專利名稱：一種抗菌脂肽的制備方法及其在獸醫藥中的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種抗菌脂肽的制備方法及其在獸醫藥中的應用，屬于生物醫藥技術領域。
背景技術：
近年來，研究人員發現某些細菌分泌的產物也具有抗菌活性，目前研究較多的主要有兩種(陽離子抗菌肽和脂肽)。脂肽主要來源于一些由細菌、酵母菌、真菌分泌的代謝產物，結構上含親水的肽鍵和親油的脂肪烴鏈兩部分。其中肽鏈上的氨基酸能以內酯或酰胺鍵形式與脂肪烴鏈的羧基、羥基或氨基結合形成環狀結構。脂肽分子中脂肪鏈部分的碳原子數一般在12 19之間，肽鏈部分的氨基酸殘基數在6 13之間。枯草芽孢桿菌在自然生長和發酵培養后期產生的脂肽類抗生素是其最重要的抗菌物質。脂肽類抗生素包括伊枯草菌素(iturins)、泛革素(fengycins)和表面活性素(surfactin)，其中伊枯草菌素和泛革素具有很強的抗真菌活性，而表面活性素對病毒、腫瘤、支原體都有很高的抑制活性。抗菌脂肽屬于抗菌肽家族中的一種，具有抗菌活性高、抗菌譜廣、結構穩定，對人、獸、畜無害等特性。其抗菌機理和一般抗生素有所不同，它是在微生物的細胞膜上形成孔洞而使細胞內容物流出從而導致細菌死亡或螯合一、二價陽離子從而抑制了細菌代謝過程中多種酶類活性，不易產生耐藥性。此外，由于是肽類物質在自然界中容易分解，極具潛力開發為一種新型、環境友好的生物藥物。迄今已有近千種天然抗菌肽被分離出來，但是天然抗菌肽的分離純化過程煩瑣且費用較高，另外多數抗菌肽的活性較弱難以達到應用的水平，有些抗菌肽還具有副作用。當前制備抗菌脂肽的方法主要有生物材料提取法，化學合成法和基因工程表達等方法。天然抗菌脂肽在生物材料中含量低，分離也較煩瑣，采用這種方法獲得的樣品難以滿足應用需求。化學合成雖可以完成，但成本較高。因此，研發新型、廣譜、易于大量制備與純化而又有較高活性的抗菌脂肽將有利于降低成本，并為開發代替抗生素的抗菌藥物提供更大的發揮空間。本發明提供了一種抗菌脂肽的生物制備方法，產量高，生產成本低。所得抗菌脂肽對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌均有較好的抗菌活性，應用于獸醫藥臨床實踐中，取得了良好的效果。

發明內容
本發明的目的之一是提供一種抗菌脂肽的制備方法。本發明的另外一種目的是提供一種抗菌脂肽的純化方法。本發明方法制備的抗菌脂肽應用于獸醫藥領域取得了良好的效果，提供了一種抗菌脂肽的新用途。本發明所述的抗菌脂肽制備方法為種子菌的培養、發酵培養、抗菌脂肽的粗提、抗菌脂肽的純化、抗菌脂肽的鑒定與制備結果評價。
上述種子菌培養中的種子菌包括枯草芽孢桿菌(B. subtilis Al株，購于中國普通微生物菌種保藏中心)。其中，種子菌的制備方法為B. subtilisAl株菌種轉接至LB平板上，37°C培養 24h ；用接種環取活化菌種，接種于含有100ml LB液體培養基的錐形瓶中，培養過夜作為種子菌。上述的發酵培養中的培養基包括NS-L-I培養基(葡萄糖20.0g，L-谷氨酸鈉 5. 0g, MgS040. 5g, KCl 0. 5g, KH2P04 lg, FeS04 0. 15mg, MnS04 5. Omg, CuS04 0. 16mg，蒸餾水 1000ml，pH 7. 0。)。其中，NS-L-I培養基可用其中葡萄糖含量調整，乳糖，L-谷氨酸鈉，微量元素等及培養基PH值進行調整后的培養基取代。其中，發酵條件為種子菌接種量(1% 15%)，發酵溫度(20°C 37°C)，發酵時間(24 72h)，發酵轉速(50 300r/min)，發酵初始pH為pH 5. 0 9. 0。上述抗菌脂肽的粗提過程為取制備的發酵菌液在PH2.0 5.0條件下經 7000rpm離心lOmin，去除菌體，取上清用6mol/L HCL分別調節所需pH，再以7000rpm離心 lOmin，收集沉淀。將沉淀在70°C的烘箱中下燥20h，即得抗菌脂肽粗提物。上述抗菌脂肽的純化過程采用酸-醇法，具體步驟為取未烘干的抗菌脂肽粗提物，加入醇類物質后用NaOH調節pH至5. O 8. 0，再用醇類物質抽提2次并將其抽提液合并，然后將其a^phadex LH-20層析柱，最后用離心濃縮儀濃縮至完全干燥，即得抗菌脂肽的純化物。上述抗菌脂肽的鑒定過程為取抗菌脂肽純化物溶解在少量醇類中，再取一定量的該抗菌脂肽溶液分多次點樣于硅膠板上，待點樣點風干后，放入盛有展開劑的層析缸中飽和30min，展開劑的組成為氯仿甲醇水=65 25 4 (體積比)，然后，待展開劑到達距硅膠板上層邊緣2cm左右時取出，待有機溶劑充分揮發后，再采用含有0. 5%茚三酮的丙酮溶液噴霧顯色。上述抗菌脂肽的的制備結果評價方法為70°C的烘箱中干燥所得純化的抗菌脂肽，產量需大于6. 8g/L。上述提純的抗菌脂肽的抗菌效果評價方法如下選用如下表的10種動物病原菌，將其培養至對數期后，分別制備成菌懸液，活菌數大于106CFU/ml，備用。將素瓊脂固體培養基融化后倒入培養皿，待冷卻凝固后，等距平穩地將3個已經滅菌的牛津杯放在固體培養基平面上，再將分別培養細菌的LB半固體培養基融化，冷卻至40°C 50°C，移取Iml菌懸液到培養基中，混勻，然后用移液管移取8ml含菌培養基至素瓊脂平板上。待凝固后，拔出牛津杯，用移液槍取30 μ 1不同濃度的純抗菌脂肽加入牛津孔內，以生理鹽水作對照。每個處理重復3次，最后細菌放置于37°C培養箱培養 24h。培養完成后，取出培養皿測量抑菌圈的直徑大小。純抗菌脂肽的抗菌譜
