本發明涉及生物技術領域，具體指一種prdm15基因序列在制備nf-κb抑制劑中的應用。

背景技術：

轉錄因子nf-κb廣泛存在于不同種類的細胞中，它可以調控細胞的免疫應答，參與炎癥反應，抑制細胞凋亡，調控細胞分化等功能。在哺乳動物細胞內nf-κb家族有5個同源蛋白：rela(p65)，relb，crel，還有p52和p50的前提蛋白nf-κb1(p105)，nf-κb2(p100)(oeckinghausa,haydenms,ghoshs.crosstalkinnf-[kappa]bsignalingpathways[j].natureimmunology,2011,12(8):695-708.)。所有nf-κb家族蛋白都具有rel(relhomologyregion)同源結構域，可以和dna結合，形成二聚體以及與抑制蛋白iκbα結合。nf-κb家族蛋白互相之間可以形成同源或者異源二聚體，通常所說的nf-κb蛋白是p65：p50組成的異源二聚體(陳丹英,翟中和,舒紅兵.nf-κb激活的調節機理[j].科學通報,2003,48(18):1893-1911.)。nf-κb能夠被多種刺激因子激活，包括腫瘤壞死因子(tnfα，tumornecrosisfactorα)，細菌及細菌脂多糖lps(lipopolysaccharide)，白細胞介素-1(il-1，interlukin-1)，病毒顆粒和病毒基因，雙鏈rna(dsrna)，生理生化脅迫等。在正常生理狀態下，nf-κb二聚體與抑制蛋白iκbα結合，掩蓋了nf-κb的核定位序列nls，使得nf-κb滯留在細胞質中(oeckinghausa,haydenms,ghoshs.crosstalkinnf-[kappa]bsignalingpathways[j].natureimmunology,2011,12(8):695-708.)。當細胞受到外界刺激，如tnfα、il-1、lps，iκbα蛋白被iκκs(iκbkinase)復合物磷酸化修飾發生泛素化降解，nf-κb蛋白被釋放并遷移到細胞核內，激活下游靶基因的表達。

prdm蛋白家族成員的n端都具有保守的pr結構域，該結構域與組蛋白甲基轉移酶的set結構域同源。(fogck,galligg,lundah.prdmproteins:importantplayersindifferentiationanddisease[j].bioessays,2012,34(1):50-60.)因此，prdm家族的蛋白也被歸屬為set家族蛋白的亞家族。在靈長類動物中prdm家族蛋白有17個成員。但是，和很多具有set結構域的蛋白不一樣，目前發現只有少數幾個prdm家族蛋白具有組蛋白甲基化酶活性(hohenauert,mooreaw.theprdmfamily:expandingrolesinstemcellsanddevelopment[j].development,2012,139(13):2267-2282.)。關于為什么大部分prdm家族的蛋白并沒有組蛋白甲基轉移酶活性這一點，目前的研究還不是特別清楚。

prdm2和prdm8可以介導組蛋白h3k9的二甲基化修飾，與基因表達抑制相關；prdm9可以介導組蛋白h3k4的三甲基化修飾，與基因表達激活相關。prdm1，prdm5，prdm6這些自身沒有組蛋白甲基化酶活性的prdm家族蛋白可以和g9a，lsd1，hdac1，hdac2，hdac3等相互作用，調控組蛋白修飾(i,wuj,fejérg,etal.prdi-bf1recruitsthehistoneh3methyltransferaseg9aintranscriptionalsilencing[j].natureimmunology,2004,5(3):299-308.)(involvementofhistonedemethylaselsd1inblimp-1-mediatedgenerepressionduringplasmacelldifferentiation)。很多prdm家族蛋白也可能對非組蛋白底物進行翻譯后修飾。

目前發現prdm家族蛋白在維持胚胎干細胞的干性和干細胞分化中都有很重要的作用。全基因組chip-seq測序發現，prdm14與oct4，nanog這些超級轉錄因子在控制干細胞更新和分化的基因上具有共定位。還有研究表明prdm1和prdm14可以影響生殖細胞的特化過程，prdm9與減數分裂過程中的染色體聯會有關。prdm家族蛋白還和血管生成，神經系統發育，癌癥發生過程密切相關。

技術實現要素：

本發明的目的在于提供一種prdm15基因序列在制備nf-κb抑制劑中的應用，通過抑制nf-κb基因的的活性來影響細胞的抗病毒天然免疫反應。

本申請的發明人長期致力于表觀遺傳修飾酶在抗病毒天然免疫方面的研究。我們之前已經發現組蛋白甲基轉移酶mll1可以調控nf-κb信號通路(wangx,zhuk,lis,etal.mll1,ah3k4methyltransferase,regulatesthetnfα-stimulatedactivationofgenesdownstreamofnf-κb[j].jcellsci,2012,125(17):4058-4066.)。通過大規模的篩選，我們發現prdm15基因的過表達可以顯著抑制tnfα和仙臺病毒引起的nf-κb信號通路激活。敲除prdm15之后，在tnfα和仙臺病毒刺激下，nf-κb通路激活程度顯著增加。我們關于prdm15基因的研究為抗病毒治療提供了新的靶點。

