專利名稱：胰腺癌易感基因無創檢測試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明屬于分子生物學領域，涉及生物醫學和生物技術，具體涉及ー種胰腺癌易感基因檢測試劑盒，根據檢測結果從基因水平評估胰腺癌發病的風險級別，并作為預防和治療胰腺癌的方向指導。
背景技術：
胰腺癌是ー種常見的惡性腫瘤，占全部惡性腫瘤的2%。約95%的胰腺癌為導管細胞腺癌，其具有惡性度高，早期診斷率低，療效欠佳，預后差等特點，病死率接近100 %，總體5年期生存率小于5%。據世界衛生組織公布的統計資料，近年來，胰腺癌的發病率在全球范圍內呈逐年上升趨勢，2008年全世界新發胰腺癌病例278684例，發病率為3. 9/10萬， 2010年全世界新發胰腺癌病例達293541例，增加5. 06%。在我國，胰腺癌的發病率也呈逐年上升趨勢，其標化病死率在10年間(1991-2000年)從I. 46/10萬增長到2. 38/10萬，增加了近I倍。2008年，我國新發胰腺癌病例44217例，發病率為2. 8/10萬，可以判斷，隨著世界人ロ的迅速增長和年齡的日趨老齡化，胰腺癌必將成為威脅人類健康的主要疾病。引起胰腺癌的危險因素很多，研究表明其主要因素為兩類遺傳因素和環境因素。 遺傳方面，可能與基因突變、基因多態性、表觀遺傳學等因素引起的遺傳易感性提聞有關。最近的研究表明，胰腺癌的發生與XPC、MTHFR、CYP2E1、GSTTl四個遺傳易感基因密切相關。XPC 全稱 xeroderma pigmentosum, complementation group C,即著色性干皮病基因組C，它是核苷酸切除修復系統的重要成分，與HHR23B形成復合物，在切除修復初始階段發揮識別DNA損傷的功能。一旦DNA修復功能出現異常，細胞惡性轉化的概率也將增加。 XPC蛋白水平表達的高低是影響細胞損傷識別的關鍵因子之一。存在DNA損傷修復缺陷的個體，對癌癥的易感性増加，這可能與基因組不穩定性的増加有夫。XPC缺陷可導致遺傳不穩定性的發生，從而致使胰腺癌的發生。PAT多態是XPC第9號內含子的多個AT雙核苷酸的插入缺失多態，其具有3種基因型PAT (未缺失)、PAT (雜合缺失)、PAT (純和缺失)，對中國人群關聯分析報道，PAT(純和缺失)和PAT(雜合缺失)型患者其DNA損傷修復能力降低，基因組穩定性下降，抵抗致癌物質的能力降低，大大增加了胰腺癌的發病風險。因此， XPC基因PAT單核苷酸多態性位點可作為胰腺癌發病的風險預測因子和指針之一。MTHFR 的全稱為 5,10-methylenetetrahydrofolate reductase (NADPH),是亞甲基四氫葉酸還原酶蛋白編碼基因。MTHFR作為ー種還原酶，可將葉酸代謝通路中的5，10-亞甲基四氫葉酸轉化為5-甲基四氫葉酸，從而有利于葉酸生物學功能的發揮。此外，由于葉酸代謝通路與同型半胱氨酸代謝通路耦聯，因此，MTHFR酶活性的正常發揮有利于保持血液中的同型半胱氨酸水平，不至于出現高同型半胱氨酸血癥，為DNA甲基化和蛋白質甲基化提供甲基。此外葉酸的中間代謝產物在核苷酸合成過程中也有重要的作用，通過ー碳単位代謝為嘌呤環的形成提供碳原子。MTHFR基因的缺陷將導致機體多個基礎生化途徑的紊亂，包括細胞周期調控、DNA復制、DNA甲基化修飾等，由此將引發癌癥、心腦血管等多種病癥。研究發現，MTHFR C677T單核苷酸多態性位點與胰腺癌患病風險有夫，當葉酸攝入和吸收水平高時，677T/T和677C/T基因型人群患胰腺癌風險較低，這兩類基因型被視為胰腺癌保護基因，而677C/C基因型人群在MTHFR酶耐熱性較強，不利于dUMP轉變為dTMP，容易造成DNA 損傷，胰腺癌發生風險明顯增強。CYP2E1又稱細胞色素P450 2E1，是細胞色素P450酶體系的一員，是藥物代謝的核心體系成員。該酶主要分布于肝臟，其最適底物多為親脂性小分子化合物，包括苯、乙醇、氯乙烯、亞硝胺等，其中大部分為前致癌物和前毒物。