權利要求
1.一種抗菌脂肽的制備方法，其特征在于該方法包括種子菌的培養、發酵培養、抗菌脂肽的粗提、抗菌脂肽的純化、抗菌脂肽的鑒定與制備結果評價。
2.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于上述種子菌培養中的種子菌包括枯草芽孢桿菌(B. subtilis Al株，購于中國普通微生物菌種保藏中心)。
3.根據權利要求2所述的制備方法，其特征在于種子菌的制備方法為B.subtilis Al株菌種轉接至LB平板上，37°C培養24h ；用接種環取活化菌種，接種于含有100ml LB液體培養基的錐形瓶中，培養過夜作為種子菌。
4.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于上述的發酵培養中的培養基包括 NS-L-I 培養基(葡萄糖 20. 0g, L-谷氨酸鈉 5. 0g, MgS040. 5g，KCl 0. 5g，KH2P04 lg，FeS04 0. 15mg, MnS04 5. Omg, CuS04 0. 16mg，蒸餾水 1000ml，pH 7. 0。)。
5.根據權利要求4所述的制備方法，其特征在于=NS-L-I培養基可用葡萄糖含量調整， 乳糖，L-谷氨酸鈉，微量元素及培養基pH值進行調整后的培養基取代。
6.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于種子菌接種量是 15%，發酵溫度是20°C 37°C，發酵時間為M 72小時，發酵轉速為50 300轉/分鐘，發酵初始pH 為 pH 5. 0 9. 0。
7.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于抗菌脂肽粗提物的制備過程是發酵菌液在pH2. 0 5. 0條件下經7000rpm離心10分鐘，去除菌體，取上清用6mol/L HCL分別調節所需PH，再以7000rpm離心10分鐘，收集沉淀，將沉淀在70°C的烘箱中干燥20小時，即得。
8.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于抗菌脂肽的純化過程采用酸-醇法， 具體步驟是取未烘干的抗菌脂肽粗提物，加入醇類物質后用NaOH調節pH至5. 0 8. 0，再用醇類物質抽提2次并將其抽提液合并，然后將其過kphadex LH-20層析柱，最后用離心濃縮儀濃縮至完全干燥，即得抗菌脂肽的純化物。
9.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于抗菌脂肽的鑒定方法為抗菌脂肽純化物溶解在少量醇類中，再取一定量的該抗菌脂肽溶液分多次點于硅膠板上，待點樣點風干后，放入盛有展開劑的層析缸中飽和30分鐘，展劑的組成為氯仿甲醇水= 65 25 4(體積比)，然后，待展開劑到達距硅板上層邊緣2厘米時取出，待有機溶劑充分揮發后，再采用含有0.5%茚三酮丙酮溶液噴霧顯色。
10.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于所得純化的抗菌脂肽，量大于6.8 克/升。
11.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于該制備方法獲得的抗菌肽可用于抑制革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌。
12.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于該制備方法獲得的抗菌肽可用于對斷奶仔豬和白羽肉雞細菌病的治療作用。
全文摘要
本發明涉及一種抗菌脂肽的制備方法及其在獸醫藥中的應用，通過抗菌脂肽制備工藝的優化，使抗菌脂肽產量較高，達到了6.8g/L。該制備方法獲得的抗菌脂肽具有廣譜抗菌作用，尤其對革蘭氏陽性菌(葡萄球菌和鏈球菌)效果更佳。將其應用到獸醫臨床試驗中，發現其對豬病原菌(副嗜血桿菌、胸膜肺炎放線桿菌、鏈球菌、多殺性巴氏桿菌、肺炎雙球菌等)和雞病原菌(沙門氏菌、大腸桿菌、巴氏桿菌等)均有良好的抗菌效果，具有無毒副作用，無耐藥性和抗菌譜廣的優點，更無化學藥物類抗菌素殘留等食品安全問題，可成為新型抗生素替代品，具有良好的應用前景。
文檔編號C12R1/125GK102559816SQ20111036165
公開日2012年7月11日 申請日期2011年11月16日 優先權日2011年10月13日
發明者韓健寶 申請人:韓健寶