專利名稱：一步酶消化法分離提取成年大鼠心肌細胞的方法
技術領域：
本發明涉及細胞的分離和提取技術領域，特別是涉及一種采用一步酶消化法分離提取成年大鼠心肌細胞的方法。
背景技術：
隨著心臟疾病研究的不斷發展，心臟離體實驗已越來越被人們所重視，尤其是具備正常生理功能的單個心肌細胞已成為研究心臟代謝、功能、病理生理機制的重要基礎。目前心肌細胞的提取與培養多采取乳鼠或幼鼠為主，但乳鼠心肌細胞與成熟心肌細胞在功能及結構上都存在不同程度的差異。成年大鼠心肌細胞的分離與培養方法也有多種，灌注酶解法用于成年大鼠的心肌分離已有40余年的歷史,但至今仍無統一的方法可循。自Powell等于1976年首先成功分 離出單個鈣耐受成熟心室肌細胞以來，迄今為止國內也僅有少數單位初步建立了可用于原代培養的心肌細胞分離方法。究其原因，是因為心肌細胞分離的每一步都會對最終分離的細胞狀態產生重要的影響。實驗室溫度、Langendorff裝置設定溫度、心臟摘取速度、水質、溶液的PH值、酶的種類、活力及濃度、細胞內外鈣濃度變化、操作者的熟練程度等都會影響心肌細胞狀態。目前可見的成年大鼠心肌細胞分離與培養方法的報道中，均是采用兩種酶混合消化，或者反復的復鈣及沉降，這樣增加了操作難度和步驟，容易污染，細胞成活率不高。

發明內容
本發明所要解決的技術問題是克服現有分離提取方法不穩定、成活率低、操作步驟復雜的缺陷，提供一種一步酶消化法分離提取成年大鼠心肌細胞的方法。為了解決上述技術問題，本發明采用如下的技術方案
本發明一步酶消化法分離提取成年大鼠心肌細胞的方法包括如下步驟
(1)裝置預處理設置Langendorff灌注裝置恒溫于37°C，消毒，超純水灌流，預充灌注母液；
(2)灌流將成年大鼠離體心臟掛于LangendorfT灌注裝置上，經主動脈逆行灌流，設置灌注流量為6-10ml/min，用含鈣液灌流l_2min，然后用無鈣EGTA液灌流4_5min，再用II型膠原酶液單向灌流I. 5-2. 5min，之后循環灌流IO-ISmin ;灌流含鈣液有助于使離體心臟恢復跳動從而排除心腔及心臟冠狀動脈系統內的殘留血液；灌流無鈣EGTA液使心肌細胞處于低鈣狀態，心臟完全停跳，消減心肌細胞間Ca2+依賴的緊密連接，有助于細胞外基質的解離疏散；灌流II型膠原酶液用于消化心臟；
(3)消化剪下心室肌組織，棄去心房和大血管，收集II型膠原酶循環液，加入10%BSA溶液至BSA終濃度為8-12mg/ml，取5-10ml，將心室置于其中，37°C、130-160次/min恒溫搖床震蕩消化5-8min，用吸管吹打循環液至消化完全得消化液，從灌注II型膠原酶液開始，每4分鐘加入O. lmol/L的CaCl2溶液45-55 μ 1，共4次；將心室肌組織用含有1%BSA的II型膠原酶液在恒溫振蕩器中振蕩消化可使心室解離，從而得到游離的桿狀細胞；
(4)沉降用160目濾網過濾消化液，濾液自然沉降15-20min，收集細胞沉淀，懸浮在30ml酶洗脫液中，再自然沉降15-20min，如此重復洗滌2_3次，所得自然沉降物即為心肌細胞；
(5)前述步驟中所用的試劑為
灌注母液NaCl 130 mMol/L、KCl 5.4 mMol/L、HEPES 5 mMol/L,D-Glucose 10 mMol/UMgCl2 · 6H20 3. 5 mMol/UNaH2PO4 0. 4 mMol/L，用 O2 和 CO2 體積比為 95:5 的混合氣飽和15min, NaOH 調節 pH 至 7. 20 7. 35 ；
