專利名稱：多能擴增間充質前體細胞子代(memp)及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及多能擴增的間充質前體細胞子代(MEMP)。本發明還涉及用于產生 MEMP的方法以及MEMP在治療性應用中的用途。
背景技術：
存在于體內且分離時可產生多能細胞的非造血祖細胞被稱為間充質前體細胞 (MPCs)。更具體地，純化的MPCs能夠形成大量多能細胞集落。Simmons 等人(Advances in Bone Marrow Purging and Processing :Fourth International Symposium, pages 271-280,1994)闡述了通過選擇表達 STR0-1 細胞表面標記物的細胞，從新鮮收集的骨髓細胞富集MPCs。如作者在第272-273頁所解釋的，已知骨髓細胞包含一定比例能夠產生CFU-F的MPCs。這些CFU-F在合適的條件下又能夠產生多種 (a broad spectrum of)完全分化的結締組織，包括軟骨、骨、脂肪組織、纖維組織和骨髓支持基質(myelosupportive stroma)。MPCs和CFU-F通常以非常低的發生率存在于骨髓細胞中(通常在 0. 05% -0. 001%之間)，并且這種稀缺性一直是其過去研究中的主要限制。在Simmons et al，1994(見前)引文中所論述的重要發現證實可以通過選擇STR0-1陽性細胞，從新鮮分離的骨髓細胞中一定程度的富集MPCs。特別地，STR0-1陽性細胞的選擇使得分離MPCs (以及得到的CFU-F)而不污染造血祖細胞成為可能。WO 01/04268 (Simmons et al.)通過鑒定STR0-1陽性細胞部分內包含MPCs的亞群，提供了另一個在MPCs富集方面非常重要的進展。特別地，WO 01/04268描述了將STR0-1 陽性細胞群分選為三個亞類STR0-1 、STR0-1 和STR0-1氣在不同的分選亞群中進行 CFU-F集落形成(clonogenic)測定，表明絕大多數MPC包含于STR0-1胃部分中。WO 2004/085630 (Gronthos et al)首次披露了 MPCs存在于血管周圍組織中。這個發現的一個益處在于它極大地擴展了 MPC可以從其分離或富集的源組織的范圍，并且不再存在對MPCs的骨髓來源的有效限制。根據W02004/085630中描述的方法，MPCs可以從其分離的組織包括人類骨髓、牙髓、脂肪組織、皮膚、脾、胰腺、腦、腎、肝臟和心臟。從血管周圍組織分離的MPCs對于細胞表面標記物3G5是陽性的。因此，它們可以通過富集攜帶3G5標記物的細胞、或者通過富集存在于血管周圍細胞上的早期發育表面標記物(如 ⑶146 (MUC18)、VCAM-1)、或通過富集高水平表達的細胞表面標記物STR0-1來分離。用于體外繁殖分離的MPC的方法已有描述(Gronthos et al. Journal of Cell Science 116 :1827-1835，2003)。然而，普遍接受的觀點是MPC的體外擴增通過分化使其祖細胞本質丟失。

發明內容
現在，本申請的發明人得到了令人驚奇的發現，S卩，體外擴增的MPCs能產生一種保留多能性的子代亞群。這種MPC子代亞群為Mro-Itoi細胞并在本文中被稱為多能擴增 MPC 子代(MEMPs)。本申請的發明人還得到了令人驚奇的發現，即MEMPs在體外和體內均能夠刺激組織特異性定型細胞(TSCCs)的增殖。因此，MEMI^s在多種需要產生或修復組織的治療性應用中具有潛在用途。因此，本發明提供了富集細胞群體，其中總細胞群體的至少10%為具有STR0-ltoi、 ALP—表型的多能擴增間充質前體細胞子代(MEMPs)。本發明還提供了包括培養的和/或擴增的細胞群體的組合物，其中總細胞群體的至少為具有Mro-ltoi、ALP_表型的MEMPs，并且其中組合物進一步包括主要為一種組織類型的TSCCs。本發明還提供了通過將TSCCs與具有Stro-Itoi、ALP_表型的MEMPs共培養或通過將TSCCs與從具有Stro-ltoi、ALP—表型的MEMPs獲得的培養上清液、細胞裂解物或部分 (fraction)接觸來刺激TSCCs增殖的方法。本發明還提供了一種富集具有STR0-ltoi、ALP_表型的MEMf^s的方法，所述方法包括在一種或多種刺激因子存在的情況下培養或擴增MPC或其子代，所述刺激因子選自由Ia， 25-二羥基維生素D3 (1，25D)、血小板源性生長因子(PDGF)、腫瘤壞死因子α (TNF-α )、白介素-1 β (IL-1 β )和基質衍生因子1 α (SDF-1 α )組成的組。本發明還提供了一種產生組織特異性定型細胞群體的方法，所述方法包括在一種或多種刺激因子存在的情況下培養包括MPC或其子代和TSCC的細胞群體， 所述刺激因子選自由Ia，25_ 二羥基維生素D3(1，25D)、血小板源性生長因子(platelet derived growth factor) (PDGF)、腫瘤壞死因子 α (TNF- α )、白介素-1 β (IL-1 β )和基質衍生因子1 α (SDF-1 α )組成的組；以及使所述培養的群體處于使MPC或TSCC分化偏向于特異性組織類型的條件。本發明還提供了一種包括MPC或其子代和刺激因子的組合物，所述刺激因子選自由1 α，25_ 二羥基維生素D3(l，25D)、血小板源性生長因子(PDGF)、腫瘤壞死因子 α (TNF- α )、白介素-1 β (IL-1 β )和基質衍生因子1 α (SDF-1 α )組成的組。本發明還提供了一種用于產生或修復患者組織的方法，所述方法包括將本發明的富集群體給予患者。本發明還提供了一種用于產生或修復患者組織的方法，所述方法包括將本發明的組合物給予患者。本發明還提供了一種具有STR0-ltoi、ALP_表型的分離的遺傳修飾的MEMP。


圖1.來源于培養的MPC且表達STRO-Itoi或STRO-Idim的細胞的基因表達譜。體外擴增的骨髓MPC單細胞懸浮液通過胰蛋白酶/EDTA處理而制備。細胞利用STR0-1抗體染色，隨后通過用羊抗鼠IgM-熒光素異硫氰酸鹽(酯)孵育顯示。在熒光激活的細胞分選(A)之后，從純化的表達STRO-Idim或STRO-Itoi的細胞群體制備細胞總RNA。利用RNAzolB 提取方法以及標準步驟，將總RNA從每個亞群分離并且用作cDNA合成的模版。利用前面闡述的標準流程，通過PCR擴增評估各種轉錄體的表達(Gronthos et al. Journal of Cell Science 116 :1827-1835,2003) 用于本研究中的引物對示于表2。擴增后，通過1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析每個反應混合物，并且通過溴化乙錠染色使其可視化(B)。每個細胞標記物參照于管家基因(GAPDH)表達的相對基因表達，利用ImageQant軟件加以評估(C)。圖2.來源于骨髓MPCs的體外擴增細胞的免疫表型表達模式。來源于骨髓MPC 的體外擴增細胞的單細胞懸浮液通過胰島素/EDTA解離來制備，隨后與STR0-1抗體以及鑒定多種細胞系相關標記物的抗體一起孵育。利用羊抗鼠IgM-熒光素異硫氰酸酯(鹽) 鑒定STR0-1，同時利用羊抗鼠或羊抗兔IgG-藻紅蛋白鑒定所有其他標記物。對那些鑒定細胞內抗原的抗體，細胞制備物首先用STR0-1抗體標記、用冷70%乙醇固定以透化 (permeabilize)細胞膜并隨后用細胞內抗原特異性抗體孵育。在同樣的條件下使用匹配的同型對照抗體。利用COULTER EPICS流式細胞儀進行雙色流式細胞分析，并收集列表模式數據(list mode data)。點狀圖表示5000個列表模式的事件(listmode events)，表明每個種系細胞標記物(y軸)和STR0-1U軸)的熒光強度水平。垂直和水平象限參照匹配的同型陰性對照抗體而建立。圖3.體外成脂發育。單細胞懸浮液通過從體外擴增細胞(來源于STRO-Itoi/ VCAM-I+分選的骨髓細胞)的繼代培養物進行胰蛋白酶/EDTA消化而生成，然后利用單色熒光素激活的細胞分選將擴增的細胞根據其STR0-1表達加以分離，如圖IA所示。然后， STRO-Ibri和STRO-Idim分選的MPC衍生細胞在常規生長培養基中，以IxlO5個細胞/孔的密度鋪于6孔板中過夜。第二天，將培養基用如在方法中所述的成脂誘導培養基替換。此后， 培養基每周補充兩次，共計三周，此時固定該細胞并用油紅0進行染色。本圖示出了低Gx) 和高(20x)倍放大，以描述含有遍布粘附性基質層中含脂質的脂肪細胞的油紅0染色。與 STRO-Itum培養物中7士2脂肪細胞QOx的每單位面積，η = 9個視野)相比，在STRO-Itoi培養物中平均鑒定出22士5個油紅0陽性脂肪細胞OOx的每單位面積，η = 9個視野)。圖4:體外成骨發育。單細胞懸浮液通過從體外擴增細胞(來源于STRO-Itoi/ VCAM-Γ分選的骨髓細胞)的繼代培養物進行胰蛋白酶/EDTA消化而生成。然后利用單色熒光素激活的細胞分選(FAC)將擴增的細胞根據其STR0-1表達加以分離，如圖IA所示。然后將STRO-Itoi和STRO-IdimFACS分離的細胞在常規生長培養基中、以0. 3Χ105個細胞/孔的密度鋪于48孔板中過夜(每個條件重復4次)。第二天，將培養基用如在方法中所述的成骨誘導培養基替換。此后，將培養物每周補充兩次，共計三周，此時洗滌該細胞，然后用0. 6Ν HCL處理以提取礦化沉積物中的鈣。將樣品與ο-甲酚-酞-配位酮反應，比色反應在570nm 處讀數。絕對鈣濃度根據鈣的標準曲線來確定。㈧鈣測量值表明，相比于STRO-Itum培養物，STRO-Itoi培養物合成顯著Γ ;p< 0.05 ;t-檢驗)較多的礦物質。將重復的培養物加以固定，并用茜素紅染色法加以染色以描述STRO-Itoi(B)和STRO-Idim(C)培養物的粘附層中礦化沉積物的典型水平。圖5:體外軟骨發育。單細胞懸浮液通過從體外擴增細胞(來源于STRO-Itoi/ VCAM-I+分選的骨髓細胞)的繼代培養物進行胰蛋白酶/EDTA消化而生成，然后利用單色熒光激活的細胞分選(FACS)，將擴增的細胞根據其STR0-1表達加以分離，如圖IA所示。然后將STRO-Itoi和STRO-IdimFACS分離的細胞以2. 5x10s個細胞/管的密度成團于聚丙烯管中并在軟骨形成誘導培養基中培養。此后，將該培養物每周補充兩次，共計三周。回收細胞團并用于組織學檢查或如方法中所述制備總RNA。STRO-Ibri(A)和STRO-Idim(B)細胞群體均能夠形成含軟骨細胞樣細胞的細胞團。RT-PCR分析表明，相比于STRO-Idim(SD)細胞群體， STRO-Ibri(SB)群體顯示出較高水平的軟骨相關基因X型膠原和聚集蛋白聚糖(C)。圖6 STRO-Ieri細胞誘導STRO-Idim細胞增殖。體外擴增的骨髓MPC的單細胞懸浮液通過胰蛋白酶/EDTA處理而制備。細胞用STR0-1抗體進行染色并分選為表達STRO-Idim 或STRO-Itoi的培養細胞群體，如圖1中所述。細胞如方法中所述用CFSE加以標記。未標記的細胞用來建立陰性對照(自體熒光)。利用Cokemid (100ng/ml)來抑制細胞分裂并提供一個總標記指數(0代)。隨后將未標記的STRO-Ibri以(A)OSTRO-Ibri個細胞 IxlO5STRO-Idim 個細胞(0 % ) ； (B)O. 05xl05STR0-lbri 個細胞0. 95xl05STR0-ldim 個細胞 (5%) ； (C) 0. IxlO5STRO-Ibri 個細胞0. 9xl05STR0_ldim個細胞(10% ) ； (D) 0. 2xl05STR0_lbri 個細胞0. 8xl05STR0-ldim 個細胞(20%) ； (E) 0. 5xl05STR0-lbri 個細胞0. 5xl05STR0-ldim 個細胞(50%)的比率加回到CFSE標記的STRO-Idim細胞中。將該補加的混合物培養7天，收集，并如方法中所述通過流式細胞儀進行分析。利用用于Win32的ModFit LTO.O版)分析細胞增殖，發現STRO-Itoi細胞(Rl)以劑量依賴性方式刺激STRO-Itwm細胞的增殖。圖7 細胞因子和成骨性試劑增加培養物中的STRO-Itoi細胞的數量。將已建立的MPC培養物在補充了 10% FCS(A)，或一系列因子(包括1x10_8M 1 α , 25- 二羥基維生素 D3(1，25D) (B) ； 10ng/ml 血小板源性生長因子(PDGF) (C) ； 10ng/ml 瘤壞死因子-α (TNF- α ) (D) ； 10ng/ml 白介素 _1 β (IL-1 β ) (E)以及 30ng/ml 基質衍生因子 1_ α (SDF-1 α) (F)) 的基礎培養基中培養5天，用STRO-ImAb染色并如上所述進行分析，發現這些因子增加 STRO-IbriMPC的數量。示出的結果是3次獨立實驗的代表性示例。圖8 將無胸腺裸大鼠進行冠狀動脈左前降支(LAD)結扎并于48小時后注射鹽水、IxlO6個人STRO-Idim細胞、IxlO6個人STRO-Itoi細胞或IxlO6個人Mro-I-缺失的骨髓單核細胞。兩周后，處死動物，固定心臟組織，同時用兩種單克隆抗體加以染色第一種抗體與大鼠(而不是人類)Ki67抗原選擇性反應，第二種抗體與心肌細胞標記物肌鈣蛋白I反應。雙重染色的細胞(表示增殖的大鼠心肌細胞)通過免疫過氧化酶技術進行檢測。相比于接受鹽水或IxlO6個STRO-Idim人細胞的對照動物，接受IxlO6個STRO-Itoi人細胞的動物表現為增殖的大鼠心肌細胞呈2. 5-5倍較高的數量(ρ < 0. 05)。圖9 無胸腺裸大鼠皮下注射大鼠成膠質細胞瘤細胞，其構成性地分泌VEGF。兩周后，該大鼠接受瘤內注射鹽水、0. 5xl06個人STRO-Idim細胞或0. 5xl06個人STRO-Itoi細胞。 一周后，處死動物，固定瘤組織，同時用兩種單克隆抗體加以染色第一種抗體與α -平滑肌肌動蛋白抗原(由平滑肌細胞表達)反應，而第二種抗體與vWF抗原(由脈管內皮細胞表達)反應。雙重染色的結構(表示含有內皮和平滑肌的小動脈和動脈)通過免疫過氧化酶技術進行檢測。