專利名稱：一種乳酸片球菌ccfm7902及其用途的制作方法
一種乳酸片球菌CCFM7902及其用途
技術領域：
本發明屬于微生物技術領域。更具體地，本發明涉及一種能抑制單核細胞增生李斯特菌生長的乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)CCFM7902，還涉及所述乳酸片球菌 CCFM7902的用途。
背景技術：
單核細胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)在分類上屬李斯特菌屬，該屬有8個菌種，普遍認為僅有單核細胞增生李斯特菌能引起食物中毒。該菌為革蘭氏陽性小桿菌，需氧或兼性厭氧，生長溫度3-45°C，具有嗜冷性，能在低至4°C的溫度下生存和繁殖。 李斯特菌在自然界中廣泛存在，土壤、水、食品都是其生境，孕婦、新生兒、老年人和免疫缺陷個體均屬是易感人群。食源性單核細胞增生李斯特菌可引起腦膜炎、敗血癥和流產，發病率雖不高，但死亡率有時可達20% -50%。食品中存在的李斯特菌對人類的安全具有較大威脅，也是冷藏食品威脅人類健康的主要病原菌之一。益生菌是一種通過改善平衡宿主的腸道內菌群，拮抗腸道內病原菌，從而對宿主起到有益作用的活性微生物。拮抗作用具有菌株特異性，并非所有的益生菌都對同一種病原菌起作用。益生菌中有很多屬于乳酸菌，乳酸菌代謝可以產生有機酸、雙乙酰、過氧化氫和細菌素等多種代謝產物，可以抑制食品中的腐敗菌和病原菌。劉潔等(上海交通大學學報(農業科學版)，M(3) =221-225,2006)研究發現，保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌在體外對單核細胞增生李斯特菌生長具有明顯的抑制作用，其發酵液對單核細胞增生李斯特菌的抑制作用受PH影響顯著；周偉、李平蘭等(食品科學，27 (2) :121-125,2006)研究了植物乳桿菌素L-I對單核細胞增生李斯特菌的抑制作用，并探討了溫度、pH及鹽對抑制效果的影響。單核細胞增生李斯特菌對細胞的粘附是其侵染的前提，乳酸菌可以通過占位作用排除致病菌，或者它分泌代謝產物以抑制致病菌。除此之外，乳酸菌還能夠增強機體免疫反應， 從而達到清除致病菌的作用。Sinea 等人(FEMS immunology and medical microbiology> 50 (380-388)，2006)應用細胞模型發現，其所用的乳酸桿菌是通過代謝產物而非粘附作用對單核細胞增生李斯特菌產生抑制拮抗作用并刺激細胞的自身免疫。由此可見，乳酸菌及其代謝產物可能對單核細胞增生李斯特菌的污染具有一定的預防或干預作用，有作為抗生素的輔助治療劑的潛能，篩選具有優良拮抗特性的乳酸菌對于抑制單增李斯特菌的污染很有必要。本發明經過體外篩選、細胞模型和應用研究發現，從泡菜中分離出的一株乳酸片球菌CCFM7902對單核細胞增生李斯特菌具有明顯的抑制作用。目前公開的關于乳酸片球菌及其抑菌物質的文獻很有限，其中關于乳酸片球菌素的報道較多，如CNlO 1050437和CN102115720A分別公開了生產片球菌素的方法； CN102127578A公開了一種積累片球菌素的方法，可以增加片球菌素的生產量。也有少數專利是關于乳酸片球菌作為發酵劑的作用，如CN101289647公開的一株片球菌能夠在發酵香腸中作為發酵劑的應用，改善發酵香腸的風味。本發明在體外拮抗的基礎上，通過細胞模型發現乳酸片球菌對單核細胞增生李斯特菌感染腸上皮細胞株HT-四細胞具有保護作用，動物模型中乳酸片球菌對單核細胞增生李斯特菌感染小鼠的肝脾具有保護作用。此乳酸片球菌具有潛在的應用價值。可應用于食品體系中，為控制單核增生李斯特菌提供了一種基于生物拮抗的控制方法，對于減少動物疾病發生，提高相關產品的安全性具有重要意義。因此，本發明人在總結現有技術的基礎上，通過大量試驗研究，終于完成了本發明。