CYP2E1能夠將這些前致癌物和前毒物活化，從而給機體帶來傷害。目前研究表明，CYP2E1基因上多態現象能改變其編碼酶的表達水平與活性，因而影響到機體對環境毒物的代謝能力，導致多種癌癥的發生。CYP2E1存在 RsaI多態性，影響了 CYP2E1基因的轉錄。研究發現，CYP2E1 RsaI等位基因在胰腺癌病例組和對照組中的分布具有顯著差異，是胰腺癌發生的易感因素，特別是在與酒精協同作用下， 患胰腺癌的風險進一步上升。CYP2E1 RsaI單核苷酸多態性位點的基因型有C/C、C/T、T/T 三種，其中T/T基因型與胰腺癌密切相關，該風險基因型攜帶者，CYP2E1基因表達的蛋白將使苯、乙醇、氯乙烯、亞硝胺等前致癌物轉化為致癌物質，使個體患胰腺癌的風險驟然升高。 因此，CYP2E1 RsaI單核苷酸多態性位點可以用于胰腺癌的遺傳檢測與風險評估。谷胱甘肽硫轉移酶(GSTs)屬于II相代謝酶，能促進各種親電子的化合物(包括環境致癌物及其中間代謝產物)與谷胱甘肽結合，形成易溶于水的化合物排出體外，是與毒物或致癌物的解毒代謝有關的酶類，已知人類GSTs家族中GSTMl和GSTTl與腫瘤發生的關系最為密切。GSTTl具有present和null兩個等位基因，其中present具有正常的酶活性，而null基因是指結構基因缺失的純合子，又稱為空白基因型，缺乏GSTTl酶活性。正常的GSTTl酶活性可能通過促進致癌劑的親電作用及從體內的排除而保護易感組織，防止體細胞的DNA突變，而GSTTl基因的純和缺失可能會降低或喪失機體代謝及排出致癌物的功能，從而具有較大的腫瘤危險性。因此，GSTTl基因缺失可以作為胰腺癌發生的重要危險因素。綜上所述，鑒于XPC、MTHFR、GYP2E1、GSTT14個基因與胰腺癌的發生有著重要的關聯關系，因此，可以將這些基因做為預測和篩查胰腺癌的潛在指標，通過對這些胰腺癌易感基因的檢測，能在預防和治療胰腺癌以及降低疾病的發生率方面起到不容忽視的重要作用。

發明內容
本發明基于XPC基因上單核苷酸多態性位點PAT(未缺失/雜合缺失/純和缺失)， MTHFR基因上單核苷酸多態性位點C677T(rsl801133)，CYP2E1基上單核苷酸多態性位點 Rsal(rs2031920), GSTTl基因是否缺失(Null/Present)這4個單核苷酸多態性位點基因型可作為評估胰腺癌發病的危險因子的基礎上，研制一種胰腺癌易感基因檢測試劑盒。該試劑盒包括檢測XPC基因上PAT(未缺失/雜合缺失/純和缺失)，MTHFR基因是否缺失(Null/ Present), GSTTl基因是否缺失(Null/Present)，CYP2E1基因上RsaI這4個單核苷酸多態性位點基因型的特異性引物對及DNA測序引物；PCR反應組件(包括Taq酶、dNTP混合液、反應緩沖液、ddH20等)；PCR產物純化組件(包括SAP酶、ExoI酶、ddH20等)；
DNA測序反應組件(包括BigDye mix，EDTA溶液、100%乙醇溶液、70 %乙醇溶液、 HIDI 溶液、ddH20 等)。本發明試劑盒的組分和含量包括PCR 反應體系10XPCR 反應緩沖液 2. 5ul ；25mM dNTP 混合液 0. 2ul ；5U/ul Taq DNA聚合酶0. 125ul ;20uM特異性引物對(每條引物各0. 25ul) ；ddH2019. 175ul。PCR 產物純化體系lU/ul SAP 酶 0. 75ul ;10U/ul Exol 酶 0. 375ul ; ddH203. 875ul。測序反應體系25%BigDye mix lul ；3. 2uM DNA 測序引物 lul ;125mMEDTA 溶液 lul ; 100% 乙醇溶液 15ul ;70% 乙醇溶液 30ul ;HIDI 溶液 8ul ;ddH202ul。本試劑盒供一人份檢測應用，試劑盒的保存溫度為-20°C。