相比于接受鹽水或IxlO6個STRO-Idim人細胞的對照動物，接受0. 5χ106 STRO-Ibri個人細胞的動物在瘤內細胞注射的部位表現為小動脈和動脈呈3. 5-8倍的較高數量(ρ < 0. 05)。在注射了人細胞的遠端部位處未觀察到差異。圖10 =IL-I β增加從MPC擴增的細胞的增殖能力。如方法中所述，將細胞用CFSE 進行標記，隨后在lOng/ml IL-I β存在的情況下將細胞培養5天，用STR0-1和ALK PHOSmAb加以染色并如上所述進行分析。(A)未處理的(NT)和(B)IL-Iii處理的培養物表現出 STR0-ltoi/ALP陽性細胞數量的增加。這種STR0-1表達的增加伴隨著如(C)中所示的細胞增殖的增加，其中未處理的培養物經歷了四次細胞分裂，同時(D)IL-Iii處理的培養物通過增加STRO-Itoi骨原細胞的數量而表現出細胞分裂次數增加。示出的結果是3次獨立實驗的代表性實例。當l，25D、PDGF-BB、TNF-a、IL-I β以及SDF-I用來刺激MPC時，也可得到類似結果。圖11 在成骨誘導劑(地塞米松，desamethasone)存在的情況下，IL-I β刺激MPC 增殖并且增強其骨形成能力。將體外擴增的人(A)MPC后代以2，000個細胞/孔的細胞密度接種于96孔板中并在α -ΜΕΜ-10中培養。培養基補充了指定濃度的IL-I β，并且如在方法中所述，在第7天利用WST-I對細胞數和生存力進行定量。濃度為0. 01ng/ml的IL-I β 顯著將細胞數增至未處理對照培養物的136. 6士 1.2% (D，P = 0.000003，學生t-檢驗)。 在大于0. lng/ml的濃度下獲得平臺效應。數值表示每個濃度的三次重復培養物的平均值士SEM。(B&C)將體外擴增的MPC后代以切104/孔的細胞密度三份平行接種于M孔板中， 并在成骨誘導性條件下進行培養，如方法中所述。該細胞用濃度為lOng/ml的IL-I β處理， 并且培養物每周“補充”一次含有IL-I β的新鮮培養基。從基質中釋放的游離鈣通過如方法中所述在酸性條件下處理粘附細胞而獲得。將樣品與鄰甲酚-酞配位酮反應，比色反應在570nm處讀數。絕對鈣濃度根據鈣的標準曲線來確定。結果表明，相比于未處理的細胞 (B)，在用IL-I β處理的細胞中礦物沉積增加(C)。在IL-I β處理的細胞中，鈣水平在第4 周廣ρ = 0. 00009，學生t-檢驗)和第6周廣P = 0. 00004，學生t_檢驗)均顯著高于未處理的細胞(D)。示出的結果是3次獨立實驗的代表性實例，其中利用來源于三個不同供體的基質細胞。圖12 IL-I β刺激STRO-ItoiMPC增殖，而地塞米松誘導堿性磷酸酶(ALP)表達。將已建立的人MPC培養物以3χ104/孔的細胞密度接種到(A)無補充物(NT)、補充了(B)IOng/ ml IL-I β或(C)lxl0_%地塞米松以及(D) 10ng/ml IL-I β和1x10、地塞米松的完全培養基的M孔板中。將細胞如方法中所述培養21天。結果表明，IL-I β的促有絲分裂作用用于增加STRO-Itoi MPC的數量(B)，后者又刺激STRO-Idim細胞的增殖(見圖6)。另外，MPC 響應存在于生長培養基中的FCS和抗壞血酸鹽-2-磷酸鹽而獲得ALP表達，而ALP表達在響應于糖皮質激素(glucocorticosteroid)地塞米松(dex)時被增強(D)。IL-1 β和dex 的組合作用用來增強骨形成，如圖11所示。實驗進行了三次并且在來源于三個不同供體的 MPC中觀察到相似的趨勢。圖13 :PDGF對體內骨形成的作用。將來源于STR0-lto7VCAM-l+分選的骨髓細胞的體外擴增細胞的半融合繼代培養物在PDGF-BB (10ng/ml)存在或不存在的情況下培養5天。 單細胞懸浮液通過胰蛋白酶/EDTA消化形成，然后如方法中所述與用于植入的40mg羥磷灰石/磷酸三鈣顆粒(HA/TCP) —起在免疫缺陷小鼠中進行孵育。8周后，將獲得的移植物固定并加以處理用于組織學檢查。新骨形成的分析利用Scion成像軟件根據三個重復移植物的每個表面積(20x)來確定(A)。相比于未處理的對照培養物，用PDGF-BB預處理的培養物顯示出顯著Γ ;P< 0.05 ;t-檢驗)較多的異位骨形成。示出的典型圖片以橫截面描述蘇木精/伊紅染色的異位骨，代表未處理的(B)和PDGF處理的(C)移植物。圖14 多能擴增間充質前體細胞子代(MEMPs)或STRO-Itoi/ALP11PC存在于STR0-1選擇的BM MPC的體外培養物中。體外培養物四次傳代后，利用雙色熒光和流氏細胞儀分析STR0-1選擇的BM MPC的STR0-1和ALP表達。點圖直方圖表示5xl04個以列表模式數據收集的事件。垂線和水平線設定為反應水平低于利用匹配的同型對照抗體1B5 (IgG)和 1A6. 12 (IgM)在相同條件下處理得到的平均熒光的1.0%。
具體實施例方式現在，本申請的發明人得到了令人驚奇的發現，即體外擴增的MPCs包含可保留多能性的細胞亞群。更具體地，本申請的發明人發現根據由STR0-1抗體識別的抗原的表達水平，從收集的MPC細胞獲得的擴增(expanded)群體可以分成至少兩個群體STR0_lbri和 STRO-f。本文所示的功能性數據表明擴增的STRO-Itoi細胞是較低定型的而且更能夠響應于支持脂肪發育、軟骨發育和骨發育的誘導因子。相反，311 0-1<""1細胞代表更分化的群體并且包括組織特異性定型細胞(TSCC)類型。在擴增的子代內的Mro-Itoi細胞在本文中被稱為多能擴增MPC子代(MEMPs)。本申請的發明人還得到了令人驚奇的發現，即MEMPs能夠在體外和體內刺激組織特異性定型細胞(TSCCs)增殖。因此，MEMI^s在多種需要產生或修復組織的治療性應用中具有潛在用途。如本文所使用的，“MPC”是能夠形成大量多能細胞集落的非造血祖細胞。"MPC子代”指的是來源于MPC的細胞。優選地，MPC子代是集落形成單位-成纖維細胞(CFU-F)的子代，而CFU-F又來源于MPC。更優選地，所述細胞通過擴增或體外培養從MPC或CFU-F獲得。優選地，該培養涉及兩次以上、優選三次以上、較優選四次以上的傳代。在培養或擴增后，優選富集群體包括至少5X IO6個細胞，較優選至少IO7個細胞，更優選至少IO9個細胞。W001/04268和W02004/085630中闡述了用于制備富集MPC群體(子代可以從其衍生)的方法。在體外環境下，MPC很少以絕對純凈的制備物存在，通常與其它為組織特異性定型細胞(TSCC)的細胞一起存在。W001/04268提到了從骨髓中以約0. 到90%的純度水平收集這樣的細胞。包括MPC (子代從其衍生)的群體可以直接從組織來源收集，或者可替代地，它可以是已經在體外擴增的群體。例如，該子代可以來源于收集的、未擴增的(unexpanded)、基本上純化的MPC群體，包括它們存在于其中的群體的總細胞的至少約0. 1、1、5、10、20、30、40、50、60、70、80或 95%。這個水平可以通過，例如，選擇對于至少一種標記物為陽性的細胞來實現，所述標記物選自由 STRO-Itoi、VCAM-Itoi、THY-Itoi、CD146toi 和 STR0_2toi 組成的組。該MPC起始群體可以來源于W001/04268或W02004/085630中列出的任何一種或多種組織類型，即骨髓、牙髓細胞、脂肪組織和皮膚，或者可能更廣泛的來源于脂肪組織、牙齒、牙髓、皮膚、肝、腎、心、視網膜、腦、毛囊、腸、肺、脾、淋巴結、胸腺、胰腺、骨、韌帶、骨髓、 腱和骨骼肌。這種細胞的優選來源為人類，然而，預期本發明也可以適用于動物，包括農業動物 (如牛、羊、豬等)、家畜(如狗和貓)、實驗動物(如小鼠、大鼠、倉鼠和兔)或者用于運動的動物(如馬)。
可以理解，在實施本發明的過程中，攜帶任何特定細胞表面標記物的細胞的分離可以利用多種不同的方法而實現，然而，優選的方法依賴于將結合劑結合到所涉及的標記物，隨后分離那些表現出結合(高水平結合或低水平結合或者無結合)的。最方便的結合劑是抗體或基于抗體的分子，由于單克隆抗體的特異性而優選為單克隆抗體或基于單克隆抗體。抗體可以用于兩個步驟，然而，其它試劑也可以使用，因此，也可以采用這些標記物的配體富集攜帶或缺乏它們的細胞。所述抗體或配體可以附著于固體支撐物以實現粗分離。分離技術優選最大化保留待收集部分的生存能力。可以采用各種不同效率的技術獲得相對粗分離。所采用的特定技術依賴于分離效率、相關細胞毒性、操作的難易和速度以及先進裝備和/或工藝技術的必要性。用于分離的方法可以包括但不限于利用抗體被覆的磁珠進行磁性分離、親和層析以及用附著于固體基質的抗體進行“篩選(panning)”。提供精確分離的技術包括但不限于 FACS0用于分離MPC的方法優選包括，例如，第一步，為固相分選步驟，利用例如MACS識別STR0-1的高水平表達。如果需要，第二分選步驟可以隨后進行，得到如專利說明書WO 01/14268中所述的較高水平的前體細胞表達。該第二分選步驟可能涉及到應用兩種或多種標記物。獲得MPC的方法還可以包括在第一富集步驟前利用已知技術收集細胞源。因此可以將該組織手術切除。包括該源組織的細胞隨后將被分散入所謂的單細胞懸浮液。這種分散可以通過物理和/或酶法獲得。一旦獲得合適的MPC群體，它可以通過任何合適的方法進行培養或擴增以獲得 MEMPs。MEMPS可以與新鮮收集的MPC區別開并且它們對標記物STRO-Itoi是陽性的，對標記物堿性磷酸酶(ALP)是陰性的。相反，新鮮分離的MPC對STRO-Itoi和ALP均是陽性的。當我們提到細胞對特定標記物為“陽性”時，根據細胞表面上該標記物存在的程度，其可以為標記物的低(Io或dim)或高(bright，bri)表達者，其中所述術語涉及到熒光或在細胞的顏色分選過程中所使用的其他顏色的強度。Lo和bri的區別在被分選的特定細胞群體上所用的標記物的上下文中將被理解。本文中我們提到細胞對特定標記物為“陰性”時，并不意味著該細胞一點也不表達所述標記物，而指該細胞以相對非常低的水平表達該標記物，且當可檢測的標記時，產生非常低的信號。當在本文中使用時，術語“亮”指的是細胞表面上的標記物在可檢測地標記時產生相對較高的信號。同時不希望受限于理論，我們提出了“亮”細胞比樣品中的其它細胞表達較多的靶標記蛋白(例如，由STR0-1識別的抗原)。例如，當用FITC軛合的STR0-1抗體標記(如通過FACS分析所確定的)時，STRO-Is細胞相比非亮細胞(STR0-l Mm)產生較強的熒光信號。優選地，“亮”細胞構成起始樣品中包含的最亮標記的骨髓單核細胞的至少約0. 1%。在其它具體實施方式
中，“亮”細胞構成起始樣品中包含的最亮標記的骨髓單核細胞的至少約0. 1%、至少約0. 5%、至少約1%、至少約1.5%或至少約2%。因此，本發明提供了富集細胞群體，其中總細胞群體的至少10%是具有STRO-Itoi, ALP—表型的多能擴增間充質前體細胞子代(MEMPs)。在本發明的一個優選具體實施方式
中，總富集細胞群體的至少15^^20^^30%,40%、50%、60%、70%、80%、90%或 95%為具有 STRO-Ibri, ALP^ 表型的 MEMPs。在另一個優選的具體實施方式
中，所述富集細胞群體與具有STRO-Itoi, ALP—表型的 MEMPs 同源(homogenous)。在進一步優選的具體實施方式
中，所述MEMPs對標記物Ki67、CD44和/或⑶49c/ Q^9、VLA-3、α 3β 1中的一種或多種為陽性。在更進一步優選的具體實施方式
中，所述MEMPs不表現TERT活性，并且(或者) 對標記物⑶18為陰性。在進一步優選的具體實施方式
中，根據本發明的富集群體進一步包括組織特異性定型細胞(TSCCs)。TSCCs被認為定型于特定細胞或組織種系，特征在于其為Mro-Idim細胞。“定型” 指該細胞定型于特定細胞或組織類型，但不一定為終末分化的。來源于在例如FCS存在的情況下擴增的MPCs的細胞群體將包括定型于不同種系的TSCCs。因此，一部分TSCCs將定型于比方說骨，另一部分TSCCs則將定型于脂肪細胞(adipocyte)分化，而且還存在多種不同細胞或組織種系的代表性TSCCs。TSCCs傾向定型于一種細胞或組織種系類型，然而其可以為雙潛能的，即能夠進一步分化成兩種不同細胞或組織類型中的一種。TSCCs可以被定型至其的種系的非限制性實例包括骨前體細胞；肝祖細胞，其對于膽管上皮細胞和肝細胞是多能的；神經元限制性細胞，其可產生發展為少突膠質細胞和星形膠質細胞的膠質細胞前體；神經元前體，其發展為神經元；用于心肌和心肌細胞的前體、分泌葡萄糖感應胰島素的胰腺β細胞系。其它TSCCs包括但不限于軟骨細胞、成牙本質細胞、產生牙本質和軟骨細胞以及下列細胞的前體細胞視網膜色素上皮細胞，成纖維細胞、皮膚細胞如角化細胞，樹突細胞，毛囊細胞，腎管上皮細胞，平滑肌和骨骼肌細胞，睪丸祖細胞，脈管內皮細胞，腱、韌帶、軟骨、脂肪細胞，成纖維細胞，骨髓基質、心肌、平滑肌、骨骼肌、周細胞、脈管、上皮、神經膠質、神經元、星形膠質細胞和少突膠質細胞。TSCCs還包括那些特異性產生結締組織(包括脂肪、蜂窩、骨質、軟骨、彈力和纖維結締組織)的前體細胞。在本發明的一個具體實施方式
中，所述富集細胞群體包括主要為一種組織類型的 TSCCs0“主要為一種組織類型”指群體內所有TSCCs的至少20%、較優選至少30%、較優選至少40 %、較優選至少50 %、較優選至少60 %、較優選至少70 %、較優選至少80 %以及較優選至少90%為同一種組織類型。富集群體內的MEMPs和TSCCs可以來源于同一個體。可替代地，MPC子代和TSCCs 可以來源于不同個體(換句話說，MPC子代和TSCCs是同種異體的)。本發明還提供了包括培養的和/或擴增的細胞群體的組合物，其中所述總細胞群體的至少為具有Mro-Itoi、ALP_表型的MEMPs，且其中組合物進一步包括主要為一種組織類型的TSCCs。在一個優選的具體實施方式
中，該總細胞群體的至少5 %、較優選至少10%、較優選至少20%為具有STRO-Itoi jLP—表型的間充質前體細胞(MPC)子代。在進一步優選的具體實施方式