發明內容[要解決的技術問題]本發明的目的是提供一種具有抑制單核細胞增生李斯特菌生長的乳酸片球菌 (Pediococcus acidilactici)CCFM7902。本發明的另一個目的是提供所述乳酸片球菌CCFM7902的用途。[技術方案]本發明是通過下述技術方案實現的。本發明涉及一種乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici) CCFM7902，該菌菌株已于2011年11月四日在北京市朝陽區北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，其保藏號為CGMCC No. M93。本發明的乳酸片球菌CCFM7902具有下述性質(1)具有耐酸性，在pH3. 0下能存活；(2)具有耐膽鹽能力，能耐受的膽鹽濃度達0. 3% ；(3)在體外對單核細胞增生李斯特菌生長具有抑制作用；(4)對單核細胞增生李斯特菌在食品中的生長具有抑制作用；(5)對單核細胞增生李斯特菌感染腸上皮細胞株HT-四細胞具有保護作用；(6)對單核細胞增生李斯特菌感染小鼠的肝脾具有保護作用。本發明還涉及所述的乳酸片球菌CCFM7902在使用含有該菌株的工作發酵劑生產青貯飼料與發酵香腸中的用途。在所述的工作發酵劑中乳酸片球菌CCFM7902的濃度是109cfu/g以上。根據本發明，所述的工作發酵劑是按照下述方法制備得到的按照以MRS液體培養基重量計1 2%接種量，將乳酸片球菌CCFM7902原始菌種接種于MRS液體培養基中，在溫度37°C的條件下培養20-2 進行活化，連續以相同方式進行活化2-3代，得到活化培養物，然后按照以MRS液體培養基重量計1-3%接種量再接種于 MRS培養基中，在溫度37°C的條件下培養20-2 ,接著在溫度2_6°C與轉速3500_4500r/ min的條件下進行離心12-18min，去除上清夜，收集菌泥，然后，往所述的菌泥中加入凍干保護劑懸液，調整菌液濃度為109CfU/ml，混勻后裝入凍干瓶中，在溫度_80°C的條件下預凍 2-他，然后轉入真空冷凍干燥機進行凍干，于是得到所述的工作發酵劑，它在溫度4°C下保存。根據本發明，所述的凍干保護劑懸液是按照下述方法制備得到的將脫脂乳、海藻糖與去離子水按照重量比為1 1 8進行混合溶解，得到的溶液在溫度115°C的條件下滅菌lOmin，得到所述的凍干保護劑懸液，它在溫度4°C下保存。在本發明中，所述的青貯飼料是按照下述步驟制備的
首先，將青貯飼料原料揉切至1 4cm后待用；然后，將0. 5重量份采用上述方法制備的工作發酵劑溶入到200-250重量份溫度 300C -40°C的水中，攪拌溶解得到一種工作發酵劑懸液；接著，把該工作發酵劑懸液噴灑到2000重量份的青貯飼料原料中，翻拌均勻，將青貯飼料原料的水含量控制在以重量計65%-75%;當飼料原料的水含量超過其范圍時，讓飼料原料在日光下晾曬，使其含水量達到其范圍；當飼料原料的水含量低于其范圍時，往其飼料原料中噴灑水，使其含水量達到其范圍；最后，把如此處理的青貯飼料原料裝入青貯飼料桶中壓實，然后密封，在常溫下發酵3-4周后，得到含有乳酸片球菌CCFM7902的植物秸稈飼料。