具體實施例方式下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明 而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，或按照制造廠商 所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數按重量計算。除非另行定義，文中所使用的所有專業與科學用語與本領域熟練人員所熟悉的意 義相同。此外，任何與所記載內容相似或均等的方法及材料皆可應用于本發明中。文中所 述的較佳實施方法與材料僅作示范之用。實施例1.檢測試劑盒的使用1、抽提DNA模板刮取受檢者口腔黏膜上皮細胞，用酚氯仿法抽提基因組DNA。2、PCR擴增反應使用檢測試劑盒中的PCR反應組件，其中，含有下列引物對(l)XPC PAT(+/_)正向引物5' -TAGCACCCAGCAGTCAAAG-3'XPC PAT(+/_)反向引物5' -TGTGAATGTGCTTAATGCTG-3'(2)MTHFR(C677T)正向引物5' -AGGGAGGCTTCAACTACGC-3'MTHFR(C677T)反向引物5' -GCGGTTGAGGGTGTAGAAGT-3'(3)CYP2El(RsaI)正向引物5' -AAGTGATTTGGCTGGATTGTA-3'CYP2El(RsaI)反向引物5' -ATACAGACCCTCTTCCACCTT-3'(4)GSTT1 (Null/Present)正向引物5' TTCCTTACTGGTCCTCACATCTC3'GSIT1 (Null/Present)反向引物5' TCACCGGATCATGGCCAGCA3'PCR擴增的反應體系為10XPCR反應緩沖液2. 5iil ;25mM的dNTP混合液0. 2 yl、 5U/ul Taq 酶 0. 125 yl、DNA 模板 1 yl (12_15ng 左右)、20uM 正向引物反向引物各 0. 25u 1, ddH20 19. 175u 1 ；XPC PAT (+/-)擴增反應條件為94°C預變性 5min，然后 94°C變性 lmin，50°C lmin 退火，72°C延伸50s，35個循環后，72°C延伸10分鐘。MTHFR(C677T)擴增反應條件為94°C預變性 5min，然后 94°C變性 55s，50°C lmin 退火，72°C延伸lmin，32個循環后，72°C延伸10分鐘。GSTT1 (Null/Present)、GSTT1 (Null/Present)擴增反應條件為94 °C 預變性DNA測序反應組件(包括BigDye mix，EDTA溶液、100%乙醇溶液、70 %乙醇溶液、 HIDI 溶液、ddH20 等)。本發明試劑盒的組分和含量包括PCR 反應體系10XPCR 反應緩沖液 2. 5ul ；25mM dNTP 混合液 0. 2ul ；5U/ul Taq DNA聚合酶0. 125ul ;20uM特異性引物對(每條引物各0. 25ul) ；ddH2019. 175ul。PCR 產物純化體系lU/ul SAP 酶 0. 75ul ;10U/ul Exol 酶 0. 375ul ; ddH203. 875ul。測序反應體系25%BigDye mix lul ；3. 2uM DNA 測序引物 lul ;125mMEDTA 溶液 lul ; 100% 乙醇溶液 15ul ;70% 乙醇溶液 30ul ;HIDI 溶液 8ul ;ddH202ul。本試劑盒供一人份檢測應用，試劑盒的保存溫度為-20°C。5min，然后94°C變性lmin, 52°C 55s退火，72°C延伸50s，35個循環后，72°C延伸10分鐘。3、PCR擴增產物純化使用檢測試劑盒中的PCR產物純化組件，反應體系為總體積25ul，包含PCR產物 20ul，lU/ul SAP 酶 O. 75ul，10U/ul ExoI 酶 0. 