本發明提供了一種prdm15基因序列在制備nf-κb抑制劑中的應用，其基因序列如seqidno.1所示。prdm15是prdm家族蛋白，屬于set結構域蛋白家族。prdm15具有潛在的組蛋白甲級轉移酶活性。

在293frt細胞中過表達prdm家族蛋白，通過雙熒光報告基因系統篩選能夠調控nf-κb的基因。結果顯示，prdm15的高表達可以顯著抑制nf-κb的活性。此后，我們構建了prdm15過表達的質粒，然后通過磷酸鈣轉染的方法將質粒轉入293frt細胞內，在293frt細胞中過表達prdm15基因。我們發現，與表達空載體相比較，過表達prdm15基因后，在不同時間點，nf-κb下游調控基因a20和ciap2的mrna表達量都有所降低，prdm15可以抑制tnfα誘導的nf-κb活化。prdm15基因突變之后，nf-κb激活的抗病毒免疫反應增強。這提示，以prdm15作為靶點，治療由nf-κb通路功能失調引起的疾病的可能性。

本發明還提供了包含prdm15基因序列的質粒在制備nf-κb抑制劑中的應用。

prdm15質粒的載體有多種選擇，本發明中優選的載體信息為prk質粒，插入時選取的酶切位點為f：sali；r：xhoi。

本發明還提供了prdm15基因的短片段在制備nf-κb抑制劑中的應用，所述prdm15基因的短片段的序列如seqidno.3所示，以及包含prdm15基因的短片段的質粒在制備nf-κb抑制劑中的應用。

本發明的有益效果：通過發現一種新的調控nf-κb信號通路的基因prdm15，提供了prdm15基因序列在制備nf-κb抑制劑中的應用。nf-κb信號通路的功能失調與很多疾病都密切相關，prdm15基因為發現為治療這些疾病提供了新的靶點信息。