在本發明中，所述的青貯飼料原料是一種或多種選自稻草、玉米秸稈、高粱秸稈、 小麥秸稈、天然牧草、栽培牧草、田間雜草、菜葉類、水生植物或嫩枝樹葉的青貯飼料。在本發明中，所述的發酵香腸是按照下述步驟制備的首先，將選自豬肉、牛肉、羊肉或雞肉的肉切碎，在溫度_6°C _8°C的冷藏室中進行預凍Mh ；然后，讓預凍肉與食鹽、白砂糖、亞硝酸鈉、復合磷酸鹽按照重量比 100 3 1.5 0.015 0.3充分混合得到一種混合物，所述的復合磷酸鹽是由多聚磷酸鈉、焦磷酸鈉和磷酸氫二鈉按照重量比2 1 1復配而成的，接著，將所述的混合物置于溫度0 4°C下腌制Mh，加入按照肉重量計5-10%香辛料，攪拌混合，然后加入采用所述方法制備的工作發酵劑，其加入量是以肉重量計0. 5 1 %，接著把含有工作發酵劑的肉灌注到腸衣中，得到一種灌腸；最后，所述的灌腸在溫度14°C 18°C與相對濕度85%的條件下發酵20天；發酵結束后在溫度66-70°C下進行烘烤，冷卻后得到所述的發酵香腸。在本發明中，所述的香辛料是一種或多種選自辣椒、花椒、胡椒、姜、蒜、八角、茴香、桂皮、橘皮或丁香的香辛料。下面將更詳細地描述本發明。本發明涉及一種乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici) CCFM7902，該菌菌株已于2011年11月四日在北京市朝陽區北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，其保藏號為CGMCC No. M93。所述的乳酸片球菌CCFM7902是采用下述篩選方法獲得的，并且對其性質進行了研究。一、篩選篩選方法的具體實施步驟如下1、樣品采集用無菌三角瓶采集自然發酵的發酵泡菜，原始樣品取自無錫板橋村等地農民自制的發酵泡菜。采集的樣品保存在溫度0°c的條件下，在48h內進行樣品分析和乳酸菌的分
1 O2、從樣品中分離乳酸菌IOg自然發酵泡菜樣品置于帶玻璃珠的90ml 0. 無菌蛋白胨水中，振蕩30min， 然后使用0.1%無菌蛋白胨水按照體積比1 10進行連續稀釋。使用本技術領域的技術人員熟知的涂布平板法，將各個稀釋梯度的菌液0. Iml分別涂布在以下三種培養基平板上添加溴甲酚紫指示劑的MRS培養基(青島海博生物技術有限公司產品，用于乳桿菌培養的培養基)，TPY固體培養基(青島海博生物技術有限公司銷售產品，用于雙歧桿菌增菌培養)，M17瓊脂培養基(BD Difco公司以商品名BactO M17 Agar銷售的培養基)，并分別在厭氧與溫度37°C的培養條件下培養48h。從長有30-300個菌落的平板上分離單個菌落， 用接種環隨機挑取其中的5-10個菌落在普通肉湯培養基(青島海博生物技術有限公司銷售產品)中在厭氧與溫度37°C的培養條件下進行培養Mh，然后在瓊脂板上劃線。分離物連續劃線三次得到純的單菌落，然后進行本技術領域的技術人員熟知的革蘭氏染色與接觸酶試驗。方法為用接種環在平板上刮一環新鮮培養的菌苔，均勻涂抹在載玻片上，向上滴加一滴3% H2O2溶液，觀察是否有氣泡產生。若無氣泡產生則表明該菌株不產過氧化氫酶， 為接觸酶實驗陰性菌。將純化后的菌株接入MRS液體培養基中，在厭氧與溫度37°C的培養條件下進行培養Mh，然后按照以培養基重量計2-4%接種量接種于MRS液體培養基中，在厭氧與溫度37°C的培養條件下進行發酵培養18-24h進行活化，連續傳代3次，得到活性良好的乳酸菌。其純化菌株可在MRS斜面上在溫度4°C下短期保存，而長期保存需要在30% 滅菌甘油溶液中在溫度_80°C的條件下凍存。