375ul，去離子水 3. 875ul。在 ABI2720 型 PCR 擴增儀上進行反應，反應條件為37°C、15min, 72°C、20min。4、DNA測序反應使用檢測試劑盒中的測序反應組件，其中，含有下列DNA測序引物(I)XPC PAT(+/-)測序引物5' TAGCACCCAGCAGTCAAAG3'(2)MTHFR(C677T)測序引物5' AGGGAGGCTTCAACTACGC3'(3)GSTTl (Null/Present)測序引物5' TTCCTTACTGGTCCTCACATCTC3'(4)CYP2E1 (RsaI) (Ile462Val)測序引物5' AAGTGATTTGGCTGGATTGTA3'反應的體系為總體積5ul，包含PCR純化產物lul，25%Bigdye mix lul，3. 2uMDNA 測序引物Iul，去離子水2ul。在ABI2720型PCR擴增儀上進行反應，反應條件為98 °C 2min,進行25個循環的 960C 30s, 550C 30s, 60°C 4min。反應結束后加入125mM EDTA溶液Iul和100 %乙醇溶液15ul，于室溫下沉淀 15min ;在4°C, 3600rpm/min的轉速離心30min,輕輕倒去上清液；加入70%乙醇溶液30ul, 3600rpm/min離心15min,輕輕倒去上清液；室溫放置20min后加入HIDI溶液8ul,放入測
序儀中。5、基因型分析熟悉DNA測序技術的本領域技術人員能夠通過辨識DNA測序圖譜確定所檢測的 SNP位點的基因型。實施例2.篩查胰腺癌風險人群的基因無創檢測服務I.無創采樣由醫院檢驗科醫師指導受檢者使用口腔采樣拭進行口腔粘膜上皮細胞取樣，樣本用細胞保存液常溫保存。2. DNA 抽提采用酚氯仿法對采集到的口腔粘膜細胞進行DNA抽提。3.基因型檢測使用本發明提供的試劑盒，對受檢者全基因組DNA的XPC基因上PAT，MTHFR 基因上 C677T(rsl801133)， GSTTl 基因是否缺失(Null/Present)， CYP2E1 基因上 RsaI (rs2031920)的4個單核苷酸多態性位點分別進行DNA測序，確定這4個SNPs位點的基因型。4.胰腺癌發病高危人群生物信息學分析及風險評估通過對受檢者SNPs基因型的生物信息學分析和風險評估模型鑒定，出具胰腺癌易感基因風險評估分析報告單。報告中詳細說明了受檢者XPC基因上PAT，MTHFR基因上 C677T(rsl801133) ,GSTTl 基因是否缺失(Null/Present)，CYP2E1 基因上 RsaI (rs2031920) 的4個SNP位點基因檢測信息，胰腺癌風險評估結果和防治方案。根據受檢者的風險評估等級，由醫師向受檢者詳細說明并解讀胰腺癌易感基因無創檢測報告單。
權利要求
1.一種檢測胰腺癌易感基因的無創檢測試劑盒，其組成成分為XPC基因上單核苷酸多態性位點PAT (未缺失/雜合缺失/純和缺失)，MTHFR基因上單核苷酸多態性位點 C677T(rsl801133) ,CYP2E1基上單核苷酸多態性位點RsaI (rs2031920)，GSTTl基因是否缺失(Null/Present)基因型的PCR特異引物與DNA測序引物、Taq酶、dNTP混合液、反應緩沖液、SAP酶、ExoI酶、BigDye mix、EDTA溶液、70%乙醇溶液、100%乙醇溶液、HIDI溶液、 ddH20 等。
2.根據權利要求I所述的試劑盒，其特點在于所述的特異性引物對是指針對XPC基因上單核苷酸多態性位點PAT (正常/雜合缺失/純和缺失)，MTHFR基因上單核苷酸多態性位點C677T(rsl801133)，CYP2E1基上單核苷酸多態性位點RsaI (rs2031920)，GSTTl基因是否缺失(Null/Present)，能特異性擴增出包含4個SNPs位點的DNA片段的引物對。