10%BSA制備100mg/mlBSA溶解在含80 mMol/L Ca2+的灌注母液中，在4°C條件下攪拌混勻，放入含80 mMol/L Ca2+的灌注母液中4°C透析lh，換新鮮含80 mMol/L Ca2+的灌注母液，在4°C下靜置過夜，然后分裝，儲存在-20°C備用；· 含鈣液在灌注母液中加入CaCl2,使Ca2+終濃度為500-750 mMol/L ；
無鈣EGTA液在灌注母液加入EGTA，使EGTA終濃度為100 mMol/L ；
II型膠原酶液取灌注母液加入II型膠原酶和CaCl2,使II型膠原酶和Ca2+濃度分別為0. 02-0. 06% (質量)和 60-90 mMol/L ；
酶洗脫液灌注母液中加入10%BSA和CaCl2,使BSA和Ca2+終濃度分別為lmg/mL和80-100 mMol/L。優選的，上述方法中灌流步驟為將成年大鼠離體心臟掛于Langendorff灌注裝置上，經主動脈逆行灌流，設置灌注流量為6ml/min，用含鈣液灌流l_2min，然后用無鈣EGTA液灌流4-5min,再用II型膠原酶液單向灌流2min,之后循環灌流10_18min。消化步驟為剪下心室肌組織，棄去心房和大血管，收集II型膠原酶循環液，加入10% BSA溶液至BSA終濃度為10mg/ml，取5-10ml，將心室置于其中，37°C、130-160次/min恒溫搖床震蕩消化5min，用吸管吹打循環液至消化完全得消化液，從灌注II型膠原酶液開始，每4分鐘加入0. lmol/L的CaCl2溶液50 μ 1，共4次。沉降步驟為用160目濾網過濾消化液，濾液自然沉降15_20min，收集細胞沉淀，懸浮在30ml酶洗脫液中，再自然沉降15-20min，如此重復洗滌2_3次，所得自然沉降物即為心肌細胞；
前述方法中，在裝置預處理步驟，所述消毒室用75%乙醇灌流10分鐘消毒。優選的，在消化時，先將心室由心尖至心底剪開，再放入含有BSA的II型膠原酶循環液中。上述技術方案中，在消化酶的選擇上，本發明只采用單一消化酶分離心肌細胞，消化酶的濃度和消化終止時間很重要，II型膠原酶使用濃度為0. 02-0. 06%時即可在8-15分鐘內對大鼠心臟充分消化。消化酶的濃度過高及消化時間過長都可造成細胞膜不可修復的損害。有報道認為當心臟顏色變黃，表現較松弛時終止酶消化較合適。但申請人卻發現II型膠原酶灌流持續8-18min時，心臟腫漲，晶瑩剔透(但并非表面發白，如出現發白則心肌已消化過度)，心室變得松軟即可停止灌流，且滴下的灌流液顯微鏡下可見單個心肌細胞，此時終止消化較合適。心肌細胞體積較大，經過酶液灌流消化后細胞膜損傷已較嚴重，故本發明不對心室肌進行剪碎處理，而是通過加有1%BSA的II型膠原酶液在恒溫振蕩器中反復振蕩使心室肌自然解離，收集細胞懸液獲取心肌細胞。最大程度減少對心肌細胞的物理傷害。另外，國內文獻報道梯度復鈣多用四步法，且多使用單獨配制的復鈣液，本發明采用逐步增加鈣濃度，逐步梯度復鈣。這樣既簡化了實驗步驟，又有效的減少了心肌細胞內鈣離子濃度迅速提高引起心肌細胞內鈣失衡的概率，從而大大提高心肌細胞的存活率。同時經過酶洗脫液的反復潤洗和自然沉降，有利于心肌細胞的純化。與現有技術相比，本發明采用Langendoff灌流裝置經主動脈逆行灌流分離成年大鼠心肌細胞是一種較好的方法，該方法獲得的大鼠心肌細胞中75-93%都具有活性，每只 大鼠心臟的活細胞產量最高可達約(5-8) X IO8個，本發明采用單一消化酶分離心肌細胞并用逐步梯度復鈣法沉降，既簡化了實驗步驟，又大大提高了心肌細胞的存活率，簡單經濟，是分離成年大鼠心肌細胞行之有效的方法。