利用加溴甲酚紫的MRS瓊脂培養基、TPY培養基和M17瓊脂培養基上共分離出244 個分離株。經過菌落形態、革蘭氏染色、接觸酶試驗排除了 3個革蘭氏陰性，2個接觸酶陽性和4個酵母。這樣，分離得到了 235株乳酸菌。3、篩選體外具有拮抗單核細胞增生李斯特菌的乳酸菌將上述分離乳酸菌株按照以培養基重量計2-4%接種量接種于MRS液體培養基中，在厭氧與溫度37°C的培養條件下進行發酵培養1814h，得到乳酸菌發酵液。然后，將滅菌的單核細胞增生李斯特菌選擇性培養基(青島海博生物技術有限公司銷售，用于單核細胞增生李斯特菌生長的選擇性培養)傾注到平板中(每平板15mL，平板為90mm標準平板)，單核細胞增生李斯特菌(L. monocytogenes) ATCC19114作為指示菌株 (菌株購買自美國典型培養物保藏中心ATCC)，每板放入4個牛津杯(直徑IOmm)，牛津杯內加入上述乳酸菌發酵液200 μ L，置于溫度4°C下擴散6h，然后放入培養箱內在溫度37°C下培養Mh，接著測量抑菌圈大小。以MRS液體培養基作為陰性對照，乳酸片球菌PAl (菌株來源江南大學食品生物技術中心)作為陽性對照，試驗重復3次。篩選出具有比陽性對照更大抑菌圈的乳酸菌CCFM7902。這些試驗結果列于表1。表1CCFM7902對單核細胞增生李斯特菌的抑制作用菌林抑菌圏(mm)
CCFM790225.18±0.25
PAl23.32±0.13
空白MRS液體培養基0由表1列出的結果可以看出，乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)CCFM7902 是對單核細胞增生李斯特菌生長具有明顯抑制作用的乳酸菌。4、CCFM7902 菌株的 16s rDNA 序列鑒定將乳酸片球菌CCFM7902按照以培養基重量計2-4%接種量接種于MRS液體培養基中，在溫度37°C下培養18-24h，取ImL新鮮菌液用細菌基因組DNA提取試劑盒(上海生物工程技術服務有限公司銷售，商品名為EZ-IO Spin Column Genomic DNA Isolation Kit) 對基因組進行提取。然后以基因組DNA作為模板，采用文獻(Critical Evaluation of Two Primers Commonly Used for Amplification of Bacterial 16S rRNA Genes. Applied and Environmental Microbiology, 2008, 74 (8) :2461-2470)公布的細菌鑒定通用引物 27F 和 1492R為引物，50 μ L反應體系進行PCR擴增。目的基因PCR擴增產物測序工作由上海生物工程技術服務有限公司完成。將乳酸片球菌CCFM7902的16S rDNA測序結果與NCBI核酸數據庫進行比對，最終結果表明本發明的 CCFM7902 與Pediococcus acidilactici7_4 contl. 26 及Pediococcus acidilactici DSM 20284contig00019同源性均高達99%，因此，將本發明的CCFM7902菌株鑒定為乳酸片球菌，命名為Pediococcus acidilactici CCFM7902，于2011年11月四日在北京市朝陽區北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，其保藏號為CGMCC No. M93。二、乳酸片球菌CCFM7902的微生物學性質1、乳酸片球菌CCFM7902耐酸性能的測定配制人工胃液取0. IN鹽酸16. 