附圖說明

圖1為prdm15抑制tnfα和il-1β誘導nf-κb激活的效果圖。

圖2a為prdm15抑制nf-κb下游靶基因a20表達的效果圖。

圖2b為prdm15抑制nf-κb下游靶基因ciap2表達的效果圖。

圖3a為外源表達flag標簽prdm15抑制sev誘導的ifnβ基因表達的效果圖。

圖3b為外源表達flag標簽prdm15基因的蛋白表達量westernblot檢測結果照片。

圖4a為外源表達ha標簽prdm15抑制sev誘導的ifnβ基因表達的效果圖。

圖4b為外源表達ha標簽prdm15基因的蛋白表達量westernblot檢測結果照片。

圖5a為prdm15敲除細胞系的westernblot檢測結果照片。

圖5b為prdm15野生型和prdm15敲除細胞系對tnfα介導的nf-κb激活的影響的效果圖。

圖6a為prdm15蛋白truncation實驗模式圖。

圖6b為雙熒光報告系統檢測prdm15不同片段對nf-κb信號調控效果的比較圖。

圖6c為prdm15不同片段肽段的表達的westernblot檢測結果照片。

具體實施方式

下面結合附圖和具體實施例對本發明作進一步的詳細說明，以下實施例是對本發明的解釋而本發明并不局限于以下實施例。

實施例1

(1)構建質粒

構建prdm15的質粒，載體信息：prk-flag，prdm15基因序列如seqidno.1所示，得到帶flag標簽的prdm15質粒。

步驟如下：

①在ncbi數據庫查找目的基因prdm15的cdna序列

②通過primer3軟件設計prdm15的擴增引物

③在cdna文庫中克隆prdm15的編碼序列，pcr擴增體系如下：

a)cdna1ul

b)ddh2o32.5ul

c)5xbuffer10ul

d)dntp4ul

e)f-primer1ul

f)r-primer1ul

g)rtaqenzyme0.5ul

④pcr反應程序：

⑤pcr結束之后，產物進行瓊脂糖凝膠電泳，切割目的條帶并回收產物。

⑥通過sali和xhol切割載體，酶切體系如下：

a)目的載體，1ug

b)sali，1ul

c)xhol，1ul

d)10xbuffer，2ul

e)ddh2o，15ul

4℃酶切12小時以上。

⑦酶切反應結束之后，通過瓊脂糖凝膠電泳回收酶切之后的載體。

⑧目的dna和酶切之后的載體連接：

a)目的dna片段，1ul

b)載體dna，1ul

c)10xt4dnaligasebuffer，1ul

d)t4dnaligase，1ul

e)ddh2o，6ul

16c°連接12小時以上。

⑨將連接產物轉化至感受態大腸桿菌中，進行擴增。

a)取出新制備的感受態菌株dh5α，于冰上快速解凍，加入一定量的質粒混勻，4℃靜至10min；

b)然后42℃熱激90s，再迅速放回冰盒中，靜至1～2min；

c)最后將菌液涂至相應抗性的平板，37℃培養12-16h；

d)挑取單克隆至lb或tb液體培養基中，37℃，220rpm培養過夜；

e)離心收集菌液，并用試劑盒提取質粒，nanodrop測定濃度。

(2)轉染

在293frt細胞中轉染實施例1中得到的帶flag標簽的prdm15質粒、連有κb原件的質粒pgl3-nf-κb及內參質粒pgl3-tk，轉染步驟如下。

磷酸鈣轉染的操作流程：

1.轉染前的一天，以合適的密度，將細胞接種到6孔板。

2.12～14小時之后，在顯微鏡下觀察細胞。當細胞的密度達到合適的狀態時(30％～40％)，準備轉染。

3.將轉染試劑2×hbs和cacl2分裝至100μl每孔。cacl2稀釋至0.25m濃度，加入相應的質粒吹打均勻。

4.將包含質粒的cacl2溶液一邊旋轉一邊逐滴加入2×hbs中，用移液器向懸液內吹打8～10次。對于逆轉錄病毒，目的質粒：zv77比例為2μg：1μg。對于慢病毒感染，目的質粒：pspax：pmd.g比例為2μg：1μg：1μg。

5.將配置好的懸液，逐滴加入細胞培養皿中，輕輕搖晃均勻，在37℃培養。

6.轉染之后6～8小時，更換新鮮的培養基。

(3)il-1β和tnfα處理

轉染20h后分別加入10ng/ml的il-1β和tnfα處理12h，收集細胞檢測雙熒光素酶活性，結果如圖1所示，pbs對照、il-1β和tnfα的三組中左側柱形代表空載體vector，右側為prdm15質粒，prdm15可以抑制tnfα和il-1β誘導的nf-κb激活。*p值<0.05；**p值<0.01。

實施例2

在hct116細胞中分別轉染空載體和實施例1中得到的帶flag標簽的prdm15質粒(轉染過程同實施例1)，20h后加入tnfα處理0小時，1小時，2小時，4小時，提取rna，逆轉錄，實時熒光定量pcr檢測nf-κb下游基因a20和ciap2的表達，結果如圖2a、2b所示，prdm15可以抑制nf-κb下游靶基因a20及ciap2。*p值<0.05；**p值<0.01。

實施例中的rna提取、逆轉錄、實時熒光定量pcr步驟如下：

(1)細胞總rna的提取：

1.將細胞用加入1％β-巰基乙醇的裂解液裂解。

2.細胞裂解液用1ml的注射器抽打10-20次，打斷dna，提高rna的得率。

3.加入等體積的70％乙醇，吹打混勻。

4.將裂解液加入到吸附柱，12000rpm離心30秒。

5.加入500μl去蛋白液，12000rpm離心30秒。

6.加入500μl漂洗液，12000rpm，離心30秒。重復此步驟一次。

7.12000rpm離心2分鐘，室溫下干燥5分鐘，除去殘留的乙醇，防止影響洗脫效果以及后續的實驗。

8.加入50～100μl，預熱的depc水，12000rpm離心1分鐘洗脫rna。

9.重復洗脫一次。

10.提取的rna立即放置于冰上，進行后續的實驗。rna可以在-80℃保存。

逆轉錄合成cdna：

1.取1μg總的rna，加入0.5μlrandom引物，0.5μloligo(dt)，用depc水補充至13.5μl。

2.72℃孵育2分鐘，迅速放置于冰上。

3.加入0.5μlrnase抑制劑，1μldntps，1μlrevtra逆轉錄酶，4μl5xbuffer，吹打混勻。

4.42℃反應1小時，95℃處理5分鐘滅活逆轉錄酶。

得到的cdna產物可放置于-80℃。

(2)實時定量pcr檢測：

1.準備工作：準備好無菌槍頭、96孔板、壓膜刮，預熱機器；

2.配制引物混合液：將正反引物等量混勻，稀釋至5μmol；

3.點樣：將引物、模板、mix依次加入96孔板中，封膜，離心混勻；

4.上機：將裝有樣品的96孔板置于樣品槽中，設置程序后開始real-time，待反應完畢后分析數據。

實施例3

1)在293t細胞中轉染帶flag標簽的prdm15質粒(轉染過程同實施例1)、pgl3-nf-κb和pgl3-tk，轉染20h后加入仙臺病毒(sev)刺激12h，用promega公司的試劑盒檢測雙熒光素酶活性，結果如圖3a所示，外源表達flag標簽prdm15可以抑制sev誘導的ifnβ基因表達。