具體實施例方式I、實驗動物清潔級成年SD大鼠(由第三軍醫大學實驗動物中心提供)，雌雄不拘，體重200 350g。2、主要試劑乙二醇雙(2-氨基乙醚)四乙酸(EGTA)、肉毒堿、肌酸、牛磺酸、牛血清白蛋白(BSA)、HEPES、層粘連蛋白均購自美國SIgma公司，II型膠原酶、M199培養基購自美國Gibco公司，兔抗大鼠心肌肌動蛋白抗體、二抗、DAB試劑盒(武漢博士德公司)。其余試劑為國產分析純試劑。3、主要儀器=Langendorff灌流裝置(ALC-HP)購自上海奧爾科特生物科技有限公司。恒溫振蕩器，二氧化碳孵箱。4、溶液配制
灌注母液NaCl 130 mMol/L,KCl 5.4 mMol/L,HEPES 5 mMol/L,D-Glucose 10 mMol/UMgCl2 · 6H20 3. 5 mMol/L、NaH2PO4 0. 4 mMol/L，用 O2 和 CO2 體積比為 95:5 的混合氣飽和15min, NaOH 調節 pH 至 7. 25 7. 35 ；
10%BSA制備100mg/mlBSA溶解在含80 mMol/L Ca2+的灌注母液中，在4°C條件下攪拌混勻，放入含80 mMol/L Ca2+的灌注母液中4°C透析lh，換新鮮含80 mMol/L Ca2+的灌注母液，在4°C下靜置過夜，然后分裝，儲存在-20°C備用；
含鈣液在灌注母液中加入CaCl2,使Ca2+終濃度為500-750 mMol/L ；
無鈣EGTA液在灌注母液加入EGTA，使EGTA終濃度為100 mMol/L ；
II型膠原酶液取灌注母液加入II型膠原酶和CaCl2,使II型膠原酶和Ca2+濃度分別為
0.02-0. 06% (質量)和 60-90 mMol/L ；
酶洗脫液灌注母液中加入10%BSA和CaCl2,使BSA和Ca2+終濃度分別為lmg/mL和80-100 mMol/L。改良M199培養基M199 分別加入 2mMol/L Glutamin、50U/ml 青霉素、50g/ml 鏈霉素、5mMol/L 肌酸、2mMol/L 肉毒喊、5mMol/L 氛基乙橫、0. 8mMol/L EGTA。以上所有液體均用0. 22nm濾膜過濾除菌。5、成年大鼠心肌細胞的分離
(I)裝置預處理設置Langendorff灌注裝置恒溫于37°C，用75%乙醇灌流10分鐘消毒，并用大量無菌超純水灌洗灌流系統后，預充無鈣臺式液。
(2)心臟摘取SD大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉(40mg/kg)和肝素Iml (1000u/ml)，麻醉顯效后，仰臥位固定大鼠于蛙板，75%酒精消毒胸腹部皮膚，“u”形剪開皮膚及胸壁暴露縱隔，剪除胸腺，在無名動脈稍遠處快速離斷主動脈，移除心臟，置于4°C含鈣KH液，輕輕擠壓2-3次，排除心內積血。( 3 )灌流首先用含鈣液灌流，可見心臟恢復跳動，從而排清心房、心室及血管內殘留血液，l-2min后流出液變清亮；然后用無鈣EGTA液灌流4_5min，心臟完全停止跳動；再用II型膠原酶液灌流，先單向灌流2min (即棄掉開始l_2min內的液體)，再改為循環灌流10-18min，至心臟腫漲、晶瑩剔透(不是發白)、心室變得松軟；
(4)消化剪下心室肌組織，棄去心房和大血管，將心室由心尖至心底剪開，收集II型膠原酶循環液，加入10% BSA溶液至BSA終濃度為10mg/ml，取5-10ml，將心室放于其中，37°C、130-160次/min恒溫搖床震蕩消化5min，用吸管吹打循環液至肉眼觀察消化完全得消化液，從灌注II型膠原酶液開始，每4分鐘加入O. lmol/L的CaCl2溶液50 μ 1，共4次。