4ml加水搖勻，然后稀釋至1000ml，再用濃鹽酸或 10% NaOH將其PH調至3.0，再在溫度121°C下滅菌30min，然后按照lg/100ml比例加入商品胃蛋白酶制劑(上海雅培生物技術有限公司)，混勻得到所述的人工胃液。乳酸片球菌CCFM7902耐酸性能測定將保存的乳酸片球菌CCFM7902按照以MRS 培養基重量計2-4%接種量接種于MRS培養基中，在溫度37°C下培養Mh，以相同方式使用 MRS培養液傳代培養2 3次，然后取活化菌懸液40ml加入到50ml離心管中，在6000r/min 條件下離心5min，收集其菌體，然后用PBS緩沖液(pH = 7. 2)洗滌2次，接著向離心管中加入40ml上述制備的人工胃液，在溫度37°C的水浴中處理3h，每隔30min搖勻1次，分別在處理0h、l. 5h,3h后采用標準平板菌落計數法進行活菌計數。乳酸片球菌CCFM7902耐酸特性測定結果列于表2。2、乳酸片球菌CCFM7902耐膽鹽性能的的測定配制人工腸液取KH2PO4 6. 8g加蒸餾水500ml溶解，用以重量計0. 4% NaOH溶液將其PH調節至6. 8，然后加水至IOOOml，按照每IOOml溶液中加0. 3g豬膽鹽(常規商業產品)的比例添加豬膽鹽，充分溶解后于溫度115°C下滅菌15min，得到所述的人工腸液。采用與前面所述的同樣方法收集菌體。收集的菌體用PBS緩沖液(pH = 7. 2)洗滌2次，接著向離心管中加入40ml上述制備的人工腸液，在溫度37°C的水浴中處理3h，每隔30min搖勻一次，分別在處理0h、l. 5h,3h后采用標準平板菌落計數法進行活菌計數。乳酸片球菌CCFM7902耐膽鹽性能的測定結果列于表3。按照與乳酸片球菌CCFM7902耐酸、耐膽鹽性能測定方法相同的方式使用戊糖片球菌CCFM0956進行了對照試驗，其試驗結果也列于表2和表3。表2 乳酸片球菌CCFM7902的耐酸特性測定結果
權利要求
1.一種乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici) CCFM7902，該菌菌株已于 2011 年 11 月四日在北京市朝陽區北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，其保藏號為CGMCC No. M93。
2.根據權利要求1所述的乳酸片球菌CCFM7902，其特征在于它具有下述性質(1)具有耐酸性，在PH3.O下能存活；(2)具有耐膽鹽能力，能耐受的膽鹽濃度達0.3%；(3)在體外對單核細胞增生李斯特菌生長具有抑制作用；(4)對單核細胞增生李斯特菌在食品中的生長具有抑制作用；(5)對單核細胞增生李斯特菌感染腸上皮細胞株HT-四細胞具有保護作用；(6)對單核細胞增生李斯特菌感染小鼠的肝脾具有保護作用。
3.根據權利要求1所述的乳酸片球菌CCFM7902在使用含有該菌株的工作發酵劑生產青貯飼料與發酵香腸中的用途。
4.根據權利要求3所述的用途，其特征在于在所述工作發酵劑中乳酸片球菌CCFM7902 的濃度是109cfu/g以上。
5.根據權利要求3或4所述的用途，其特征在于所述的工作發酵劑是按照下述方法制備得到的按照以MRS液體培養基重量計1 2%接種量，將乳酸片球菌CCFM7902原始菌種接種于MRS液體培養基中，在溫度37°C的條件下培養20-2 進行活化，連續以相同方式進行活化2-3代，得到活化培養物，然后按照以MRS液體培養基重量計1-3%接種量再接種于MRS 培養基中，在溫度37°C的條件下培養20-2 ,接著在溫度2-6°C與轉速3500-4500r/min的條件下進行離心12-18min，去除上清夜，收集菌泥，然后，往所述的菌泥中加入凍干保護劑懸液，調整菌液濃度為109CfU/ml，混勻后裝入凍干瓶中，在溫度-80°C的條件下預凍2-他， 然后轉入真空冷凍干燥機進行凍干，于是得到所述的工作發酵劑，它在溫度4°C下保存。