中，TSCCs定型于組織種系或細胞類型，其選自由骨、神經組織、脂肪、軟骨、骨骼肌、心肌、上皮組織、成骨細胞、腱、韌帶、成牙本質細胞、周細胞、平滑肌、神經膠質組織、脈管組織、內皮組織、造血組織、肝組織以及腎組織組成的組。在更進一步優選的具體實施方式
中，所述TSCCs是造血細胞。本申請的發明人的另一個發現是MPC子代的存在對于通過TSCC的增殖以及組織形成具有刺激效應。這一點在體外和體內均已發現。因此本發明構思了一種通過與MPC子代共培養或通過與MPC子代的培養上清液、細胞裂解物或培養片段接觸來刺激TSCCs增殖的方法。本申請的發明人已經證實，在體外，當測定為STRO-Itoi細胞的MPCs比例保持在 5%或更高水平時，可促進STRO-Itwm細胞的增殖。刺激的程度可被漸進性的增強到這樣的水平，其中Mro-Itoi細胞達到約20%。我們設想在不同于迄今為止進行的培養條件下進行較長時期的研究，可能會表明較高濃度具有更強的有利效應，或者較低水平也可能有益。因此提出存在1，2，3或4%的MPCs也可能有利。本發明還提供了通過將TSCCs與具有Mro_ltoi、ALP_表型的MEMPs共培養或通過將TSCCs與從具有Mro-ltoi、ALP—表型的MEMPs獲得的培養上清液、細胞裂解物或片段接觸來刺激TSCCs增殖的方法。在本方法的一個優選具體實施方式
中，MPC子代與TSCC —起存在于共培養條件下，其水平大于ι %，較優選大于5 %，較優選大于10 %，較優選大于20 %，較優選大于30 %， 較優選大于40 %，較優選大于50 %，較優選大于60 %、70 %、80 %或90 %。本發明的該方法同樣適用于那些通常不存在MPC子代的TSCC群體。因此MPC子代可以加入TSCC群體中，并在合適的培養條件下保持預定的時間。預期細胞數量可利用不時加入更多MPC子代而維持在一個有效的水平，可能通過在分批培養中更換培養基或可替代地，在分批或連續培養系統中每天或每幾天更換培養基而實現，或者如果最初存在足夠數量，則細胞數量可自我維持一代、兩代、三代或更多代。在一個具體實施方式
中，TSCCs是來源于純化的MPCs群體的STRO-Idim細胞，可能根據STRO-Itoi選擇或上面提到的其他選擇而加以分選。我們提出通過MPC子代刺激TSCCs不僅適用于間充質細胞而且適用于其他細胞類型。迄今為止提供的關于RNA和細胞表面標記物表達的數據表明STRO-Itum群體中呈現的 TSCCs包括外胚層、內胚層和中胚層細胞或組織。由MPC子代刺激的細胞類型不一定來自于 MPC，還可以來自于其他來源。MPC子代還可以用來刺激某些造血細胞的增殖和/或分化。在一個具體實施方式
中，這種造血細胞是⑶34+細胞。一般預期本發明不僅適用于細胞的體外培養，即與體外擴增的培養物相關，然而， 當TSCCs位于機體組織部位的原位且含有MPC子代的群體遞送至該部位時，本發明也具有適用性。因此，在本發明該方法的一個具體實施方式
中，TSCCs在體外培養。在本發明該方法的另一個具體實施方式
中，TSCCs位于患者體內的組織部位，MPC 子代、MPC子代的培養上清液、細胞裂解物或片段遞送至該組織部位。在本發明該方法的另一個具體實施方式
中，TSCCs和MPC子代均是外源性的，二者均被遞送至該組織部位。一次這樣的遞送可能是足夠的，然而短暫而間隔的遞送提供的益處可能會加速或更大。在另一個具體實施方式
中，該方法涉及到使所述培養的群體處于可使MPC或TSCC 的分化偏向于特定組織類型的條件下。在本發明該方法的另一個具體實施方式
中，所述TSCCs定型于組織類型，所述組織類型選自由骨、神經組織、脂肪、軟骨、骨骼肌、心肌、上皮組織、成骨細胞、腱、韌帶成牙本質細胞、周細胞、平滑肌、神經膠質組織、脈管組織、內皮組織、造血組織、肝組織和腎組織組成的組。本發明該方法的另一個具體實施方式
中，所述TSCCs是造血細胞。在另一個具體實施方式
中，該方法進一步包括使受刺激的TSCC群體處于可使 TSCC的分化偏向于特定組織類型的條件下。設想在恰當的培養條件下，可以根據該方法產生的細胞類型的范圍包括但不限于以下細胞軟骨組織細胞、軟骨細胞、透明軟骨細胞、纖維軟骨細胞、彈性軟骨細胞、韌帶組織細胞、成纖維細胞、軟骨祖細胞、透明軟骨祖細胞、纖維軟骨祖細胞、彈性軟骨祖細胞、成纖維祖細胞、神經組織細胞、神經元、神經膠質細胞、神經元的祖細胞、神經膠質細胞的祖細胞、脂肪細胞、脂肪組織細胞、脂細胞、褐色脂細胞、白色脂細胞、白色脂細胞的祖細胞、褐色脂細胞的祖細胞、成骨細胞、成骨細胞的祖細胞、成牙本質細胞、成牙本質軟骨細胞、骨細胞、骨細胞的祖細胞、骨襯細胞、骨襯細胞的祖細胞、脈管細胞、脈管細胞的祖細胞、腱細胞、 骨髓基質細胞、破骨-和造血支持基質細胞、心肌細胞、心肌細胞的祖細胞、平滑肌細胞、骨骼肌細胞、周細胞、內皮細胞、內皮細胞的祖細胞、上皮細胞、上皮細胞的祖細胞、星形膠質細胞或者少突膠質細胞。本申請的發明人還設計了用于增加MEMPs生成的培養條件。以前的培養條件不適于MEMPs的優先擴增。事實上，在以前的培養條件下，由于分化成Mro-Idim TSCCs，MEMPs 的比例通常隨時間而降低。因此，本發明還提供了富集具有STR0-ltoi、ALP_表型的MEMPs的方法，所述方法包括在一種或多種刺激因子存在的情況下培養或擴增MPC或其子代，所述刺激因子選自由1 α，25_ 二羥基維生素D3(l，25D)、血小板源性生長因子(PDGF)、腫瘤壞死因子 α (TNF- α )、白介素-1 β (IL_1 β )和基質衍生因子1 α (SDF-1 α )組成的組。在該方法的一個具體實施方式
中，所述一種或多種刺激因子包括PDGF和/或 IL-I β。在本發明該方法的另一個具體實施方式
中，所述MPC或其子代在兩種或多種刺激因子存在的情況下進行培養。增殖的刺激可能適用于收集的未擴增的基本上純化的MPC群體，包括其所存在的群體總細胞的至少約20，30，40，50，60，70，80或95%。刺激增殖的效應可能是限制體外培養時MPCs分化的程度。在本發明該方法的另一個具體實施方式
中，所述MPC或其子代在培養或擴增前已經在體外進行了擴增。在本發明該方法的另一個具體實施方式
中，相對于未受刺激的對照，刺激得到多于10%的具有STRO-Itoi, ALP-表型的MPC子代的增加，優選多于20%，優選多于40%，優選多于50%。
在本發明該方法的另一個具體實施方式
中，用于培養或擴增的MPC來源于任何一種或多種組織，所述組織組成包括骨髓、牙髓細胞、脂肪組織和皮膚的組，或者可以更廣泛的來源于脂肪組織、牙齒、牙髓、皮膚、肝、腎、心、視網膜、腦、毛囊、腸、肺、脾、淋巴結、胸腺、 胰腺、骨、韌帶、骨髓、腱和骨骼肌。在本發明該方法的另一個具體實施方式
中，所述MPC或其子代在一種或多種刺激因子存在的情況下進行體內培養或擴增。從上述內容應該理解，本發明適用于MPC體外增殖，然而，其可能同樣適用于體內原位增殖。因此，所述MPC刺激因子可以直接給予例如需要刺激固有MPC增殖的損傷處，因此，所述MPC刺激因子可以單獨給予，或者可替代的與包括MPC的群體一起給予。后者可視為優選，因為組織中MPC的數量通常非常低，而另外認為通過存在較大量MPC可能會促進對恰當間充質組織生成的有益效應。在另一個具體實施方式
中，該方法進一步包括給予外源性TSCCs。本發明還提供了一種產生組織特異性定型細胞群體的方法，所述方法包括在一種或多種刺激因子存在的情況下培養包括MPC或其子代和TSCC的細胞群體， 所述刺激因子選自由ι α，25-二羥基維生素D3(l，25D)、血小板源性生長因子(PDGF)、腫瘤壞死因子α (TNF- α )、白介素-1 β (IL-1 β )和基質衍生因子1 α (SDF-1 α )組成的組；以及使所述培養的群體處于使MPC或TSCC的分化偏向于特異性組織類型的條件。在本發明該方法的一個具體實施方式
中，所述組織類型選自由心肌細胞、脈管組織、骨組織、神經組織、平滑肌和內皮組織組成的組。還應該理解本發明還涵蓋包括MPC子代和刺激因子的組合物。這種組合物可能是治療上有益的，因此將被制備成藥用形式。所述組合物可以包括富集的或純化的MPC子代群體以及一種或多種刺激因子。所述組合物中存在的刺激因子的水平可經驗性確定，但大多數情況下，其可能為納克(或幾十納克)/毫升的數量級。體內遞送時，可能希望同時在所述組合物中遞送TSCCs。例如，在骨或其局部、心肌或其局部、脈管組織或其局部或者包括一種或多種內皮細胞的局部損傷時，遞送的TSCC優選至少部分定型于相關細胞類型(例如成骨細胞、心肌細胞或內皮細胞)。這些可以作為混合TSCC培養物的部分或以更加純化的形式提供，例如，對已知存在于組織特異性定型細胞類型上的標記物進行分選。可替代的或另外的，被遞送的組合物可能包括一種或多種分化刺激因子以使存在于組合物中或存在于靶部位的MPCs分化成一種或多種感興趣的組織類型。因此，本發明還提供一種包括MPC或其子代和刺激因子的組合物，所述刺激因子選自由10，25-二羥基維生素1)3(1，250)、血小板源性生長因子(PDGF)、腫瘤壞死因子 α (TNF- α )、白介素-1 β (IL-1 β )和基質衍生因子1 α (SDF-1 α )組成的組。在一個具體實施方式
中，所述組合物進一步包括TSCC。在另一個具體實施方式
中，所述組合物進一步包括使TSCC或MPC或兩者的分化偏向于一種特異性組織類型的因子。優選的，所述組織類型選自由心肌、脈管組織、骨組織、神經組織、平滑肌和內皮組織組成的組。
使TSCC或MPC的分化偏向于特異性組織類型的因子在本文提供的實施例中有闡述。使MPC或骨前體細胞或骨的分化發生偏向的條件可能涉及到例如在補充了 10%FCS、 100 μ M L-抗壞血酸鹽(ascorbate)-2-磷酸鹽(phosphate)、地塞米松和3mM無機磷酸鹽的α MEM中培養。這些條件已證實可誘導人BM基質細胞在體外發育成一種礦化的骨基質(Gronthos et al.，Blood. 84 :4164-73,1994)。用于使TSCCs分化成成骨細胞的條件可能涉及到在I型膠原、纖維蛋白原、纖維蛋白、聚乙醇酸、聚乳酸、骨鈣蛋白或骨粘連蛋白存在的情況下培養所述TSCCs。在一個具體實施例中，TSCCs在I型膠原、纖維蛋白原以及纖維蛋白存在的情況下進行培養。在一個可替代性實施例中，TSCCs在I型膠原、纖維蛋白原、纖維蛋白、骨鈣蛋白以及骨粘連蛋白存在的情況下進行培養。在該方法的范圍中，I型膠原、纖維蛋白原、纖維蛋白、聚乙醇酸、聚乳酸、 骨鈣蛋白或骨粘連蛋白可以單獨使用或在生長因子存在的情況下使用。應當理解，本段以上列出的化合物的任意組合也屬于本發明的構思范圍。本發明還提供了一種生成或修復患者組織的方法，該方法包括給予患者本發明的富集群體。本發明還提供了一種生成或修復患者組織的方法，該方法包括給予患者本發明的組合物。在這些方法的優選具體實施方式
中，所述組織選自由心肌、骨、脈管組織、神經組織和內皮組織組成的組。本發明還提供了確定化合物能否刺激MPC細胞增殖以生成MEMPs的方法，包括以下步驟使含有MPCs的群體接觸一種或多種候選MPC刺激性化合物達規定的時間用于所述群體的繁殖，以及確定MEMP數量的增加并與對照比較結果。上述方法可使得生成或修復骨骼肌、心肌、骨、牙齒或脈管組織。更廣泛的，該方法可使得生成或修復以下細胞或組織，其選自由心肌、心肌細胞、軟骨細胞、成骨細胞、破骨細胞、成牙本質細胞、牙本質生成軟骨細胞、骨細胞、骨襯細胞、骨骼肌細胞、脈管內皮細胞、骨髓基質、破骨細胞和造血細胞支持基質、心肌、骨骼肌、內皮細胞和脈管細胞組成的組。本發明還提供一種具有STR0_ltoi、ALP—表型的獨立的遺傳修飾的間充質前體細胞 (MPC)子代。在一個優選的具體實施方式
中，所述MPC子代經過遺傳修飾以表達異種蛋白。該異種蛋白可以為任何感興趣蛋白。例如，該異源性蛋白可以為促進MEMI^s生成的刺激性因子，如1 α，25- 二羥基維生素D3(l，25D)、血小板源性生長因子(PDGF)、腫瘤壞死因子 α (TNF- α )、白介素-1 β (IL-1 β )和基質衍生因子1 α (SDF-1 α )。在另一個實施例中，該異種蛋白是可加速MPC或TSCC分化成特異性組織類型的生物活性因子。該生物活性因子可以是例如合成的糖皮質激素如地塞米松，或骨形態發生蛋白如 BMP-2、BMP-3、BMP-4、BMP-6 或 BMP-7。在整個說明書中，詞語“包括”或變形如“包含”或“含有”應當理解為表示包括所述元件、整體或步驟，或元件、整體或步驟的組，但不排除任何其它元件、整體或步驟，或元件、整體或步驟的組。顯而易見的，本發明一個方面優選的的特征和特點適用于本發明的許多其他方
遺傳修飾細胞的制備在本發明的一種具體實施方式