(5)沉降用160目金屬濾網過濾消化液，濾液自然沉降15_20min，收集細胞沉淀，懸浮在30ml酶洗脫液中，再自然沉降15-20min，如此重復洗滌2_3次，所得自然沉降物即為心肌細胞；
6、成年大鼠心肌細胞的培養
將分離得到的心肌細胞用改良M199培養液30ml潤洗，自然沉降15_20min，棄上清，經此步驟后所得沉淀為更純的鈣耐受心肌細胞。在用層粘連蛋白處理過的六孔板中加入心肌細胞和改良M199液使心肌細胞個數稀釋為5X 104/cm2，在37. 5% CO2的培養箱中培養3h，使之貼壁，小心換液，去除未貼壁細胞，重新加入改良M199培養基培養過夜，即可用于實驗或進行長時間的心肌細胞培養。(注以上自然沉降均在給氧及37°C水浴箱中進行)。7、心肌細胞的觀察和評價
將細胞沉淀滴片，在倒置相差顯微鏡下行細胞計數，按鏡下細胞密度=細胞數/毫升原液=(4大格細胞數之和/4) X IO4 X稀釋倍數；用0. 4%臺盼藍進行細胞染色，計算臺盼藍染色呈陰性的桿狀活細胞占總桿狀細胞敷的百分比例，用％表示。以評價心肌細胞存活率。如計數500個細胞數中陰性桿狀細胞占的比例。本方法可獲得75-93%具有活性的成年大鼠心室肌細胞(表I)。新分離的存活單個成年大鼠心室肌細胞呈桿狀或矩形，橫紋清晰，菱角分明，長約70-170μπι，寬約20-40μπι。其中約10%左右的心肌細胞發生自發性收縮，其余細胞呈靜息狀態，靜息狀態的細胞為鈣耐受細胞。少數細胞皺縮成圓形或橢圓形，為死細胞。活性細胞的細胞膜完整，所以臺盼藍不能進入細胞內而拒染。死亡或損傷嚴重的心肌細胞呈團塊狀，由于細胞膜缺乏完整性，被臺盼藍染成藍色。經過60只成年SD大鼠的心肌分離結果顯示，平均每個心臟的存活心肌細胞產量為(5-8) X IO8個，無血清改良Μ199培養基培養可生長5_7天以上。表I心肌細胞存活率
權利要求
1.一種一步酶消化法分離提取成年大鼠心肌細胞的方法，其特征在于包括如下步驟 (1)裝置預處理設置Langendorff灌注裝置恒溫于37°C，消毒，超純水灌流，預充灌注母液； (2)灌流將成年大鼠離體心臟掛于LangendorfT灌注裝置上，經主動脈逆行灌流，設置灌注流量為6-10ml/min，用含鈣液灌流l_2min，然后用無鈣EGTA液灌流4_5min，再用II型膠原酶液單向灌流I. 5-2. 5min,之后循環灌流10_18min ； (3)消化剪下心室肌組織，棄去心房和大血管，收集II型膠原酶循環液，加入10%BSA溶液至BSA終濃度為8-12mg/ml，取5-lOml，將心室置于其中，37°C、130-160次/min恒溫搖床震蕩消化5-8min，用吸管吹打循環液至消化完全得消化液，從灌注II型膠原酶液開始，每4分鐘加入O. lmol/L的CaCl2溶液45-55 μ 1，共4次; (4)沉降用160目濾網過濾消化液，濾液自然沉降15-20min，收集細胞沉淀，懸浮在30ml酶洗脫液中，再自然沉降15-20min，如此重復洗滌2_3次，所得自然沉降物即為心肌細胞； (5)前述步驟中所用的試劑為 灌注母液NaCl 130 mMol/L、KCl 5.4 mMol/L、HEPES 5 mMol/L,D-Glucose 10 mMol/UMgCl2 · 6H20 3. 5 mMol/UNaH2PO4 0. 