3.根據權利要求I所述的試劑盒，其特點在于所述的DNA測序引物是針對XPC基因上單核苷酸多態性位點PAT (正常/雜合缺失/純和缺失)，MTHFR基因上單核苷酸多態性位點C677T(rsl801133)，GYP2E1基上單核苷酸多態性位點RsaI (rs2031920)，GSTTl基因是否缺失(Null/Present)，能通過DNA測序技術特異性檢測出上述4個SNPs位點基因型的DNA 測序引物。
4.根據權利要求I所示的試劑盒,其所含的4對特異性引物序列如下(I)XPC PAT (+/-)正向引物5' -TAGCACCCAGCAGTCAAAG-3'5' -TGTGAATGTGCTTAATGCTG-3'5' -AGGGAGGCTTCAACTACGC-3'5' -GCGGTTGAGGGTGTAGAAGT-3'5' -AAGTGATTTGGCTGGATTGTA-3'5' -ATACAGACCCTCTTCCACCTT-3'(4)GSTTl (Null/Present)正向引物5' TTCCTTACTGGTCCTCACATCTC3'GSITl (Null/Present)反向引物5' TCACCGGATCATGGCCAGCA3'。
5.根據權利要求I所述的試劑盒，其特征在于，所含的4條DNA測序引物序列如下(1)XPCPAT (+/-)測序引物5' -TAGCACCCAGCAGTCAAAG-3'(2)MTHFR(C677T)測序引物5'-AGGGAGGCTTCAACTACGC-3'(3)CYP2E1(RsaI)測序引物5' -AAGTGATTTGGCTGGATTGTA-3'(4)GSITl(Null/Present)測序引物5' TTCCTTACTGGTCCTCACATCTC3'。
6.根據權利要求I所述的試劑盒，其特征在于試劑盒的組分和含量包括(1)卩0 反應體系10\ 0 反應緩沖液2.5111，251111dNTP 混合液0. 2ul，5U/ul Taq DNA 聚合酶0. 125ul，20uM特異性引物對，每條引物各、0. 25ul，ddH20 19. 175ul。(2)卩0 產物純化體系川/111SAP 酶 0. 75ul，10U/ul ExoI 酶 0. 375ul，ddH20 3.875ul。(3)測序反應體系25%BigDye mixlul，3. 2uM DNA測序引物 lul，125mMEDTA溶液 lul， 100% 乙醇溶液 15ul，70% 乙醇溶液 30ul，HIDI 溶液 8ul，ddH202ul。本試劑盒供一人份檢測應用，試劑盒的保存溫度為_20°C。XPC PAT(+/-)反向引物(2)MTHFR(C677T)正向引物 MTHFR(C677T)反向引物(3)CYP2E1(RsaI)正向引物 CYP2E1 (RsaI)反向引物
全文摘要
本項發明提供了一種檢測胰腺癌易感基因的無創檢測試劑盒。該試劑盒包括檢測XPC基因上單核苷酸多態性位點PAT(正常/雜合缺失/純和缺失)，MTHFR基因上單核苷酸多態性位點C677T(rs1801133)，CYP2E1基上單核苷酸多態性位點RsaI(rs2031920)，GSTT1基因是否缺失(Null/Present)，這四個基因基因型的特異性引物與DNA測序引物、PCR反應體系、PCR產物純化體系、DNA測序反應體系等。本項發明的試劑盒通過檢測與胰腺癌發生密切相關的4個單核苷酸多態性位點的基因型來評估人群中胰腺癌的患病風險級別與程度，并根據受檢者基因檢測結果從基因維度指導中國人群進行針對性的預防胰腺癌的發生，從而降低胰腺癌的發病概率。本發明所使用樣本為口腔粘膜細胞，采集方法無痛、無創、可避免交叉感染。基因測序過程采用ABI 3730型測序儀，方法簡便，結果準確，可靠，適宜推廣。
文檔編號C12Q1/68GK102586447SQ20121005367
公開日2012年7月18日 申請日期2012年3月1日 優先權日2012年3月1日
發明者潘加奎, 鄭俊斌 申請人:解碼(上海)生物醫藥科技有限公司