中，本發明提供了一種具有STR0-ltoi、ALP—表型的分離的遺傳修飾的間充質前體細胞(MPC)子代。優選的，所述MEMI^s經過遺傳修飾以產生異種蛋白。典型的，所述細胞經過遺傳修飾使得異種蛋白從該細胞分泌。遺傳修飾的細胞可在至少一種其量足以支持該經修飾細胞生長的細胞因子存在的情況下進行培養。這樣獲得的遺傳修飾細胞可以立即被利用(例如，在移植物中)、培養和體外擴增或保存以備用。該修飾的細胞可以通過本領域熟知的方法例如在液氮中冷凍而保存。如本文所使用的，遺傳修飾涵蓋任何遺傳修飾方法，其涉及將外源性或外來多核苷酸引入MEMP或MEMP前體(例如MPC)中或在MEMP或MEMP前體內對內源性基因的修飾。 遺傳修飾包括但不限于轉導(病毒介導的宿主DNA從宿主或供體到受體的轉移，體外或體內)、轉染(用分離的病毒基因組DNA轉化細胞)、脂質體介導的轉移、電穿孔、磷酸鈣轉染或共沉淀及其他。轉導的方法包括將細胞與生產細胞(producer cell)直接共培養(Bregni et al·，Blood 80 1418-1422，1992)，或在有或沒有合適生長因子和聚陽離子的情況下單獨利用病毒上清液進行培養(Xu et al.，Exp. Hemat. 22 :223-230,1994)。優選將編碼異源性多肽的多核苷酸在載體內引入宿主細胞。該載體優選包括插入的編碼序列轉錄和翻譯所必需的元件。用來構建這種載體的方法在本領域是熟知的。例如，用于構建合適表達載體的技術在Sambrook et al. ,Molecular Cloning :A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, N. Y. (3rd Ed. ,2000)；禾口 Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons，Inc.，NewYork(1999)中有詳細描述。載體可以包括但不限于病毒載體如逆轉錄病毒、腺病毒、腺相關病毒和單純皰疹病毒、粘粒、質粒載體、合成型載體以及通常用于本領域中的其它重組載體。含有啟動子和克隆位點(多核苷酸可操作地連接入其中)的載體在本領域中是熟知的。這樣的載體能夠在體外或體內轉錄RNA，并且可從諸如Mratagene(La Jolla，Calif. ) ^P Promega Biotech (Madison, Wis.)等來源購得。具體實例包括來自 Stratagene 的 pSG、pSV2CAT、pXtl 以及來自 Pharmacia 的 pMSG、pSVL、pBPV 和 pSVK3。優選的載體包括逆轉錄病毒載體(參見Coffin et al.，‘‘ Retroviruses", Chapter 9 pp ；437-473,Cold Springs Harbor Laboratory Press，1997)。本發明中有用的載體可通過本領域熟知的工藝經重組制備。例如，W094/29438.W097/21824和W097/21825 闡述了逆轉錄病毒包裝質粒和包裝細胞系的構建。示例性載體包括PCMV哺乳動物表達載體，例如 pCMV6b 和 pCMV6c (Chiron Corp.)、pSFFV_Neo 和 pBluescript-Sk+。有用的逆轉錄病毒載體的非限制性實例是那些來源于鼠類、鳥類或靈長類逆轉錄病毒的載體。通用的逆轉錄病毒載體包括那些基于莫洛尼氏鼠白血病毒(MoMLV-載體)的載體。其它源于MoMLV 的載體包括 LmiIy、LINGFER、MINGFR 和 MINT (Chang et al.，Blood 92 :1-11,1998) 另外的載體包括那些基于長臂猿白血病毒(GALV)和莫洛尼氏鼠肉瘤病毒(MOMSV)以及脾病灶形成病毒(SFFV)的載體。來源于鼠干細胞病毒(MESV)的載體包括MESV-MiLy (Agarwal et al.，J. of Virology, 72 =3720-3728,1998)。逆轉錄病毒載體還包括基于慢病毒的載體，非限制性實例包括基于人免疫缺陷病毒(HIV-1和HIV-2)的載體。
制備逆轉錄病毒載體構建體時，病毒gag、pol和env序列可從該病毒去除，形成用于外來DNA序列插入的空間。由外來DNA編碼的基因通常在長末端重復序列(LTR)中的強病毒啟動子控制下表達。合適的控制調節序列的選擇取決于所使用的宿主細胞，且選擇屬于本領域技術人員的能力范圍。除LTR的啟動子外，還有多種啟動子為人所知。非限制性實例包括噬菌體λ PL啟動子、人巨細胞病毒(CMV)立即早期啟動子、莫洛尼氏鼠肉瘤病毒 (MMSV)、勞氏肉瘤病毒(Rous Sacroma Virus,RSV)或脾病灶形成病毒(SFFV)的U3區啟動子、Granzyme A啟動子以及Granzyme B啟動子。另外，可使用可誘導或多重控制元件。選擇合適的啟動子對于本領域技術人員是顯而易見的。如果gag、pol和env功能由包裝(packing)細胞系反式提供，則這樣的構建體可被有效地包裝到病毒粒子中。因此，當該載體構建體被引入所述包裝細胞中時，由該細胞產生的gag-pol和env蛋白與載體RNA —起組裝以產生感染性病毒顆粒(viron)，其分泌到培養基中。這樣產生的病毒可感染并整合入靶細胞的DNA，但不產生感染性病毒粒子因為其缺少基本的包裝序列。目前使用的大多數包裝細胞系已用單獨的質粒(每種質粒含有必需的編碼序列中的一個)進行轉染，因此在可復制病毒產生之前多重重組事件是必需的。可替代地，該包裝細胞系帶有前病毒。該前病毒已被破壞，因此盡管其可以產生組裝感染性病毒所必需的全部蛋白質，但是其自身RNA不能包裝入病毒，而是包裝由重組病毒產生的RNA。 因此，從該包裝細胞釋放的病毒原種僅含有重組病毒。逆轉錄病毒包裝株系的非限制性實例包括 PA12、PA317、PE501、PG13、PSI. CRIP, RDI 14、GP7C-tTA-G10、ProPak_A (PPA-6)以及 PT67。參見 Milleret al. , Mol. Cell Biol. 6 :2895,1986 ；Miller et al.，Biotechniques 7 :980,1989 ；Danos et al.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 :6460,1988 ；Pear etal.，Proc. Natl.Acad. Sci. USA 90 :8392-8396,1993 ；and Finer et al. ，Blood 83 :43-50,1994。其它合適的載體包括腺病毒載體(參見Frey et al.，Blood91 :2781,1998 ；和 WO 95/27071)以及腺相關病毒載體。這些載體在本領域中都是熟知的，如Chatterjee et al., Current Topics in Microbiol. And Immunol. ,218 :61-73,1996 ；Stem cell Biology and Gene Therapy, eds. Quesenberry et al., John Wiley & Sons, 1998 ;and U. S. Pat. Nos. 5,693, 531 and 5，691，176中所描述的。腺病毒衍生載體的應用在某些情形下可能是有利的，因其不能夠感染非分裂細胞。與逆轉錄病毒DNA不同，腺病毒DNA不整合入靶細胞的基因組中。而且，腺病毒載體攜帶外來DNA的能力比逆轉錄病毒載體大很多。腺相關病毒載體是另一種有用的遞送系統。這種病毒的DNA可以被整合入非分裂細胞中，利用腺相關病毒載體已將多種多核苷酸成功引入不同細胞類型中。在一些具體實施方式
中，該構建體或載體包括兩種或更多種異源性多核苷酸序列。優選地，所述其它核酸序列是編碼選擇性標記物、結構基因、治療性基因或其它細胞因子/趨化因子基因的多核苷酸。一種選擇性標記物可以包含于構建體或載體中，用于監測遺傳修飾的成功以及用于選擇DNA已整合入其中的細胞。非限制性實例包括耐藥性標記物，如G148或潮霉素。另外也可采用陰性選擇，例如，其中的標記物是HSV-tk基因。該基因使細胞對諸如阿昔洛韋 (acyclovir)和更昔洛韋(gancyclovir)等藥物敏感。通常使用NeoR(新霉素/G418抗性) 基因，但任何便利的標記基因均可使用，只要其基因序列尚未存在于靶細胞中。進一步的非限制性實例包括低親和力的神經生長因子(NGFR)、增強綠色熒光蛋白(EFGP)、二氫葉酸還原酶基因(DHFR)、細菌hisD基因、鼠⑶M (HSA)、鼠⑶8a (Iyt)、賦予嘌呤霉素或腐草霉素抗性的細菌基因以及半乳糖苷酶。其它多核苷酸序列可以在與編碼異源性蛋白的多核苷酸相同的載體上被引入到宿主細胞中，或者所述其它多核苷酸序列可以在另一個載體上被引入宿主細胞。在一個優選的具體實施方式
中，選擇性標記物將被包含在與編碼異源性蛋白多核苷酸相同的載體上。本發明還涵蓋對內源性基因的啟動子區進行遺傳修飾，以使該內源性基因的表達上調，導致相比于野生型MEMPs，編碼蛋白的產生增加。刺激因子的給予本發明的方法可能涉及將一種或多種刺激因子給予患者，以原位富集MEMPs。這些方法可能涉及部分、系統或局部如在植入物或裝置內部給予一種或多種刺激因子例如1 α，25- 二羥基維生素D3(l，25D)、血小板源性生長因子(PDGF)、腫瘤壞死因子 α (TNF- α )、白介素-1 β (IL-1 β )和基質衍生因子1 α (SDF-1 α )。在一個特定的具體實施方式
中，本發明提供一種通過將刺激因子系統性給予所述患者，而在需要其的患者中富集MEMPs的方法。例如，該刺激因子可通過皮下或肌內注射而給予。本發明的這個具體實施方式
可能對那些希望在特定組織中富集MEMPs的系統變性疾病的治療很有用。可用這種方式治療的系統變性疾病的實例包括骨質疏松癥或骨折、 軟骨變性疾病、動脈粥樣硬化、外周動脈疾病或心血管疾病等。因此，根據本發明，治療或預防有效量的刺激因子可用于治療的疾病或失調選自由自身免疫性疾病、急性慢性炎癥、癌癥、心血管病、感染性疾病以及炎癥性疾病(包括風濕性關節炎、慢性炎癥性腸道疾病、慢性炎癥性盆腔疾病、多發性硬化癥、哮喘、骨關節炎、 動脈粥樣硬化、銀屑病、鼻炎、自身免疫性和器官移植排斥)組成的組。在一個實施例中，這種組合物包括一種或多種治療或預防有效量的刺激因子，足以用來輔助刺激組織特異性細胞的產生。“治療有效量”是指在必要的劑量和時間期內可有效獲得MEMI^s富集的量。“預防有效量”是指在必要的劑量和時間期內可有效獲得希望的預防效果如防止或抑制MPC或其衍生后代死亡的量。在特定的具體實施方式
中，刺激因子的優選范圍可以是0. InM-O. 1M、 0. InM-O. 05Μ、0. 05ηΜ_15 μ M或0. OlnM-IO μ Μ。應當注意，劑量值可以隨著待緩解病癥的嚴重程度而變化。對于任何特定的患者，根據個體需要以及給予或監控該組合物給予的人員的專業判斷，特定的劑量方案可隨時間進行調整。本文提出的劑量范圍僅是示例性的，并不限制可由醫療人員選擇的劑量范圍。組合物中刺激因子的量可以根據諸如個體疾病狀態、年齡、性別以及個體體重等因素而變化。可對劑量方案進行調整以提供最佳治療應答。例如，可以給予單一推注，可以在一定時間內給予若干分次劑量，或者該劑量可以根據治療情形緊急性的指示而成比例地減少或增加。將腸胃外組合物配制成劑量單位形式，可能對方便給予和統一劑量是有利的。 如本文所使用的，“劑量單位形式”是指物理性分開的單位，適合作為用于待治療患者的單一劑型；每一個單元含有經計算的預定量活性化合物，聯合必需的藥用載體而產生希望的治療作用。應當理解，刺激性因子可以以一種包含藥用載體或賦形劑的組合物形式給予。如本文所使用的，“藥用載體”或“賦形劑”包括任何以及所有生理相容的溶劑、分散介質、涂層、抗細菌和抗真菌試劑、等滲和延緩吸收劑等。在一個具體實施方式
中，該載體適合于腸胃外給予。可替代地，該載體可適合于靜脈內、腹膜內、肌內、舌下或口服給予。藥用載體包括無菌水性溶液或分散液以及用于無菌可注射溶液或分散液的臨時制劑的無菌粉末。這些用于藥學活性物質的介質和試劑應用在本領域是熟知的。除了任何與該活性化合物不相容的常規介質或試劑的范圍之外，均考慮其在本發明藥物組合物中的應用。補充的活性化合物也可并入到該組合物中。用于腸胃外給藥的藥物制劑可以包括脂質體。脂質體和乳液是熟知的對于疏水性藥物特別有用的遞送工具或載體的實例。根據治療試劑的生物學穩定性，可以采用其它用于穩定蛋白質的方案。此外，人們可以給予存在于靶向藥物遞送系統中的藥物，例如，存在于涂覆靶特異性抗體的脂質體中。該脂質體會結合于靶蛋白并由表達靶蛋白的細胞選擇性吸收。通常，在生產和貯存條件下治療性組合物應該是無菌且穩定的。該組合物可配制成溶液、微乳液、脂質體或其它適于高藥物濃度的有序結構。該載體可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如，丙三醇、丙二醇和液態聚乙二醇等)及其合適的混合物的溶劑或分散介質。適當的流動性可通過例如利用涂層如卵磷脂、通過在分散的情況下保持所需顆粒大小以及通過利用表面活性劑來保持。在許多情況下，優選在該組合物中包括等滲劑，例如糖類、多醇(如甘露醇、山梨糖醇)或氯化鈉。可注射組合物的延遲吸收可通過在該組合物中包含一種延緩吸收的試劑例如單硬脂酸鹽和明膠而實現。此外，刺激因子可以在延時釋放制劑中給予，例如在包括緩釋聚合物的組合物中給予。該活性化合物可利用防止該化合物快速釋放的載體如控釋制劑一起制備，包括植入物和微囊化遞送系統。可以使用可生物降解的生物相容性聚合物，如乙烯基乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、膠原、聚原酸酯、聚乳酸和聚乳酸聚乙醇酸共聚物(PLG)。用于制備這些制劑的許多方法都被授予專利或通常對于本領域熟練技術人員是已知的。另外，刺激因子的懸浮液可被制成適當的油狀懸浮液用于注射。合適的親脂性溶劑或載體包括脂肪油如芝麻油；或合成脂肪酸酯，如油酸乙酯或甘油三酸酯；或脂質體。用于注射的懸浮液也可含有增加該懸浮液粘度的物質，如羧甲基纖維素鈉、山梨糖醇或葡聚糖。可選地，該懸浮液還可含有合適的穩定劑或增加該化合物溶解性的試劑，以制備高度濃縮的溶液。無菌可注射溶液可通過在合適溶劑中以需要量的活性化合物根據需要與上述列舉組分中的一種或其組合加以混合而制備，隨后進行過濾消毒殺菌。通常，分散液通過將活性化合物并入含有一種基本分散介質以及所需的來自以上列舉的其它組分的無菌載體中而制備。在用于無菌可注射溶液的無菌粉末的情況下，優選的制備方法是真空干燥和冷凍干燥，可從其之前已無菌過濾的溶液得到一種活性成分與任何其它希望組分的粉末。根據本發明的一個可替代方面，刺激因子可以與一種或多種增強其溶解性的其它化合物一起配制。如果該刺激性化合物需要通過吸入給予，則它們可以以壓縮包裝的氣溶膠噴射規格(spray presentation)或霧化劑的形式，同時采用合適的推進劑(例如，二氯二氟甲烷、 三綠氟甲烷，二氯四氟乙烷，二氧化碳或其它合適的氣體)一起方便地加以遞送。在一種壓縮氣溶膠的情況下，劑量單位可以通過一個閥遞送可測定的量來確定。例如用于吸入器的膠囊和明膠套可以配制成包含該化合物和一種合適粉末基質如淀粉或乳糖的粉末混合物。本發明的細胞組合物的給予包含MEMPs和/或TSCCs的本發明的細胞組合物可對多種類型的組織再生很有用，包括骨、軟骨、腱、韌帶、肌肉、皮膚和其它結締組織，以及神經、心臟、肝、肺、腎、胰腺、腦和其它器官組織。在一些具體實施方式
中，本發明的組合物可以結合一種適當的基質(例如，用于支持MEMPs和/或其衍生后代并為骨、軟骨、肌肉、神經、表皮和/或其它結締組織的生長提供表面)一起給予。該基質可以是傳統基質生物材料的形式。該基質可以提供所述表達的蛋白和分化的細胞的緩釋和/或其存在的適當環境。在一些具體實施方式
