大約4小時。在給藥之前，將棒在此懸浮在緩沖液中，然后將懸浮液裝載進入1毫升注射器(18號針)中。通常，每次注射的混合物疫苗劑量是150微升。

本發明的組合物、方法和裝置中包括的示范性的癌癥抗原包括，但是不局限于，從活體檢查中提取的腫瘤溶解產物、照射的腫瘤細胞、抗原的mage系列(例如mage-1)、mart-1/梅拉納、酪氨酸酶、神經節苷脂、gp100、gd-2、o-乙酰化gd-3、gm-2、muc-1、sos1、蛋白激酶c-結合蛋白、反轉錄酶蛋白質、akap蛋白質、vrk1、kiaa1735、t7-1、t11-3、t11-9、現代人端粒酶發酵產物(htrt)、細胞角蛋白-19(cyfra21-1)、鱗狀細胞癌抗原1(scca-1)、(蛋白質t4-a)、鱗狀細胞癌抗原2(scca-2)、卵巢癌抗原ca125(1a1-3b)(kiaa0049)、粘蛋白1(腫瘤相關的粘蛋白)、癌-相關的粘蛋白)、(多形態上皮細胞粘蛋白)、(pem)、(pemt)、(episialin)、(腫瘤相關的上皮細胞膜抗原)、(ema)、(h23ag)、(花生反應性的尿粘蛋白)、(pum)、(乳腺癌相關的抗原df3)、ctcl腫瘤抗原se1-1、ctcl腫瘤抗原se14-3、ctcl腫瘤抗原se20-4、ctcl腫瘤抗原se20-9、ctcl腫瘤抗原se33-1、ctcl腫瘤抗原se37-2、ctcl腫瘤抗原se57-1、ctcl腫瘤抗原se89-1、前列腺特異性膜抗原、5t4癌坯滋養層糖蛋白、orf73皮膚多發性出血性肉瘤相關的皰疹病毒、mage-c1(癌癥/睪丸抗原ct7)、mage-b1抗原(mage-xp抗原)(dam10)、mage-b2抗原(dam6)、mage-2抗原、mage-4a抗原、mage-4b抗原、結腸癌抗原ny-co-45、肺癌抗原ny-lu-12變體a、癌癥相關的表面抗原、腺癌抗原art1、伴生腫瘤相關的腦-睪丸-癌癥抗原(旁瘤抗原ma2；伴生腫瘤神經元抗原)、神經腫瘤腹部抗原2(nova2)、肝細胞癌抗原基因520、腫瘤相關的抗原co-029、腫瘤相關的抗原mage-x2、滑膜肉瘤、x斷點2、t細胞識別的鱗狀細胞癌抗原、血清學檢測的結腸癌抗原1、血清學檢測的乳癌抗原ny-br-15、血清學檢測的乳癌抗原ny-br-16、嗜鉻粒蛋白a；甲狀旁腺分泌的蛋白質1、dupan-2、ca19-9、ca72-4、ca195、癌胚抗原(cea)。純化的腫瘤抗原可以單獨被是用或者彼此結合使用。

所述系統還可以有效用于產生針對其他抗原(例如，微生物病原體，比如細菌、病毒、真菌)的免疫反應。

下列材料和方法用于產生這里描述的數據。

介孔二氧化硅(mps)腳手架的制備

在室溫下，將pluronicp-123(sigma-aldrich公司)表面活性劑溶解在1.6mhcl中，然后加熱至40℃。加入42毫摩爾正硅酸乙酯(teos)(sigma-aldrich公司)，在40℃下加熱20分鐘，同時攪拌(600rpm)。然后將組合物加熱到100℃，24小時。通過過濾收集棒狀顆粒，在室溫條件下空氣干燥。80℃下，將顆粒在乙醇/鹽酸(5部分hcl比500部分乙醇)中提取過夜。或者，在100％乙醇中，在550℃下煅燒顆粒4小時。所述mps組合物可以在加入募集化合物和/或活化化合物之前或之后，并且在加入抗原之前或者之后被儲存并運輸使用。例如，如果抗原是有來自病人的活組織檢查樣品制備的腫瘤細胞溶解產物，他可以被處理并在對病人施用前很短時間加入到mps顆粒中。

對于全型疫苗組合物，1微克/鼠gm-csf、100微克/鼠cpg-odn和130微克/鼠的卵清蛋白與5毫克/鼠mps一起在dh2o中培養12小時，冷凍干燥12小時，重新懸浮在150微升/鼠pbs中，用18g針頭皮下注射。

