本發明涉及一種針對離體培養細胞的晝夜節律相位測量方法和模擬晝夜裝置，屬于離體細胞晝夜節律研究領域。

背景技術：

1、目前,對于生物體的晝夜節律相位和時鐘基因的研究方法因設備和條件限制只能在活體上進行研究，然而，越來越多的證據表明外周組織和細胞可以不通過中樞控制而存在獨立的晝夜節律相位周期和振幅，因此目前的技術對于研究離體培養細胞的晝夜節律相位、周期、振幅是本身存在光感受亦或是受中樞控制是缺乏說服力的，急需加以解決。

技術實現思路

1、本發明提供一種針對離體培養細胞的晝夜節律相位測量方法和模擬晝夜裝置，以解決傳統方法無法針對離體培養細胞進行晝夜節律相位周期和振幅等研究的問題。

2、為解決上述問題，擬采用這樣一種針對離體培養細胞晝夜節律相位的測量方法，具體步驟如下：

3、(1)通過原代細胞提取技術提取并純化目的細胞。

4、(2)通過細胞培養技術使目的細胞在培養箱中合適的器皿內貼壁生長，當細胞匯合度75％-85％時傳代培養，直至細胞數量滿足研究需要的分組數。

5、(3)將模擬晝夜照明的裝置放置于培養箱中，培養的細胞置于裝置內，通過所述裝置模擬晝夜的光暗周期循環；

6、(4)細胞收集與處理：在模擬的光暗周期下培養3-5天后，按照不同的時間點收集細胞，進行離心和總rna提取，這個步驟是為了捕捉細胞在不同時間點的基因表達情況。

7、(5)qrt-pcr：通過熒光定量pcr技術測量基因表達量，ct值(閾值周期)是衡量基因表達水平的一個重要參數，表達量高的基因ct值低，反之則高。

8、(6)余弦統計分析法和cosinor軟件擬合：使用cosinor軟件和余弦分析函數模型來擬合數據，從而得到基因表達的節律、相位、振幅和中位數。

9、前述方法中，所述目的細胞是人體或動物體的表皮細胞；

10、前述方法中，所述目的細胞是人原代角質形成細胞，培養箱中的培養環境為5％co2的空氣、36.8℃的恒定培養環境；

11、上述步驟(4)中，按照上述模擬光暗周期循環的環境下培養3-5天后，使目的細胞出現與光暗循環規律一致的晝夜節律，在方案的最后24小時按不同的時間點使用胰蛋白酶消化法收取多組細胞，1000rap/min離心5分鐘，棄上清液后將細胞沉淀用于最終測量晝夜節律相位、周期、振幅；

12、上述步驟(4)中，在方案的最后24小時按8：00、13：00、18：00、23：00、4：00、9：00共6組時間點，使用胰蛋白酶消化法收取對應的6組細胞；

13、前述方法中，在收集完多組細胞后，首先需要提取細胞中的總rna，rna是基因表達的直接產物，總rna包含了細胞中所有類型的rna(mrna、rrna、trna等)；使用rna提取試劑盒(如trizol、rneasy等)按照制造商的指南進行操作，這些試劑盒通常包含裂解液、分離液和洗滌液，能夠從細胞中提取并純化rna；提取過程中需要避免rna酶的降解，因此操作需在無菌條件下進行，使用預處理的無rna酶的器具和試劑。

14、前述方法中，qrt-pcr(定量逆轉錄聚合酶鏈反應)：

15、將提取的總rna逆轉錄成cdna，這一步驟需要逆轉錄酶(如m-mlv逆轉錄酶)和特異性的引物；

16、逆轉錄后，使用qrt-pcr對目的基因進行定量分析，qrt-pcr是一種實時監測dna擴增的技術，通過熒光染料(如sybr?green)或熒光探針(如taqman探針)來檢測擴增過程中的熒光信號；

17、在qrt-pcr中，加入目的基因特異性的引物和熒光標記的探針或染料，通過設定的熱循環條件(變性、退火、延伸)對目的基因進行擴增；

18、隨著pcr循環的進行，熒光信號會隨著dna模板的指數級增加而增強，熒光信號的閾值(ct值)是pcr循環次數達到設定閾值時的循環數，它與模板dna的初始量成反比。

19、前述方法中，通過擬合余弦曲線來描述周期性數據的變化，從而確定節律的相位、振幅、中位數和峰值期，使用cosinor軟件，輸入每一組細胞的ct值，軟件將根據余弦分析函數模型進行曲線擬合：

20、余弦分析函數模型為：

21、f(χ)＝m+acos[2π/t(χ-φ)]

22、m：中位線，表示周期性波動的中線。

23、a：振幅，表示周期性波動的大小。

24、t：周期，通常為24小時，表示晝夜節律的周期。

25、χ：時間點。

26、φ：相位，表示周期性波動的起始點。

27、通過擬合，可以得到基因表達的節律參數，包括相位、振幅、中位數和峰值期(基因表達量最高的時間點)，這兩個步驟結合起來，可以精確地分析基因表達的晝夜節律變化，為研究生物鐘和相關疾病提供重要的分子生物學數據。

28、上述測量方法中所述的模擬晝夜照明的裝置包括匣子，匣子的一側開設有可打開和封閉的門體，匣子內固定有全光譜led燈珠，全光譜led燈珠外罩設有勻光膜，全光譜led燈珠外接電源且控制端置于匣子的外部。