中，預期多種膠原和非膠原被上調并從MEMI^s分泌。這種現象通過增強基質沉積而加速組織再生。基質蛋白也可在遺傳改造的細胞中表達且促進移植的細胞移入并附著于移植區。基質材料的選擇根據生物相容性、生物降解性、機械性能、創面外觀和界面性質。 該基于細胞的組合物的特定應用將確定適當的制劑。用于該組合物的可能基質可以是生物可降解的以及化學定義的硫酸鈣、磷酸三鈣、羥磷灰石、聚乳酸和聚酐(polyanhydride)。其它可能的材料是生物可降解的和生物學上良好定義的，如骨或真皮膠原。其它基質由純蛋白或胞外基質組分構成。其它可能的基質是非生物降解的和化學定義的，如燒結的羥磷灰石、生物玻璃、鋁酸鹽或其它陶瓷材料。基質可以由上述類型的材料中任意的組合構成，如聚乳酸和羥磷灰石或膠原與磷酸三鈣的組合。生物陶瓷在組成上可以被改變如在磷酸鋁鈣中，也可經加工以改變孔徑大小、顆粒大小、顆粒形狀和生物降解性。本發明的細胞組合物可以用來治療由疾病或創傷或該組織發育不正常引起的需要軟骨或骨組織修復或置換的患者，或用來提供一種整容功能，如增強身體的面部或其它特征。治療可使得本發明的細胞的應用很必要，以產生新的軟骨組織和骨組織。例如，包含未分化的或軟骨形成分化誘導的前體細胞的組合物可用來治療軟骨病癥，例如風濕性關節炎或骨關節炎，或對軟骨的創傷性或手術性損傷。作為另一個實施例，包含骨前體細胞的組合物可用來治療骨的病癥，包括代謝和非代謝骨疾病。骨病癥的實例包括半月板撕裂、脊柱融合、脊椎盤摘除、脊柱重建、骨折、骨/脊柱變形、骨肉瘤、骨髓瘤、骨發育異常、脊柱側凸、 骨質疏松癥、牙周病、牙骨質丟失、骨軟化癥、軟骨病、纖維性骨炎、腎性骨營養不良和骨佩吉特式病(Paget' s disease of bone，變形性骨炎)。本發明的細胞組合物可單獨給予或作為與其它細胞的混合物給予。可以結合本發明組合物而給予的細胞包括但不限于其它多能或多向性細胞或軟骨細胞、成軟骨細胞、骨細胞、成骨細胞、破骨細胞、骨襯細胞、干細胞或骨髓細胞。不同類型的細胞可在給予前立即或短期內與本發明的組合物進行混合，或在給予前它們可共培養一段時間。本發明的細胞組合物可與其它有益的藥物或生物分子(生長因子、營養因子)一起給予。當MEMI^s與其它試劑一起給予時，它們可以在單一藥物組合物中一起給予，或在分開的藥物組合物中同時或與其它試劑按順序給予(在給予其它試劑之前或之后)。可以共同給予的生物活性因子包括抗凋亡試劑(例如，EPO, EPO模擬抗體(mimetibody)，ΤΡ0,IGF-I 和 IGF-II，HGF，胱冬酶抑制劑(caspase inhibitor))、抗炎劑(例如，p38 MAPK 抑制劑，TGF-β 抑制劑，他汀類藥物，IL-6 和 IL-I 抑制劑，PEMIROLAST, TRANILAST, REMICADE, SIR0LIMUS,和 NSAID (非甾族抗炎劑物；例如 TEPOXALIN，TOLMETIN, SUPR0FEN))、免疫抑制 / 免疫調節劑(例如，鈣調磷酸酶(calcineurin)抑制劑，如環孢素，他克莫司(tacrolimus)； mTOR抑制劑(例如，SIROLIMUS，EVER0LIMUS)；抗增殖劑(例如，咪唑巰嘌呤，嗎乙霉酚酸鹽/酯)；皮質激素類(例如，氫化潑尼松(prednisolone)，氫化可的松)；抗體如單克隆抗-IL-2Ra受體抗體(例如，巴利昔單抗、達克珠單抗)、多克隆抗-T細胞抗體(例如，抗胸腺細胞球蛋白(ATG)、抗淋巴細胞球蛋白(ALG)、單克隆抗-T細胞抗體0KT3))、抗-血栓形成劑(例如，肝磷脂、肝磷脂衍生物、尿激酶、PPack(右旋苯丙氨酸脯氨酸精氨酸氯甲基酮)、抗凝血酶化合物、血小板受體拮抗劑、抗凝血酶抗體、抗血小板受體抗體、阿斯匹林、雙嘧啶胺醇、魚精蛋白，水蛭素，前列腺素抑制劑，和血小板抑制劑)和抗氧化劑(例如，丙丁酚，維生素A，抗壞血酸，生育酚，輔酶Q-10，谷光甘肽，L-半胱氨酸，N-乙酰基半胱氨酸)以及局部麻醉劑。作為另一個實施例，該細胞可以與瘢痕抑制因子(如在第5，827，735號美國專利中描述的，其內容結合于此作為參考)一起給予。在一個具體實施方式
中，本發明的細胞組合物作為未分化的細胞給予，S卩，如在生長培養基中培養的細胞。可替代地，該細胞組合物可以在培養過程中暴露于刺激分化朝向希望表型例如成骨表型的條件之后給予。本發明的細胞組合物可以手術植入、注射、遞送(例如，通過導管或注射器)，或以其它方式直接或間接給予至需要修復或加強的部位。這些細胞可以借助基質(例如，一種三維支架)而給予。這些細胞可以與傳統藥用載體一起給予。本發明的細胞或其組合物或組分(例如，ECM，細胞溶解產物，條件培養基)的給予途徑包括肌內、眼用、腸胃外(包括靜脈內)、動脈內、皮下、口服以及鼻道給予。腸胃外給藥的特定路徑包括但不限于肌內、皮下、 腹膜內、大腦內、心室內、腦心室內、胸內、腦池內，脊柱內和/或脊柱周圍的給藥路徑。當這些細胞以半固態或固態裝置進行給予時，手術植入體內的精確位置通常是一種合適的給藥方式。然而，液體或流體藥物組合物可以給予至一個更廣泛的位置(例如，整個廣泛受影響的區域)，其從該位置移動到一個特定位置，例如，通過對化學信號產生反應。其它具體實施方式
涵蓋了通過給予含細胞組分(例如，細胞溶解產物或其組分) 或產物(例如，通過遺傳修飾產生的胞外基質、營養和其它生物因子)的藥物組合物的治療方法。用于給予本文所述的細胞組合物的劑型和方案是根據良好的醫療實踐而開發的， 考慮了個體患者的情況，例如正治療病癥的性質和程度、年齡、性別、體重和整體醫療條件以及其它為醫療人員所知的因素。因此，待給予患者的藥物組合物的有效量是通過本領域已知的這些考慮來確定的。在本發明的一些具體實施方式
中，在用本發明的細胞組合物開始治療之前抑制一個患者的免疫反應可能是不必要的或不希望的。因此，利用同種異體或甚至異基因的MEMPs 進行移植在某些情況下可耐受的。然而，在其它情況下，可能希望或需要在細胞治療開始之前藥理學地抑制患者的免疫反應。這可以通過系統或局部應用免疫抑制劑來實現，或者通過在囊化裝置中遞送該細胞而實現。MEMI^s可以被包被于膠囊中，該膠囊允許細胞和治療因子所需的營養物質和氧氣透過，而該細胞對免疫體液因子和這些細胞是不可透過的。優選地，該膠囊密封材料是低變應原性的，易于穩定定位于靶組織中，并且對該植入的結構提供額外保護。這些以及其它用于減少和消除對該植入細胞的免疫反應的方式在本領域中是已知的。作為一種替代方案，MEMPs可以經過遺傳修飾以減少其免疫原性。移植的MEMPs在生存患者中的存活可通過利用各種掃描技術來確定，例如計算機化軸向斷層檢查(CAT或CT)掃描、磁共振成像(MRI)或正電子發射斷層成像術(PET)掃描。移植物存活的確定也可通過死后取出靶組織，并通過肉眼或通過一個顯微鏡來檢查而完成。可替代地，這些細胞可利用特異于特定種系細胞染劑來處理。移植的細胞也可通過提前并入示蹤性染料如羅丹明或熒光素標記的微球體、快藍(fast blue)、二苯甲酰胺、含鐵微粒或遺傳性引入報道子基因產物如牛乳糖或葡糖醛酸糖苷酶來而加以鑒定。移植的MEMPs功能性整合入患者可通過檢查被損傷或不健全的功能的恢復而進行評估，例如關節或骨功能的恢復或功能的加強。本發明的細胞組合物可以包括一種或多種生物活性因子，例如但不限于生長因子、分化誘導因子、細胞存活因子如胱冬酶抑制劑、抗炎劑如Ρ38激酶抑制劑或血管生成因子如VEGF或bFGF。生物活性因子的一些實例包括PDGF_bb、EGF、bFGF、IGF-I和LIF。可替代地，待移植的MEMI^s可以經過遺傳改造，以表達這些生長因子、抗氧化劑、 抗凋亡劑、抗炎劑或血管生成因子。本發明的藥物組合物可以包含MEMPs的同源或異源群體、胞外基質或其細胞溶解產物或其在藥用載體中的條件培養基。用于本發明細胞的藥用載體包括合適的有機或無機載體物質，其不會與本發明的細胞或其組合物或組分有害地反應。在它們是生物相容性的程度上，合適的藥用載體包括水、鹽溶液(如林格氏溶液)、乙醇、油、明膠和碳水化合物如乳糖、直鏈淀粉或淀粉、脂肪酸酯、羥甲基纖維素和聚乙烯基吡咯烷。這樣的制劑可被消毒殺菌，如果需要，其可與輔助試劑如潤滑劑、防腐劑、穩定劑、潤濕劑、乳化劑、用于影響滲透壓的鹽、緩沖劑和著色劑混合。適合用于本發明中的藥用載體在本領域是已知的，且在例如 Pharmaceutical Sciences(17. sup. th Ed.，Mack Pub.Co.，Easton，Pa.)禾口 WO 96/05309 中有描述，每一個的內容均結合于此作為參考。可將一種或多種其它組分添加到移植的細胞中，包括所選的胞外基質組分，如本領域已知的一種或多種類型的膠原、和/或生長因子、富血小板血漿以及藥物。可替代地， 本發明的細胞可經遺傳改造以表達和產生生長因子。本文中提供了關于本發明細胞的遺傳改造的詳細內容。在一個非限制性具體實施方式
中，制備包含本發明細胞的制劑，用于直接給予至需要新組織如骨組織產生的部位。例如，但不限制地，該MEMPs可被懸浮在一種用于注射的水凝膠溶液中。用于本發明的合適水凝膠的實例包括自組裝肽如RAD16。可替代地，含有這些細胞的水凝膠溶液植入前可允許固化，例如在一個模具中形成細胞分散于其中的一種基質。或者，一旦該基質已被固化，則該細胞制備物可以被培養，以使這些細胞在植入前經有絲分裂而擴增。該水凝膠是一種有機聚合物(天然的或合成的)，其通過共價鍵、離子鍵或氫鍵交聯產生三維開放的晶格結構，其捕獲水分子而形成凝膠。可用來形成凝膠的材料的實例包括離子交聯的多糖(如藻酸鹽)及其鹽、肽、聚磷嗪和聚丙烯酸酯，或者嵌段聚合物如聚環氧乙烷-聚丙二醇嵌段共聚物，其分別通過溫度或PH進行交聯。在一些具體實施方式
中，MEMPs的支撐物是生物可降解的。在本發明的一些具體實施方式
中，制劑包含一種可原位聚合的凝膠，例如美國專利申請公開 2002/002洸76 ；Anseth et al. , J. Control Release, 78 (1-3) :199-209(2002)； Wang et al. , Biomaterials, 24 (22) :3969-80(2003)中所描述的。在一些具體實施方式
中，該聚合物在含水溶液如水、緩沖鹽溶液或水-乙醇溶液中至少部分可溶，所述溶液具有帶電側基或其單價離子鹽。帶有可與陽離子反應的酸性側基的聚合物實例是聚(磷腈)、聚(丙烯酸)、聚(甲基丙烯酸)、丙烯酸和甲基丙烯酸的共聚物，聚(乙酸乙烯酯)和磺酸化聚合物，如磺酸化聚苯乙烯。也可以使用通過丙烯酸或甲基丙烯酸與乙烯基醚單體或聚合物反應形成的具有酸性側基的共聚物。酸性基團的實例是羧酸基、磺酸基、鹵化的(優選氟化的)醇基、酚OH基和酸性OH基。帶有可與陰離子反應的堿性側基的聚合物實例是聚(乙烯基胺)、聚(乙烯基吡啶)、聚(乙烯基咪唑)以及一些亞胺基取代的聚磷腈。該聚合物的銨鹽或季鹽也可由主鏈氮或側鏈亞氨基形成。堿性側基的實例是氨基和亞氨基。室溫下，藻酸鹽可在水中與二價陽離子進行離子交聯，形成一種水凝膠基質。由于這些溫和的條件，藻酸鹽已成為用于雜交瘤細胞囊化最通用的聚合物，例如在Lim的第 4，352，883號美國專利中描述的。在該Lim工藝中，包含待封裝生物材料的含水溶液被懸浮于水溶性聚合物的溶液中，所述懸浮液形成微滴，其通過接觸多價陽離子而被配制成分散的微膠囊，然后該微膠囊的表面用多氨基酸進行交聯，而在囊化的材料周圍形成半透膜。聚磷腈是其主鏈由交替單鍵和雙鍵分隔的氮和磷構成的聚合物。每一個磷原子共價鍵合至兩條側鏈。適合于交聯的聚磷腈其大部分的側鏈基團是酸性的并且能夠與二價或三價陽離子形成鹽橋。優選的酸性側基的實例是羧酸基和磺酸基。水解穩定的聚磷腈由具有羧酸側基(其通過二價或三價陽離子如Ca2+或Al3+進行交聯)的單體形成。通過并入具有咪唑、 氨基酸酯或丙三醇側基的單體可合成通過水解作用而降解的聚合物。例如，一種聚陰離子的聚[雙(苯氧基)]磷腈(PCPP)可以被合成，其可于室溫或低于室溫下在含水介質中與溶解的多價陽離子進行交聯，以形成水凝膠基質。生物可降解的聚磷腈具有至少兩種不同類型的側鏈能夠與多價陽離子形成鹽橋的酸性側基以及在體內條件下可水解的側基，例如咪唑基、氨基酸酯、甘油和葡糖基。側鏈的水解導致聚合物的腐蝕。水解性側鏈的實例是未取代和取代的咪唑以及氨基酸酯，其中該基團通過一個氨基鍵鍵合于磷原子(其中兩個R基團以這種方式連接的磷腈聚合物被稱為聚氨基磷腈)。對于聚咪唑磷腈，在聚磷腈主鏈上的“R”基團的一部分是咪唑環，通過一個環氮原子連接于主鏈中的磷。其它“R”基團可以是不參與水解的有機殘基，如甲基苯氧基基團或其它在Allcock et al. ,Macromolecule 10 =824(1977)的科學論文中示出的基團。該水凝膠材料的合成方法以及用于制備這種水凝膠的方法在本領域中是已知的。制劑中也可包括其它組分，包括但不限于下列組分中的任何一種(1)用來提供適當PH和等滲壓性的緩沖劑；(2)潤滑劑；(3)用來在給予部位或附近保持該細胞的粘性材料，包括例如藻酸鹽、瓊脂和植物膠；以及(4)可以在給予部位產生預期效應的其它細胞類型，例如組織或其物化特性形成的增強或修飾，或者作為用于細胞生存的支撐物，或者抑制炎癥或排斥。這些細胞可以用一種適當的創面覆蓋物加以覆蓋以防止細胞離開該部位。 這樣的創面覆蓋物對于本領域的熟練技術人員是已知的。骨組織補片的配制MEMPs在預成型孔中的培養或共培養使得能夠制造預定厚度和體積的組織補片。 所得組織補片的體積取決于孔的體積和該孔中MEMPs的數量。最佳預定體積的組織可通過改變前述參數中的一個或兩個而以常規實驗進行制備。孔的細胞接觸表面可以涂覆一種阻礙MEMPs粘附至該細胞接觸表面的分子。優選的涂覆劑包括硅基試劑，即二氯二甲基硅烷，或聚四氟乙烯基試劑，即TEFLON。用于將材料涂覆硅基試劑，特別是二氯二甲基硅烷的流程步驟在本領域是熟知的。參見，例如Sambrook et al. (1989) “ Molecular Cloning A Laboratory Manual " , Cold Spring Harbor Laboratory I^ress，其內容結合于此作為參考。應當理解，阻止細胞附著于孔表面的其它生物相容性試劑在本發明的實踐中可能很有用。可替代地，該孔可由一種柔韌性或可塑性生物相容材料(其本身不允許細胞附著)鑄成。阻止這種細胞附著的優選材料包括但不限于瓊脂糖、玻璃、未處理的細胞培養塑料和聚四氟乙烯(即TEFLON)。