為了確定gm-csf和cpg-odn從mps棒中釋放的動力學，放射活化的i-標記的重組人gm-csf被用作示蹤劑，然后進行標準釋放研究。相似的，通過使用nanodrop儀(nd1000,nanodroptechnologies公司)的吸光讀數確定釋放進入pbs的cpg-odn的量。

mps微顆粒的修飾作用

使用1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)二亞胺碳(edc)標準化學品來活化羥基乙酸和乳酸上的羧酸。使用胺丙基硅烷對mps顆粒進行氨基修飾。然后室溫下將兩種組分混合在一起，過夜反應。然后允許顆粒風干。將所得的羥基乙酸和/或乳酸修飾的顆粒與gm-csf或其他上面描述的化合物相接觸。

體外樹突狀細胞(dc)活化試驗

使用20納克/毫升的gm-csf將鼠樹突狀細胞(dc)從骨髓細胞中分化出來。分化的樹突狀細胞以10⁶/毫升的濃度與100微克/毫升mps顆粒一起培養18小時，然后使用流式細胞儀分析cd11c(ebiosciences公司，圣地亞哥，加利福尼亞州)、cd86(ebiosciences公司，圣地亞哥，加利福尼亞州)和mhc類-ii(ebiosciences公司，圣地亞哥，加利福尼亞州)的表達。

分析mps腳手架募集的樹突狀細胞及其向淋巴結的遷移

從動物體內取回mps腳手架然后通過機械分離的方式消化棒中細胞。apc共軛的cd11c(樹突狀細胞標記物)、fitc共軛的mhc類-ii和pe共軛的cd86(b7，共刺激分子)染色被用于樹突狀細胞和白細胞募集分析。根據陽性異硫氰酸熒光素(fitc)，異藻藍蛋白(apc)和藻紅蛋白(pe)，使用同型參照對細胞進行分類，記錄對每種表面抗原染色呈陽性的細胞百分比。

為了確定淋巴結中是否存在抗原特異性樹突狀細胞，收獲引流淋巴結(dln)并用apc共軛的cd11c和pe共軛的siinfekl-mhc類-i(ebiosciences公司，圣地亞哥，加利福尼亞州)進行分析。

抗原特異性cd8+脾t細胞的分析

收獲并消化脾。在裂解血紅細胞之后，使用pe-cy7共軛的cd3(ebiosciences公司，圣地亞哥，加利福尼亞州)、apc共軛的cd8(ebiosciences公司，圣地亞哥，加利福尼亞州)、pe共軛的siinfekl(seqidno:)mhc類-i四聚體(beckmancoulter公司)分析脾細胞。siinfekl是一種卵清蛋白衍生的肽[ova(257-264)]。

cd4+或者cd8+t細胞克隆擴增的分析

收獲來自ot-ii(對于cd4)或者ot-i(對于cd8)轉基因c57bl/6鼠(jackson實驗室)的脾，消化、匯集并用細胞示蹤劑羧基熒光素琥珀酰亞胺酯(cfse)染色。在免疫2天之后，20xl0⁶個染色的脾細胞/小鼠被靜脈注射入c57bl/6鼠(jackson實驗室)中。靜脈注射4天之后，回收dln和脾，然受使用pe共軛的cd8或者cd4標記物分析。

抗-ova體液免疫反應的特點

使用卵清蛋白包覆的平板elisa分析血清中的igg1和igg2a抗體。抗體滴定度定義為elisa的od讀數>0.3(空白)的最低血清稀釋程度。

其他實施方案

盡管本發明已經結合具體實施方式進行了描述，但之前的描述只起到解釋作用并不能限制本發明的范圍，本發明的范圍由所附權利要求書定義。其他的方面、優勢和修飾也被包括在所附權利要求書記載的范圍內。

這里所涉及的所有專利和科技文獻構成了本領域普通技術人員能夠獲得的知識。這里引用的所有美國專利和公開的或者未公開的美國專利申請通過引證在此并入本文。這里引用的所有公開的外國專利和專利申請在此通過引證全部并入本文。genbank和ncbi指明的登記號碼也通過引證在此并入本文。這里引用的其他出版的參考文獻、文件、原稿和科學文獻通過引證在此并入本文。

盡管本發明已經參照其優選的實施方案進行了具體的顯示和表述，但是本領域普通技術人員應該理解，在不脫離本發明范圍的情況下，在形式和細節上可以存在各種各樣的變化，本發明的范圍由所附的權利要求書概括。