2)對檢測完雙熒光素酶活性后的細胞裂解液進行收集，用westernblot檢測prdm15和內參β-actin的蛋白表達。

(westernblot)免疫印跡實驗過程如下：

1.蛋白樣品的制備：棄dmem，用pbs洗細胞一次，棄pbs，然后用細胞刮子收集細胞，3000rpm離心1～5min，棄上清，加入50μlpbs和50μl2×sdsloadingbuffer，95℃煮樣10min。

2.sds-page膠的制作：配制10％分離膠混合液，混勻后灌入膠版中，用h2o進行液封，待其凝固后配制5％的濃縮膠，混勻后灌入膠版中，插入梳子，待濃縮膠凝固后拔出梳子備用；

3.電泳：固定好膠板，檢查其是否漏水，確定其不漏水后將其置于電泳槽中，加入電泳緩沖液，在點樣孔中點上蛋白樣品，接通電源，先以低壓跑膠，帶樣品過濃縮膠后換高壓跑膠。

4.轉膜：電泳完畢后取出蛋白膠，浸與轉膜液中，在轉膜以上鋪好用轉膜液潤濕的濾紙、蛋白膠、nc膜、濾紙，然后進行轉膜。

5.封閉：轉膜完畢后，nc膜用tbst漂洗3次，然后用15ml5％的脫脂牛奶室溫封閉15min；

6.一抗孵育：封閉完畢后用tbst將nc膜洗3次，每次10min，用10mltbst配制抗體，然后加入到置有nc膜的抗體孵育盒中，室溫孵育一個小時，然后用tbst漂洗，洗3次，每次10min；

7.二抗孵育：用10mltbst配制抗體，然后加入到置有nc膜的抗體孵育盒中，室溫孵育一個小時，然后用tbst漂洗，洗3次，每次10min；

顯影：用辣根過氧化物化學發光底物其將nc膜潤濕，暗室顯影。結果如圖3b所示，外源flag標簽prdm15基因的蛋白表達量檢測結果，在轉入flag-prdm15質粒的細胞中，都能檢測到prdm15的蛋白表達，證明我們轉染是成功。

實施例4

1)在293t細胞中轉染帶ha標簽的prdm15質粒(載體信息為prk-ha，質粒構建及轉染過程同實施例1)、pgl3-nf-κb和pgl3-tk，轉染20h后加入仙臺病毒(sev)刺激12h，用promega公司的試劑盒檢測雙熒光素酶活性，結果如圖4a所示，外源表達ha標簽prdm15可以抑制sev誘導的ifnβ基因表達。

2)對檢測完雙熒光素酶活性后的細胞裂解液進行收集，用westernblot檢測prdm15和內參β-actin的蛋白表達。結果如圖4b所示，外源ha標簽prdm15基因的蛋白表達量檢測結果，在轉入ha-prdm15質粒的細胞中，都能檢測到prdm15的蛋白表達，證明我們轉染是成功。

實施例5

利用crispr-cas構建prdm15敲除細胞系單克隆細胞株，在prdm15野生型和敲除的細胞系里面加入10ng/mltnf-α，處理30min，westernblot檢測內源prdm15的蛋白表達，結果如圖5a所示，

在prdm15野生型和prdm15敲除的細胞系里轉染帶flag標簽的prdm15質粒(實施例1中構建的)、pgl3-nf-κb及pgl3-tk，20h后加入tnfα處理12h，收集細胞檢測雙熒光素酶活性，結果如圖5b所示，prdm15敲除之后可以增強tnfα介導的nf-κb激活。

實施例6

(1)根據不同的功能結構域構建prdm15的截短片段表達質粒。實驗模式圖如圖6a。

分別截取86～491aa段(基因序列如seqidno.2所示)，492～862aa段(基因序列如seqidno.3所示)，863～1178aa段(基因序列如seqidno.4所示)，三段短片段，以prk-flag為載體，構建三個質粒(質粒構建過程同實施例1)。

(2)在293t細胞中分別轉染帶有flag標簽的prdm15全長(fl)以及截短的片段，24h后往培養基中分別加入10ng/ml的il-1β和tnfα處理細胞12h，收集細胞檢測熒光素酶活性。p值是與轉空載體的細胞相比較計算出來的，*p值<0.05；**p值<0.01。

結果圖5b所示，prdm15的492～862aa段短片段具有近似prdm15全長的抑制效果。

(3)檢測完雙熒光素酶活性后，收集細胞裂解液，westernblot檢測prdm15不同片段肽段和內參β-actin的蛋白表達，結果如圖6c所示。

sequencelisting

<110>武漢奧秘克生物科技有限公司

<120>prdm15基因序列在制備nf-kb抑制劑中的應用

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