4 mMol/L，用 O2 和 CO2 體積比為 95:5 的混合氣飽和15min, NaOH 調節 pH 至 7. 20 7. 35 ； 10%BSA制備100mg/mlBSA溶解在含80 mMol/L Ca2+的灌注母液中，在4°C條件下攪拌混勻，放入含80 mMol/L Ca2+的灌注母液中4°C透析lh，換新鮮含80 mMol/L Ca2+的灌注母液，在4°C下靜置過夜，然后分裝，儲存在-20°C備用； 含鈣液在灌注母液中加入CaCl2,使Ca2+終濃度為500-750 mMol/L ； 無鈣EGTA液在灌注母液加入EGTA，使EGTA終濃度為100 mMol/L ； II型膠原酶液取灌注母液加入II型膠原酶和CaCl2,使II型膠原酶和Ca2+濃度分別為0. 02-0. 06% (質量)和 60-90 mMol/L ； 酶洗脫液灌注母液中加入10%BSA和CaCl2,使BSA和Ca2+終濃度分別為lmg/mL和80-100 mMol/Lo
2.按照權利要求I所述一步酶消化法分離提取成年大鼠心肌細胞的方法，其特征在于灌流步驟為 將成年大鼠離體心臟掛于LangendorfT灌注裝置上，經主動脈逆行灌流，設置灌注流量為6ml/min，用含鈣液灌流l_2min，然后用無鈣EGTA液灌流4_5min，再用II型膠原酶液單向灌流2min,之后循環灌流10_18min。
3.按照權利要求I所述一步酶消化法分離提取成年大鼠心肌細胞的方法，其特征在于消化步驟為 剪下心室肌組織，棄去心房和大血管，收集II型膠原酶循環液，加入10% BSA溶液至BSA終濃度為10mg/ml，取5_10ml，將心室置于其中，37°C、130-160次/min恒溫搖床震蕩消化5min，用吸管吹打循環液至消化完全得消化液，從灌注II型膠原酶液開始，每4分鐘加入0. lmol/L 的 CaCl2 溶液 50 μ 1，共 4 次。
4.按照權利要求I所述一步酶消化法分離提取成年大鼠心肌細胞的方法，其特征在于沉降步驟為 用160目濾網過濾消化液，濾液自然沉降15-20min，收集細胞沉淀，懸浮在30ml酶洗脫液中，再自然沉降15_20min，如此重復洗滌2-3次，所得自然沉降物即為心肌細胞。
5.按照權利要求I所述一步酶消化法分離提取成年大鼠心肌細胞的方法，其特征在于在裝置預處理步驟，所述消毒室用75%乙醇灌流10分鐘消毒。
6.按照權利要求I或3所述一步酶消化法分離提取成年大鼠心肌細胞的方法，其特征在于在消化步驟，先將心室由心尖至心底剪開，再放入含有BSA的II型膠原酶循環液中。
全文摘要
本發明公開了一種一步酶消化法分離提取成年大鼠心肌細胞的方法，采用Langendorff灌注裝置經主動脈逆行灌流，依次用含鈣液、無鈣EGTA液、Ⅱ型膠原酶液灌流，收集Ⅱ型膠原酶循環液加入10%BSA溶液，將心室置于其中恒溫搖床震蕩消化，用吸管吹打循環液至消化完全得消化液，過濾，濾液自然沉降，收集細胞沉淀，懸浮在酶洗脫液中重復沉降即得心肌細胞，該方法獲得的大鼠心肌細胞中75-93%都具有活性，每只大鼠心臟的活細胞產量最高可達約(5-8)×108個，本發明采用單一消化酶分離心肌細胞并用逐步梯度復鈣法沉降，既簡化了實驗步驟，又大大提高了心肌細胞的存活率，簡單經濟，是分離成年大鼠心肌細胞行之有效的方法。
文檔編號C12N5/071GK102911909SQ20121005430
公開日2013年2月6日 申請日期2012年3月5日 優先權日2012年3月5日
發明者梁貴友, 王峰, 湯全, 肖志超, 蔡慶勇 申請人:遵義醫學院附屬醫院