未處理的細胞培養塑料，即還沒有用具有靜電荷的材料處理或由其制成的塑料是商業上可獲得的，并且可從例如i^alcon Labware,Becton-Dickinson, Lincoln Park, N.J.購得。然而，前述材料不用于限制的目的。應當理解，本身可阻止MPC 或其衍生后代附著的任何其它柔韌性或可塑性生物相容材料在本發明的實踐中可能很有用。懸浮液中的MEMPs可以接種到預成型孔中并進行培養。MEMPs可以在該孔的培養基中被誘導分化成成軟骨或成骨表型，或可能在接種到孔中之前已被誘導分化。可通過加入培養基而將細胞稀釋到細胞密度為約IxlO5至IxlO9個細胞/毫升。這些細胞可以形成一種細胞的內聚塞(cohesive plug)。所述細胞內聚塞可以從該孔移出，經手術植入組織缺損中。預期未分化的MPC或其衍生后代可以原位分化，從而在體內形成組織。骨缺損可以通過利用計算機輔助層析成像(CAT掃描)、X射線檢查、磁共振成像 (MRI)、滑液或血清標記物的分析，或通過本領域已知的任何其它工藝步驟而進行推理鑒定。哺乳動物中的缺損在關節鏡檢查或開放性手術過程中也易于肉眼鑒定。該缺損的治療可利用本文中披露的方法和組合物在關節鏡檢查或開放性手術過程中實現。因此，一旦該缺損被鑒定，則該缺損可通過以下步驟進行治療(1)在預定部位手術植入利用本文所述方法學制備的組織補片，以及( 允許該組織補片整合入預定部位處。該組織補片具有的最適大小和形狀可使得當該補片被植入所述缺損中時，植入的組織的邊緣直接接觸該缺損的邊緣。另外，可在手術過程中將該組織補片固定于適當位置。 這可以通過手術將該補片利用生物可降解的縫固定入所述缺損中和/或通過將生物粘合劑施加于該補片和缺損的分界區域而實現。在某些情況下，損傷的組織可以在該組織補片植入前手術切除。利用支架移植MEMPs本發明的細胞組合物或其共培養物可以接種到一個三維支架上或其內部并植入體內，其中接種的細胞將在該框架上增殖并與患者的細胞共同在體內形成置換組織，如骨組織。例如但不限制地，該支架可以被設計，以使該支架結構(1)在沒有后續降解的情況下支撐接種的細胞；( 從接種直至該組織移植物由宿主組織重建的時間內支撐這些細胞；( 允許接種的細胞附著、增殖并在體外發育成具有足夠機械整體性以支撐其自身的組織結構，此時該支架被降解。支架設計的綜述由Hutmacher，J. Biomat. Sci. Polymer Edn.，12(1) :107-124(2001)提供。本發明的支架可聯合任意一種或多種生長因子、細胞(例如，干細胞，骨髓細胞， 軟骨細胞，成軟骨細胞，骨細胞，成骨細胞，破骨細胞，骨襯細胞，或它們的前體)、藥物或上述的刺激組織形成或其它方式增強或改進本發明實踐的其它組分一起給予。待接種于該支架上的MEMPs可進行遺傳改造以表達生長因子或藥物。本發明的細胞可用來在體外產生新的組織，其隨后可被植入、移植或以其它方式插入患者需要組織修復、置換或加強的部位。在一個非限制性具體實施方式
中，本發明的細胞用來在體外產生三維組織構建體，其隨后植入體內。作為產生三維組織構建體的一個實例，參見第4，963，489號美國專利，其內容結合于此作為參考。例如，本發明的細胞可“接種”到一個三維框架或支架上，并在體外增殖或生長，以形成可植入體內的活組織。本發明的細胞可在培養皿內自由生長至亞融合或融合，從培養基轉移接種于三維框架上。利用高濃度細胞(例如，約IO6至切107個細胞/毫升)接種該三維框架將實現在相對較短的時間周期內建立三維支撐物。可用于本發明的支架實例包括無紡墊、多孔泡沫或自組裝肽。無紡墊可以是例如利用由合成的乙醇酸和乳酸的可吸收共聚物(PGA/PLA)構成的纖維形成，該共聚物以商標名VICRYL出售。由例如利用諸如冷凍干燥或凍干過程(如在美國專利第6，355，699中論述的)形成的聚(ε -己內酯)/聚(乙醇酸)(PCL/PGA)共聚物構成的泡沫也是可能的支架。也可以使用諸如自組裝肽(例如，RAD16)的水凝膠。這些材料經常用作用于組織生長的支撐物。三維框架可由陶瓷材料制成，其包括但不限于磷酸一鈣、磷酸二鈣、磷酸三鈣、磷酸α三鈣、磷酸β三鈣和磷酸四鈣；羥磷灰石；氟磷灰石；硫酸鈣；氟化鈣；氧化鈣；碳酸鈣；磷酸鈣鎂；生物學活性玻璃如 BIOGLASS(University of Florida, Gainesville, Fla.) 及其混合物。目前在市場上存在多種合適的多孔生物相容性陶瓷材料，如SURGIBON(Unilab Surgibone, Inc. , Canada)、END0B0N(Merck Biomaterial France, France)、CEROS(Mathys, A. G. , Bettlach, Switzerland)禾口 INTERPORE (Interpore, Irvine, Calif. , United States), 以及礦化膠原骨嫁接產品，如 HEALOS(Orquest，Inc.，Mountain View, Calif.)和 VIT0SS， RHAK0SS,以及C0RT0SS (Orthovita，Malvern, Pa.)。該框架可以是天然和/或合成材料的混合物、摻合物或復合物。在一些具體實施方式
中，該支架為籠子形式。在一個優選具體實施方式
中，該支架涂覆有膠原。根據一個優選的具體實施方式
，該框架是氈制品，其可由多纖維絲(復絲)構成， 而該多纖維絲由生物可吸收材料，例如PGA、PLA、PCL共聚物或摻合物或透明質酸制成。該纖維絲利用標準的織物加工技術(包括卷邊、剪切、梳理和縫制)制成氈制品。
在另一個優選的具體實施方式
中，本發明的細胞被接種于可為復合結構的泡沫支架上。另外，該三維框架可以被模制成有用的形狀，如為耳朵外部、骨、關節或體內待修復、 置換或加強的特定結構的形狀。在另一個優選的具體實施方式
中，這些細胞被接種到構成用于植入患者體內的假體裝置的框架上，如描述于第6，200, 606號美國專利中的，其內容并入本文作為參考。如其中所描述的，多種臨床有用的假體裝置已被開發用于骨和軟骨嫁接手術。(參見例如，Bone Grafts and Bone Substitutions. Ed. Μ. B. Habal & A. H. Reddi，W. B. Saunders Co.，1992)。 例如，有效的膝關節和髖關節置換裝置已被且將持續廣泛用于臨床環境中。許多這些裝置是利用各種具有較低免疫原活性的無機材料制造的，其在體內安全地發揮作用。已經過試驗證實的合成材料的實例包括鈦合金、磷酸鈣、陶瓷羥磷灰石以及各種不銹鋼和鈷-鉻合金。這些材料提供結構支撐并且可形成宿主血管形成和細胞遷移可在其內部發生的支架。該框架可以在接種本發明的細胞之前加以處理以便增強細胞附著。例如，在用本發明的細胞接種之前，尼龍基質可用0. 1摩爾乙酸加以處理并在多聚賴氨酸、PBS和/或膠原中孵育以涂覆該尼龍基質。聚苯乙烯可利用硫酸類似地加以處理。另外，該三維框架的外部表面可加以修飾以改善細胞的附著或生長以及組織分化，如通過等離子噴涂的框架或加入一種或多種蛋白質(例如，膠原，彈力纖維，網狀纖維)、糖蛋白、糖胺聚糖(例如，硫酸肝素，4-硫酸軟骨素，6-硫酸軟骨素，硫酸皮膚素，硫酸角質素)、細胞基質和/或其它材料如但不限于明膠、藻酸鹽、瓊脂、瓊脂糖和植物膠，等等。在一些具體實施方式
中，該支架由可使其為非血栓形成性的材料構成或用該材料進行處理。這些處理和材料也可促進并維持內皮生長、遷移和胞外基質沉積。這些材料和處理的實例包括但不限于天然材料如基膜蛋白如層粘連蛋白和IV型膠原，合成材料如 ePTFE，以及分段的聚氨酯脲硅酮如 PURSPAN(The Polymer Technology Group, Inc., Berkeley, Calif.)。這些材料可進一步加以處理以使該支架為非血栓形成性的，這些處理包括抗血栓形成劑如肝素，以及改變該材料表面電荷的處理如等離子噴涂。在一些具體實施方式
中，支架的表面是粗糙的。例如，在本發明的某些方面，所提供的支架帶有一種凹槽和山脊紋型。該凹槽優選小于約500微米，較優選小于約100微米， 并且最優選在約10納米與10微米之間。這樣的“微槽”允許細胞可以根據表面凹槽的引導進行排列和/或遷移。在一些具體實施方式
中，在培養基中再造體內存在的細胞微環境很重要，以使本發明的細胞在植入體內或在體外應用之前的生長程度可以變化。另外，可以在這些細胞接種之前、過程中或之后將生長因子、軟骨形成分化誘導劑、成骨誘導劑以及血管形成因子加入培養基中，以引發利用MPC或其衍生后代或其共培養物的分化和組織形成。該三維框架可以被修飾以使細胞的生長和其上的組織產生增強，或使得對植入物的排斥減弱。因此，可以將一種或多種生物學活性化合物(包括但不限于抗炎劑、免疫抑制劑或生長因子)添加到該框架。胞外基質或細胞溶解產物的治療應用作為本發明植入這些細胞或其產生的活組織的可替代方案，需要組織修復、置換或加強的患者可獲益于MEMPs的組分或產物的給予(尤其是在它們已經過遺傳修飾的情況下)，如由這些細胞產生的胞外基質(ECM)或細胞溶解產物。
在一些具體實施方式
中，本發明的細胞已在體外培養后，例如通過利用本文描述的三維支架系統，使得希望量的ECM分泌到該框架上。一旦ECM分泌到該框架上，即可移出這些細胞。ECM可以進一步處理以備后用，例如作為一種可注射的制劑。在一些具體實施方式
中，這些細胞被處死并且將細胞碎片(例如，細胞膜)從該框架移出。這個過程可以多種不同方式實施。例如，活組織可在沒有低溫保存劑(低溫防腐劑)時在液氮中被閃凍，或者該組織可被浸入無菌蒸餾水中，以使這些細胞響應于滲透壓而破裂。一旦這些細胞被處死，則細胞膜可被破壞并且通過用溫和去垢劑漂洗(如EDTA、 CHAPS或兩性離子去垢劑)處理而移出細胞碎片。利用溫和去垢劑漂洗的優點在于其溶解膜結合的蛋白(其經常是高度抗原性的)。可替代地，該組織可被酶促消化和/或用破碎細胞膜的試劑進行提取。這種酶的實例包括但不限于透明質酸酶、分散酶(中性蛋白酶)、蛋白酶、核酸酶(例如，脫氧核糖核酸酶和核糖核酸酶)。去垢劑的實例包括非離子去垢劑例如烷基芳基聚醚醇 (TRIT0NTMX-100)，辛基苯氧基聚乙氧基-乙醇(Rohm and Haas Philadelphia, Pa.), BRIJ-35，聚乙氧基乙醇月桂酰醚(Atlas Chemical Co. , SanDiego, Calif.)，聚山梨酸酯 20 (TWEEN 20 )，聚乙氧基乙醇山梨聚糖單月桂酸酯(Rohm and Haas)，聚乙烯月桂酰醚 (Rohm andHaas)；以及離子去垢劑例如十二烷基硫酸鈉，硫酸化高級脂肪醇，在支化或未支化鏈中含有7至22個碳原子的磺酸化烷烴和磺酸化烷基芳烴。包含ECM的支架可以如上所述在治療上使用。可替代地，ECM可從該支架收集。 ECM的收集可以以多種方式來實現，取決于例如該支架為生物可降解的還是非生物可降解的。例如，如果該框架為非生物可降解的，則ECM可通過使該框架經受聲波降解、高壓水射流、機械刮取或者用去垢劑或酶的溫和處理或上述處理的任意組合而移出。如果該框架是生物可降解的，則ECM可通過例如使該框架在溶液中降解或溶解而收集。可替代地，如果該生物可降解框架由一種其自身可與ECM —起注射的材料構成，則該框架和ECM可全部加工用于隨后的注射。可替代地，ECM可通過用于從非生物可降解框架收集ECM的上述方法中的任何一種從該生物可降解框架移出。優選地，所有收集工藝加以設計，以便不會使由本發明的細胞所產生的ECM或細胞溶解產物變性。現在，將參考以下非限制性實施例對本發明的具體實施方式
進行詳細描述。材料和方法患者，細胞培養和抗體按照由南澳大利亞皇家阿德萊德醫院的倫理委員會(theethicscommittee of the Royal Adelaide Hospital, South Australia)批準的方法步驟，在知情同意后，骨髓(BM)吸出物獲自正常成人志愿者Q0-35歲)的后髂嵴。Bone marrow mononuclear cells (BMMNC) were obtained by centrifugation over Ficoll 1.077g/ml(Lymphoprep, Nycomed,Oslo,Norway)at 400g for 30 minutes(min)and then washed and resuspended with Hank ' s buffered saline solution containing 1 % bovine serum albumin and IOmM HEPES, pH 7. 35 (HBSS).。原代BMSSC培養物如前所述在補充了 20%胎牛血清、 2mM L-谷氨酰胺和100 μ M L-抗壞血酸-2-磷酸鹽的α-MEM(最小必需培養基)中建立 (Gronthos et al. J Cell Sci. 116 :1827-1835,2003) 如下所述，在血清充足的培養基中傳代培養后，BMSSC克隆細胞系通過從第14天的集落(來源于STR0-lto7VCAM-l+分選的細胞)的限制性稀釋而形成，用于增殖、RT-PCR、免疫組織化學和發育研究。STR0-1抗體可從R&D Systems購得(Minneapolis，US)。其他在本發明中很有用的抗體列于表1中。磁激活的細胞分選(MACS)可如前所述而實施(Gronthos et al. , Isolation, Purification and In Vitro Manipulation of Human Bone Marrow Stromal Precursor Cells. In Marrow Stromal Cell Culture. Owen M. and Beresford J. N. (eds). Cambridge University Press UK, Chapter 3, p. 26-42,1998 ；Gronthos and Simmons, Blood 85(4) :929_940，1995)。大約 IxlO8 BMMNC與終濃度10 μ g/ml的STR0-1上清液在冰上共孵育60分鐘。標記了 STR0-1 的細胞用HBSS洗滌，分別重懸于Iml含1/50稀釋的生物素化的羊抗鼠IgM(y-鏈特異； Southern Biotechnology Associates,Birmingham, AL)或者生物素化的羊抗鼠 IgG( γ-鏈特異；SouthernBiotechnology Associates,Birmingham, AL)的 HBSS，冰上 45 分鐘。