29、上述裝置中，匣子和門體均由黑色亞克力板制成，二者間通過合頁連接，全光譜led燈珠通過鋁制燈板固定于匣子內的上端。

30、現有技術針對動物晝夜節律相位和相關基因的研究方法因設備和條件限制只能在活體進上行研究，一般情況下，為了給動物制定晝夜節律性，會提前將動物置于黑暗環境中一定時間使動物體失去白天和黑夜的規律，再通過人為給予模擬自然光線的燈光照射，其中開燈12小時模擬白天，關燈12小時模擬黑夜(可以根據自己的研究選擇不同的起始點)，使節律形成或節律相移，以此規律馴化1-2周后提取動物體基因和蛋白觀察節律的變化和光照的關系，本發明提供了一種針對離體培養細胞的晝夜節律相位、周期、振幅的研究方法，在離體培養的細胞上研究晝夜節律，驗證離體培養的細胞可能存在感光的蛋白或基因，能通過感應光/暗環境調節自身的基因表達并控制晝夜節律相位；打破了以往只能在活體動物身上給予光/暗環境干預制造晝夜節律的局限性；同時設計出一種能在黑暗的培養箱中模擬晝夜光照的裝置，它可以成功的為離體培養的細胞提供晝夜光環境模擬，并通過對細胞的晝夜節律基因檢測驗證晝夜節律相位、周期、振幅等，也能通過調節設備內光照時間的方式使晝夜節律相位移動，所設計出的能模擬晝夜環境并且可以置于培養箱中的裝置通過外部的控制端或遠程控制，可以讓細胞在5％co2、36.8℃的恒定培養環境中正常生長的同時實現光暗周期循環，更接近生理狀態。

技術特征：

1.針對離體培養細胞的晝夜節律相位測量方法，其特征在于，具體步驟如下：

2.根據權利要求1所述針對離體培養細胞的晝夜節律相位測量方法，其特征在于：所述目的細胞是人體或動物體的表皮細胞。

3.根據權利要求1所述針對離體培養細胞的晝夜節律相位測量方法，其特征在于：所述目的細胞是人原代角質形成細胞，培養箱中的培養環境為5％co2的空氣、36.8℃的恒定培養環境。

4.根據權利要求1所述針對離體培養細胞的晝夜節律相位測量方法，其特征在于：上述步驟(4)中，按照上述模擬光暗周期循環的環境下培養3-5天后，使目的細胞出現與光暗循環規律一致的晝夜節律，在方案的最后24小時按不同的時間點使用胰蛋白酶消化法收取多組細胞，1000rap/min離心5分鐘，棄上清液后將細胞沉淀用于最終測量晝夜節律相位、周期、振幅。

5.根據權利要求4所述針對離體培養細胞的晝夜節律相位測量方法，其特征在于：上述步驟(4)中，在方案的最后24小時按8：00、13：00、18：00、23：00、4：00、9：00共6組時間點，使用胰蛋白酶消化法收取對應的6組細胞。

6.根據權利要求4所述針對離體培養細胞的晝夜節律相位測量方法，其特征在于：在收集完多組細胞后，首先需要提取細胞中的總rna，rna是基因表達的直接產物，總rna包含了細胞中所有類型的rna；使用rna提取試劑盒按照制造商的指南進行操作，這些試劑盒通常包含裂解液、分離液和洗滌液，能夠從細胞中提取并純化rna；提取過程中需要避免rna酶的降解，因此操作需在無菌條件下進行，使用預處理的無rna酶的器具和試劑。

7.根據權利要求1所述針對離體培養細胞的晝夜節律相位測量方法，其特征在于：將提取的總rna逆轉錄成cdna，這一步驟需要逆轉錄酶和特異性的引物；逆轉錄后，使用qrt-pcr對目的基因進行定量分析；在qrt-pcr中，加入目的基因特異性的引物和熒光標記的探針或染料，通過設定的熱循環條件對目的基因進行擴增；隨著pcr循環的進行，熒光信號會隨著dna模板的指數級增加而增強，熒光信號的閾值是pcr循環次數達到設定閾值時的循環數，它與模板dna的初始量成反比。

8.根據權利要求1所述針對離體培養細胞的晝夜節律相位測量方法，其特征在于：通過擬合余弦曲線來描述周期性數據的變化，從而確定節律的相位、振幅、中位數和峰值期，使用cosinor軟件，輸入每一組細胞的ct值，軟件將根據余弦分析函數模型進行曲線擬合：

9.一種用于權利要求1至8中任一權利要求所述測量方法的模擬晝夜照明的裝置，其特征在于：包括匣子(1)，匣子(1)的一側開設有可打開和封閉的門體(2)，匣子(1)內固定有全光譜led燈珠(3)，全光譜led燈珠(3)外罩設有勻光膜(4)，全光譜led燈珠(3)外接電源且控制端置于匣子(1)的外部。

10.根據權利要求9所述裝置，其特征在于：所述匣子(1)和門體(2)均由黑色亞克力板制成，二者間通過合頁連接，全光譜led燈珠(3)通過鋁制燈板(5)固定于匣子(1)內的上端。

技術總結
本發明提供一種針對離體培養細胞的晝夜節律相位測量方法和模擬晝夜裝置，具體包括：提取并純化目的細胞；培養直至細胞數量滿足研究需要的分組數；將模擬晝夜照明的裝置放置于培養箱中，培養的細胞置于裝置內，模擬晝夜的光暗周期循環；在模擬的光暗周期下培養3?5天后，按照不同的時間點收集細胞，進行離心和總RNA提取；通過熒光定量PCR技術測量基因表達量；使用Cosinor軟件和余弦分析函數模型來擬合數據，從而得到基因表達的節律、相位、振幅和中位數。以解決傳統方法無法針對離體培養細胞進行晝夜節律相位周期和振幅等研究的問題。屬于離體細胞晝夜節律研究領域。

技術研發人員：陳光素,吳玉霞,蘇羽屾,楊雅婷,劉婷,陸洪光,曾雯
受保護的技術使用者：貴州醫科大學
技術研發日：
技術公布日：2025/4/28