6.根據權利要求5所述的用途，其特征在于所述的凍干保護劑懸液是按照下述方法制備得到的將脫脂乳、海藻糖與去離子水按照重量比為1 1 8進行混合溶解，得到的溶液在溫度115°C的條件下滅菌lOmin，得到所述的凍干保護劑懸液，它在溫度4°C下保存。
7.根據權利要求3所述的用途，其特征在于所述的青貯飼料是按照下述步驟制備的首先，將青貯飼料原料揉切至1 4cm后待用。然后，將0. 5重量份根據權利要求5所述方法制備的工作發酵劑溶入到200-250重量份溫度30°C -40°C的水中，攪拌溶解得到一種工作發酵劑懸液；接著，把該工作發酵劑懸液噴灑到2000重量份的青貯飼料原料中，翻拌均勻，將青貯飼料原料的水含量控制在以重量計65%-75%;當飼料原料的水含量超過其范圍時，讓飼料原料在日光下晾曬，使其含水量達到其范圍；當飼料原料的水含量低于其范圍時，往其飼料原料中噴灑水，使其含水量達到其范圍；最后，把如此處理的青貯飼料原料裝入青貯飼料桶中壓實，然后密封，在常溫下發酵 3-4周后，得到含有乳酸片球菌CCFM7902的青貯飼料。
8.根據權利要求3或7所述的用途，其特征在于所述的飼料原料是一種或多種選自稻草、玉米秸稈、高粱秸稈、小麥秸稈、天然牧草、栽培牧草、田間雜草、菜葉類、水生植物或嫩枝樹葉的青貯飼料。
9.根據權利要求3所述的用途，其特征在于所述的發酵香腸是按照下述步驟制備的 首先，將選自豬肉、牛肉、羊肉或雞肉的肉切碎，在溫度_6°C -8°C的冷藏室中進行預凍 24h ；然后，讓預凍肉與食鹽、白砂糖、亞硝酸鈉、復合磷酸鹽按照重量比 100 3 1. 5 0.015 0.3充分混合得到一種混合物，所述的復合磷酸鹽是由多聚磷酸鈉、焦磷酸鈉和磷酸氫二鈉按照重量比2 1 1復配而成的，接著，將所述的混合物置于溫度0 4°C下腌制Mh，加入按照肉重量計5-10 %香辛料， 攪拌混合，然后加入根據權利要求5所述方法制備的工作發酵劑，其加入量是以肉重量計 0. 5 1%，接著把含有工作發酵劑的肉灌注到腸衣中，得到一種灌腸；最后，所述的灌腸在溫度14°C 18°C與相對濕度85%的條件下發酵20天；發酵結束后在溫度66-70°C進行烘烤，冷卻后得到所述的發酵香腸。
10.根據權利要求9所述的用途，其特征在于所述的香辛料是一種或多種選自辣椒、花椒、胡椒、姜、蒜、八角、茴香、桂皮、橘皮或丁香的香辛料。
全文摘要
本發明涉及一種具有抑制單核細胞增生李斯特菌生長的乳酸片球菌CCFM7902及其用途。它具有耐酸性、耐膽鹽能力、在體外對單核細胞增生李斯特菌生長具有強烈抑制作用、在食品體系中對單核細胞增生李斯特菌的生長具有抑制作用、對單核細胞增生李斯特菌感染腸上皮細胞株HT-29細胞具有保護作用、對單核細胞增生李斯特菌感染小鼠肝脾具有保護作用。所述乳酸片球菌CCFM7902可以用于制備生產青貯飼料、發酵香腸等食品。
文檔編號A23L1/314GK102559563SQ20121005465
公開日2012年7月11日 申請日期2012年3月5日 優先權日2012年3月5日
發明者劉小鳴, 寧佳, 宋元達, 張灝, 張秋香, 王剛, 田豐偉, 趙建新, 陳衛, 陳海琴 申請人:江南大學