隨后， 細胞在MACS緩沖液中洗滌兩次，重懸于其中加入100 μ 1抗生蛋白鏈菌素微珠(Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, F. R. G.)的 900 μ 1 MACS 緩沖液中。所述細胞在冰上孵育 15 分鐘后，將抗生蛋白鏈菌素-熒光素異硫氰酸酯(鹽)(FITC)直接加入懸浮液，再放置5分鐘。按照制造商的說明，細胞在Mini MACS磁性柱(柱容量IO7個細胞，Miltenyi Biotec) 上分離。熒光激活的細胞分選(FACS)將STRO-Γ MACS分離的細胞用軛合抗生蛋白鏈菌素的FITC進行標記，然后在冰上利用純化的抗-⑶106 (VCAM-I)抗體6G10或抗-⑶146 (MUC-18)抗體或同型對照 lB5(10yg/ml)孵育30分鐘，洗滌并在冰上用軛合藻紅蛋白(PE)的羊抗-鼠IgG抗體 (1/50 ；Southern Biotechnology Associates， Birmingham， AL) # 胃 20 .中。禾Ij M FAC^tarpuis 流式細胞儀(Becton Dickinson, Sunnyvale, CA)來分選細胞。將 STRO-Itoi/ ⑶106+或STRO-Itoi/⑶146+細胞在在補充了 20%胎牛血清、L-谷氨酰胺2mM、抗壞血酸-2-磷酸鹽(100 μ M)的α-MEM中進行培養，于含5% C02、37°C的濕潤大氣環境下啟動原代培養。利用間接免疫熒光進行單色和雙色流氏細胞計數分析這個步驟之前已經報道過(Gronthoset al. , Isolation, Purification and In Vitro Manipulation of Human Bone Marrow Stromal Precursor Cells. In Marrow Stromal Cell Culture. Owen M. and Beresford J. N. (eds). Cambridge University Press UK, Chapter 3，p. 26-42,1998)。簡而言之，MPC或MPC衍生細胞的初代培養物通過胰蛋白酶/EDTA消化而釋放，然后在冰上孵育30分鐘。大約MlO5細胞被洗滌并重懸于200 μ 1第一抗體混合物中，冰上1小時。第一抗體混合物由飽和濃度的鼠IgM單克隆抗體STR0-1和 /或抗人堿性磷酸酶(ALP，B4-78)的鼠IgG單克隆抗體組成。對于利用與細胞內抗原反應的抗體進行的染色，細胞首先用PBS洗滌，然后用70%乙醇冰上處理10分鐘以透化細胞，然后在染色前進行洗滌。鼠同型IgM和IgG陰性對照Mabs在相同條件下進行處理。用第一抗體孵育后，洗滌細胞并使其暴露于飽和水平的羊抗鼠IgM 鏈特異-FITC(1/50稀釋) 以及羊抗鼠IgG Y-鏈特異-PE (1/50稀釋)或羊抗兔Ig-特異-PE (1/50稀釋)(Southern Biotechnology Associates)，終體積100 μ 1。細胞在冰上孵育45分鐘后洗滌兩次，然后在FAX FIX(補充了 (v/v)D-右旋糖、2% (w/v)0. 01 %疊氮化鈉的PBS)中固定。隨后細胞在Epics -XL-MCL 流氏細胞儀上進行分析(BeckmanCoulter，Hialeah, FL)。羧基熒光素乙酰乙酸琥珀酰亞胺酯(CFSE)標記細胞通透性熒光素基染料CFSE用來研究在MPC衍生細胞發育過程中分裂相關的表型和功能變化。CFSE共價結合于細胞的胞質組分，得到均勻的明亮熒光，其隨細胞分裂而均等分布于子細胞之間。利用流式細胞儀，該技術可實現達8個細胞分裂周期的分辨率。 將體外擴增的MPC衍生細胞的單細胞懸浮液洗滌一次，再懸浮在Iml的PBS/0. BSA中， 加入2 μ 1的5mM CFSE (終濃度10 μ M)，然后在37°C孵育lOmin。通過加入5體積的冰冷培養基α -ΜΕΜ-10使染色淬火，并在冰上孵育5min。將這些細胞在培養基中洗滌三次，然后以低密度IxlO5鋪于培養瓶(T-25)中。在各個時間點，通過胰蛋白酶-EDTA解離細胞并利用流式細胞計數進行分析。逆轉錄酶聚合物酶鏈式反應(RT-PCR)分析如上所述，原代MPC衍生培養物通過胰蛋白酶/EDTA處理而釋放，然后用 STR0-1上清液染色。洗滌后，將細胞與軛合藻紅蛋白的羊抗鼠IgM抗體(1/50 ； Southern Biotechnology Associates,Birmingham, AL) 一起在冰上再孵育 20 分鐘。利用 FAC^tarpuis 流式細胞儀(Becton Dickinson, Sunnyvale, CA)分選細胞。根據制造商的建議，從hlO6個 STRO-Ibri或STRO-Idim分選的原代細胞、軟骨細胞團以及其它誘導培養物制備細胞總RNA， 并利用RNAzoIB提取方法(Biotecx Lab. Inc. ,Houston,TX)使其溶解。從每一個亞群分離的RNA隨后用作cDNA合成的模板，而cDNA利用First-strand cDNA合成試劑盒(Pharmacia Biotech，Uppsala，Sweden)制備。利用以前描述的一種標準流程(Gronthos et al.，J. Bone andMin. Res. 14 =48-57,1999)，通過PCR擴增評估各種轉錄體的表達。用于本研究中的引物對示于表2。擴增后，將每一個反應混合物通過1. 5%瓊脂糖凝膠電泳進行分析并通過溴化乙錠染色使其可視化。RNA完整性通過GAPDH的表達來評估。CFU-F的體外分化我們之前已報道了用于誘導在補充了 10% FCSUOOyM L-抗壞血酸_2_磷酸鹽、 地塞米松1(ΓΜ和3mM無機磷酸鹽的α -MEM中培養的人BM基質細胞在體外形成礦化骨基質的條件(Gronthos etal.，Blood. 84 :4164_4173，1994)。礦物沉淀通過陽性 von Kossa 染色進行鑒定。脂肪形成如前所述在0.5mM甲基異丁基甲基黃嘌呤、0.5μΜ氫化可的松和60Mm吲哚美辛存在的情況下進行誘導(Gimble，J.M. Marrow stromal adipocytes. In Marrow stromal cell culture. Owen M. and Beresford J. N. (eds) · Cambridge :Cambridge University Press UK. Chapter 5，p. 67-87，1998)。油紅 0 染色用來鑒定充滿脂質的脂肪細胞。軟骨形成分化如前所述在用10ng/mlTGF-i3 3處理的聚集培養物中加以評估 (Pittenger et al.，kience，284 143-147，1999)。骨形成的體內分析將來源于代2-3的STR0-lto7VCAM-l+細胞的粘附細胞胰蛋白酶化，與40mg羥磷灰石/磷酸三鈣陶瓷顆粒(Zimmer Corporation, Warsaw, IN)進行混合，然后如前所述植入兩月齡 SCID 小鼠的背側皮下間隙中(Gronthos et al. ,Proceedings of the National Academy of Sciences (USA), 97 (25) : 13625-13630，2000)。這些方法步驟依據一個批準的動物方案來實施(Adelaide University AEC#M/079/94)。將植入物在6-8周后取回，在4%多聚甲醛中固定2天，隨后在10% EDTA中再脫鈣10天，然后包埋入石蠟。制備該植入物的 5μπι切片并用蘇木精和伊紅進行染色(Gronthos et al.，Proceedings of the National Academy of Sciences (USA), 97 (25) :13625_13630，2000)，用于組織學分析。神經組織發育。將單層培養物在成神經細胞A培養基(Ivitrogen/GIBCO+5%馬血清，胎牛血清，L-谷氨酰胺OmM)，轉鐵蛋白(100yg/ml)，胰島素Qyg/ml)，維甲酸 0.5mM，腦衍生的神經營養因子(lOng/ml))中進行培養。脂肪發育。將單層培養物在補充了 10%胎牛血清、L-谷氨酰胺2mM、抗壞血酸-2-磷酸鹽(100 μ Μ)、0. 5mM甲基異丁基黃嘌呤、0. 5mM氫化可的松、60mM吲哚美辛的 α-MEM(JRH)中進行培養。軟骨發育將在聚丙烯管中的顆粒培養物在補充了牛血清白蛋白、轉鐵蛋白 (100 μ g/ml)、胰島素O μ g/ml)、L_谷氨酰胺QmM)、抗壞血酸_2_磷酸鹽(100 μ M/ml)、地塞米松(IO^8M)和 BMP-7(50ng/ml)、TGF33(10ng/ml)的 α-MEM 中進行培養。骨骼肌/心肌發育。將單層培養物在補充了 10%胎牛血清、L-谷氨酰胺QmM)、 抗壞血酸-2-磷酸鹽(100 μ M/ml)以及5-氮胞苷(5 μ M/ml)的α-MEM(JRH)中進行培養。上皮發育。將單層培養物在補充了牛垂體提取物(50yg/ml)、表皮生長因子 (lOng/ml)、氫化可的松(0.5 μ g/ml)、胰島素(5 μ g/ml)的角化細胞基本培養基中進行培養。成骨細胞、腱、韌帶或成牙本質細胞發育。將單層培養物在補充了 10%胎牛血清、 L-谷氨酰胺2mM、抗壞血酸-2-磷酸鹽(100 μ M)、地塞米松(I(T7M)和ΒΜΡ-2 (50ng/ml)的 α-MEM(JRH)中進行培養。周細胞或平滑肌細胞發育。將體外培養的MPC培養物以20，000個/孔在補充了 10%胎牛血清、L-谷氨酰胺2mM、抗壞血酸-2-磷酸鹽(100 μ M)、血小板源性生長因子-BB (10ng/ml)(懸浮于48孔板的200 1的基質膠(matrigel)中)的α -MEM(JRH)中進
行培養。實施例1 Atro-Idim培養細胞是較高定型的而Mro-Itoi細胞是較低定型的前體細胞。我們之前已報道了，多能間充質前體細胞(MPC)可根據STRO-Itoi/ VCAM-I (CD 106) + 或 STRO-ltoi/MUC_ 18 (CDl46) + 表型從成人骨髓單核細胞純化(Gronthos et al. J. Cell Sci 116 1827—1835，2003;Shi and Gronthos JBMR 18(4) :696-704, 2003 ;PCTAU2004/000416)。在特定培養條件下MPC群體易于進行體外擴增(Gronthos et al. J.Cell Sci 116 :1827-1835, 2003) 0我們現在根據與不同細胞系相關的標記物，分別利用逆轉錄聚合物酶鏈反應(RT-PCR)和流式細胞計數分析在mRNA和蛋白質水平提供表征體外擴增的MPC后代的數據。同時，在體外擴增后，所有新鮮分離的骨髓MPC高水平表達 STR0-1 (Stro-Ibri)，而大多數細胞下調 STR0-1 表達(Stro-Idim) (Gronthos et al. J. Cell Sci 116:1827-1835,2003)。在首次系列實驗中，采用半定量RT-PCR分析來檢查各種由 STRO-Itum或STRO-Itoi群體表達的種系相關基因的基因表達譜，所述群體通過熒光激活細胞分選加以分離(圖1A)。每個標記物的相對基因表達參照管家基因GAPDH的表達利用 ImageQant軟件進行評估(圖1B、C)。另外，雙色流式細胞計數分析連同STR0-1抗體用來檢查體外擴增MPC的蛋白質表達譜，這基于其更寬范圍的細胞系相關標記物的表達(圖2)。基于STRO-Idim和STRO-Itoi培養細胞的基因和蛋白質表達的通用表型概括展示于表3中。 該數據表明，體外擴增的STRO-Itoi MPC表現出與血管周細胞相關的標記物(包括血管生成素-1、VCAM-I、SDF-I、IL-I β、TNF α和RANKL)的差異性較高表達。相反地，STRO-Idim體外擴增細胞表達較高水平的nestin、GFAP, osterix、骨鈣蛋白、S0X9、GATA-4、瘦素和平滑肌肌球蛋白重鏈。因此，相比于STRO-Idim細胞，似乎體外擴增的STRO-Itoi MPC表現為一種更不成熟和血管周樣表型，而STRO-Idim細胞表現為一種較高定型的前體細胞型(包括成軟骨細胞、成骨細胞、成脂肪細胞、表皮細胞、神經祖細胞和成心肌細胞)的表型特性。STRO-Idim 和STRO-Itoi培養細胞的蛋白質和基因表達譜之間的比較總結在表3、4和5中。新鮮分離的MPCs和MPCs的STRO-Itoi培養子代(MEMPs)之間標記物表達的比較示于表6中。實施例2 =STRO-Idim和STRO-Itoi培養細胞(MEMPs)在體外分化的差異能力接下來，我們考察了在STRO-Idim和STRO-Itoi培養細胞的基因和蛋白質表達譜之間觀察到的差異是否反映其分化成多種細胞系的能力方面的任何功能性差異。體外擴增的 STRO-Itoi/⑶146+衍生細胞的培養物如上所述基于其STR0-1抗原表達而通過FACS進行分離。隨后FACS分離的STRO-Idim和STRO-Ibri培養細胞置于用于脂肪(圖3)、骨(圖4)和軟骨(圖幻形成的誘導條件下。在所有情形下，相比于STRO-Idim培養細胞，STR0-lto4§ 養細胞在指定條件下，顯示出較高的脂肪、骨和軟骨形成的能力。來自這些實驗的數據證實了以上獲得的基因和蛋白表達結果，表明STRO-Itoi培養細胞是一種含有高比例較低定型的前體細胞的原始群體，其可被影響以在適當培養條件下朝向任何特定細胞系分化(圖3、4、 5)，并且可以稱為MPC。相反，STRO-Idim培養細胞含有高比例的代表各種種系的定型細胞并且可以稱為TSCC。我們提出STRO-Itwm群體是異源性的，包含單獨定型于一系列不同組織類型的細胞。實施例3 =STRO-Ibri細胞(MEMPs)可修飾體外和體內組織特異性定型細胞(TSCC) 的生長能力代表不同發育階段的兩種不同的體外擴增MPC衍生細胞群體的鑒定對于來源于 STRO-Ibri細胞的完全培養制備物應用于臨床治療具有重要啟示。將最初研究設計為考察原始的較低定型的STRO-Itoi培養MPC對較成熟和定型STRO-Idim培養TSCC生長的影響。設計實驗將FACS分離的STRO-Idim培養TSCC(其之前已用一種熒光標簽CFSE進行標記)與百分比不斷增加的FACS分離的STRO-Itoi培養MPC—起加入。圖6示出了標記的STRO-Ito細胞的增殖受未標記的STRO-Itoi細胞存在的影響。當一個CFSE標記的細胞分裂時，兩個子細胞含有親細胞的一半熒光。因此，不同代的子細胞被表示為具有成比例不斷降低的熒光強度的熒光分布，其中在直方圖的最右方(垂線相交的)的曲線表示起始STRO-Idim群體的點(圖6)。該數據表明，較高比例的STRO-Idim細胞被刺激以增加其增殖速率，其中可證實更多細胞在加入大于5% STRO-Itoi細胞后經歷至少3至4次分裂。因此，為了獲得未分裂 MPC衍生細胞的可持續且有效的體外擴增，應遵循該培養物需要多于5%的STRO-Itoi細胞存在于群體中。實施進一步考察以確定更原始的較低定型STRO-Itoi培養MPC是否也可以影響體內TSCC的增殖能力。兩個體內模型用來解決這個問題。第一個模型采用無胸腺裸大鼠， 其進行了左前降支(LAD)冠狀動脈的結扎并且在48小時后注射鹽水、FACS分離培養的人 STRO-Itun^P STRO-Itoi細胞以及無STR0-1的骨髓單核細胞的新鮮吸出物(圖7)。兩周后，將動物處死，固定心臟組織并同時用兩種單克隆抗體進行染色第一個與大鼠(而不是人) Ki67抗原選擇性反應，第二個與心肌細胞標記物肌鈣蛋白I反應。雙重染色的細胞(表示增殖的大鼠心肌細胞)通過免疫過氧化物酶技術進行檢測。與接受鹽水或STRO-Idim人細胞的對照動物相比，接受STRO-Itoi人細胞的動物表現出2. 5-5倍較高數量的增殖大鼠心肌細胞(圖7)。第二個模型利用無胸腺裸大鼠，其皮下注射了大鼠成膠質細胞瘤細胞，其組成性地分泌VEGF。兩周后，該大鼠接受瘤內注射鹽水、FACS分離的STRO-Idim或STRO-Itoi人細胞(圖8)。一周后，將動物處死，固定腫瘤組織并同時用兩種單克隆抗體進行染色第一個與平滑肌細胞表達的α平滑肌肌動蛋白抗原反應，第二個與脈管內皮細胞表達的vWF抗原反應。雙重染色的結構(表示既含內皮又含平滑肌的微動脈和動脈)通過免疫過氧化物酶技術進行檢測。與接受鹽水或STRO-ItumA細胞的對照動物相比，接受STRO-Itoi人細胞的動物在腫瘤內的細胞注射部位處表現出3. 5-8倍較高數量的微動脈和動脈(圖8)。在已注射人細胞處的遠端部位處未觀察到差異。實施例4 來源于STR0-1陽性細胞的細胞培養物中的STRO-ItoiMEMPs的數量增加在證實STRO-Itoi培養MEMPs促進更多TSCC增殖的能力之后，我們接下來考察了一系列生長因子增加體外擴增的STRO-ItoiMPC比例的作用(圖9)。將已建立的來源于STR0-ltoi/tD146+分離的骨髓細胞的培養物在補充了 10% FCS(A)或一系列因子包括 IxlO-7M Ia ,25- 二羥基維生素 D3(1，25D)) (B)、10ng/ml 血小板源性生長因子(PDGF) (C)、 10ng/ml 腫瘤壞死因子 a (TNF- a ) (D) ； 10ng/ml 白介素-1 β (IL-1 β ) (E)以及 30ng/ml 基質衍生因子1-a (SDF-1 a ) (F)的基礎培養基中培養5天，用STRO-ImAb進行染色(圖9)。 發現這些因子極大地增加體外STRO-ItoiMPC的數量。為了研究這些因子如何在體外擴增后增高表達STRO-Itoi的細胞百分數的機制，將培養的Mro-Itoi如方法中所述用CFSE進行標記，然后暴露于各種因子。圖10示出了一個代表性實驗，其中IL-I β增加用CFSE標記(如方法中所述)的MPC的增殖能力。將細胞在lOng/ml IL-I β存在的情況下培養5天，用STRO-ImAb染色并如上所述進行分析。發現IL-I β通過增加亮STRO-Γ骨祖細胞的數量而增加MPC分裂的次數。1，25D、PDGF-BB, TNF- a、IL-I β和SDF-1 α用來刺激MPC時也可獲得類似結果。實施例5 增加STRO-Itoi細胞的增殖也增加Mro-Idim細胞的數量在各種因子存在的情況下增加STRO-Itoi培養MEMPs比例的能力也與STRO-Idim 細胞的數量增加相關。例如，STR0-lto7AlkPhOS+(圖10B)，一種與成骨前細胞一致的表型 (Gronthos et al.，JBone Miner Res. 14 :47-56,1999 ；Pan et al.，Bone 34(1) :112-23, 2004)。因此，我們考察了表型的這種變化是否也與誘導的STRO-ItoiMPC分化為骨形成細胞 (成骨細胞)的能力增加相關。圖11示出了在骨誘導劑地塞米松存在的情況下，IL-I β不僅刺激STRO-I陽性MPC增殖，而且增強其骨形成能力。濃度為0.01叫/!111的11^10顯著將MPC數量增加到未處理的對照培養物的136. 6士 1. 2% (圖11Α)，在大于0. lng/ml的濃度下獲得了平臺效應。將體外擴增的MPC后代如方法中所述在骨誘導條件存在的情況下接種到M孔板中。這些細胞也用濃度為lOng/ml的IL-I β進行處理，每周給培養物“補充” 含IL-I β的新鮮培養基。根據所述方法確定絕對胞外基質鈣濃度。結果表明，相比于未處理的細胞(圖11Β)，用IL-I β處理的細胞(圖11C)中礦物沉積增加。經IL-I β處理的細胞中鈣水平在第4周和第6周顯著高于未處理細胞的鈣水平。圖12中展示的數據表明，IL-I β刺激STRO-IfciMPC的增殖，引起骨祖細胞的擴增， 同時隨后加入另一種分化試劑地塞米松，誘導堿性磷酸酶(ALP)表達和STR0-1表達喪失， 有效地提高體外功能性成骨細胞的數量。不同因子可擴增和調節STRO-ImMPC群體的概念進一步在體內進行測試。從Mro-ItoiMPC擴增的的半融合的體外繼代培養物在存在或缺乏 PDGF-BB(10ng/ml)(另一種已知可增高體外擴增的STRO-IbhMPC數量的因子)下進行培養 (請參考圖9C)。PDGF誘導的和非誘導的細胞制備物接著如方法中所述用羥磷灰石/磷酸三鈣顆粒(HA/TCP)共移植到免疫缺陷的小鼠中。8周后，對收集的移植物進行研究表明，如通過kion Imaging量化的(圖13A)，與未處理的對照培養物(圖13B)相比，用PDGF-BB 預處理的培養物表現出顯著較多的異位成骨(圖13C)。實施例6 缺乏可檢測的ALP表達的未定型STRO-ItoiMPC持續存在于STR0-1選擇的BM衍生的MPC體外培養物中。人BM吸出物如方法中所述進行制備，MPC利用mAb STR0-1通過MACS分選而回收。利用間接免疫熒光和流氏細胞儀，評估MACS陽性部分(用來建立初始或PO培養物的細胞)中高水平表達STRO-I抗原(STRO-Itoight)的細胞比例，發現其占總群體的22. 4% (數據未顯示)。然后這些細胞以IxlO4細胞/cm2進行接種，在無血清培養基中培養，直至其達到 80-90%的融合，如前所述的(Gronthos et al. Journal of Cell Science 116 1827-1835, 2003) 0每次傳代時，細胞如方法中所述進行解離，并以IxlO4細胞/cm2進行再接種。每一代的細胞樣品，對其STR0-1和TSCC標記物堿性磷酸酶(ALP)的表達進行染色。 如在圖14中示出的，4次傳代后，盡管高水平表達STR0-1的細胞(缺乏可評估水平的TSCC 標記物ALP)比例降至12. 7%，這些培養物仍然包含相當數量的STRO-Itoi ALPlffiMPs。表1 本專利中采用的抗體
權利要求
1.一種通過將TSCC與具Mro-ltoi、ALP_表型的MEMP共培養或通過將TSCC與從具有 Stro-Ibri,ALP"表型的MEMP獲得的培養上清液、細胞裂解物或部分接觸來刺激TSCC增殖的方法。
2.根據權利要求1所述的方法，其中所述MEMP以大于的水平與TSCC—起存在于共培養條件中。
3.根據權利要求1所述的方法，其中所述MEMP以大于5%的水平與TSCC—起存在于共培養條件中。
4.根據權利要求1所述的方法，其中所述MEMP以大于10%的水平與TSCC—起存在于共培養條件中。
5.根據權利要求1所述的方法，其中所述MEMP以大于20%的水平與TSCC—起存在于共培養條件中。
6.根據權利要求1所述的方法，其中所述MEMP以大于40%的水平與TSCC—起存在于共培養條件中。
7.根據權利要求1到6中任一項所述的方法，其中所述TSCC在體外培養。
8.根據權利要求1到6中任一項所述的方法，其中TSCC與MEMP或來自MEMP的培養上清液、細胞裂解物或部分的共培養發生于接受者體外，且共培養的TSCC在體內被遞送至所述接受者的組織部位。
9.根據權利要求1到6中任一項所述的方法，其中所述TSCC對于所述接受者是內源性的且位于組織部位的原位，并且所述TSCC的共培養在MEMP或來自MEMP的培養上清液、細胞裂解物或部分被遞送到所述組織部位后發生于體內。
10.根據權利要求1到9中任一項所述的方法，其中所述TSCC定型于組織類型，所述組織類型選自由骨、神經組織、脂肪、軟骨、骨骼肌、心肌、上皮組織、成骨細胞、腱、韌帶成牙本質細胞、周細胞、平滑肌、神經膠質組織、脈管組織、內皮組織、造血組織、肝組織和腎組織組成的組。
11.根據權利要求1到9中任一項所述的方法，其中所述TSCC為造血細胞。
12.一種用于富集具有Mro-ltoi、ALP—表型的MEMP的方法，所述方法包括在一種或多種刺激因子存在的情況下培養MPC或其子代，所述刺激因子選自由Ia，25_ 二羥基維生素 D3(1，25D)、血小板源性生長因子(PDGF)、腫瘤壞死因子α (TNF-α )、白介素-1 β (IL-1 β ) 和基質衍生因子1 α (SDF-1 α )組成的組。
13.根據權利要求12所述的方法，其中所述MPC或其子代在兩種或多種刺激因子存在的情況下培養。
14.根據權利要求12或權利要求13中任一項所述的方法，其中所述MPC或其子代已經在體外被擴增。
15.根據權利要求12到13中任一項所述的方法，其中所述MPC是未擴增的分離MPC群體。
16.根據權利要求12到15中任一項所述的方法，其中，相對于未受刺激的對照，所述刺激引起具有Mro-Itoi、ALP_表型的MPC子代增加超過10%。
17.根據權利要求12到15中任一項所述的方法，其中，相對于未受刺激的對照，所述刺激引起具有Mro-Itoi、ALP_表型的MPC子代增加超過50%。
18.根據權利要求12到17中任一項所述的方法，其中所述MPC來源于任何一種或多種組織，其選自由骨髓、牙髓細胞、脂肪組織和皮膚組成的組，或者可能更廣泛的來源于脂肪組織、牙齒、牙髓、皮膚、肝、腎、心、視網膜、腦、毛囊、腸、肺、脾、淋巴結、胸腺、胰腺、骨、韌帶、骨髓、腱和骨骼肌。
19.根據權利要求12到18中任一項所述的方法，其中所述MPC或其子代在一種或多種刺激因子存在的情況下在體內培養。
20.根據權利要求19所述的方法，其中所述刺激因子與包括MPC或其子代的細胞群體一起給予組織部位。
21.根據權利要求20所述的方法，其中所述方法進一步包括給予外源性TSCC。
22.—種產生組織特異性定型細胞群體的方法，所述方法包括在一種或多種刺激因子存在的情況下培養包括MPC或其子代和TSCC的細胞群體，所述刺激因子選自由Ia，25_ 二羥基維生素D3 (1，25D)、血小板源性生長因子(PDGF)、腫瘤壞死因子α (TNF- α )、白介素-1 β (IL_1 β )和基質衍生因子1 α (SDF-1 α )組成的組；以及使所述培養的群體處于使MPC或TSCC分化偏向于特異性組織類型的條件。
23.根據權利要求22所述的方法，其中所述組織類型選自由心肌、平滑肌、脈管組織、 骨組織、軟骨組織、神經組織、脂肪組織、上皮組織和內皮組織組成的組。
24.—種包括MPC或其子代和刺激因子的組合物，所述刺激因子選自由1α，25_ 二羥基維生素D3(1，25D)、血小板源性生長因子(PDGF)、腫瘤壞死因子α (TNF-α )、白介素-1 β (IL-1 β )和基質衍生因子1 α (SDF-1 α )組成的組。
25.根據權利要求M所述的組合物，進一步包括TSCC。
26.根據權利要求M或權利要求25所述的組合物，進一步包括使TSCC或MPC或兩者分化偏向于特異性組織類型的因子。
27.根據權利要求沈所述的組合物，其中所述組織類型選自由心肌、平滑肌、脈管組織、骨組織、軟骨組織、神經組織、脂肪組織、上皮組織和內皮組織組成的組。
28.權利要求M到27中任一項所述的組合物在制造用于產生或修復組織的藥物中的應用。
29.根據權利要求觀所述的應用，其中所述組織選自由心肌、平滑肌、脈管組織、骨組織、軟骨組織、神經組織、脂肪組織、上皮組織和內皮組織組成的組。
30.一種具有STRO-Itoi、ALP_表型的經分離的遺傳修飾的MEMP。
31.根據權利要求30所述的經分離的遺傳修飾的MEMP，其已經過遺傳修飾以表達異種蛋白。
32.根據權利要求31所述的經分離的遺傳修飾的MEMP，其中所述異種蛋白選自由Ia， 25-二羥基維生素D3 (1，25D)、血小板源性生長因子(PDGF)、腫瘤壞死因子α (TNF-α )、白介素-1 β (IL-1 β )和基質衍生因子1 α (SDF-1 α )、合成的糖皮質激素如地塞米松、或骨形態發生蛋白如BMP-2、BMP-3、BMP-4、BMP-6或BMP-7組成的組。
全文摘要
本發明涉及多能擴增間充質前體子代(MEMP’s)，其特征在于早期發育標記物STRO-1bri和ALP。本發明還涉及用于生產MEMP’s的方法以及MEMP’s在治療性應用中的用途。同時本發明提供了一種通過將TSCC與具Stro-1bri、ALP-表型的MEMP共培養或通過將TSCC與從具有Stro-1bri、ALP-表型的MEMP獲得的培養上清液、細胞裂解物或部分接觸來刺激TSCC增殖的方法。
文檔編號C12N5/0775GK102391981SQ20111034907
公開日2012年3月28日 申請日期2005年9月26日 優先權日2004年9月24日
發明者安德魯·克里斯托弗·威廉·贊內蒂諾, 斯坦·格龍托斯 申請人:成血管細胞系統公司