基因重組TNF-α衍生物RMP16及其制備方法與應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開一種基因重組TNF-α衍生物RMP16及其制備方法與應用。通過基因重組得到的RMP16，與天然TNF-α相比，在血液中具有更高的穩定性和生理活性，可顯著抑制前列腺癌Du145、淋巴瘤Raji、白血病K562、宮頸癌HeLa、乳腺癌MCF-7等腫瘤細胞的生長，對DU145的抑制效果尤為突出，且可抑制顯著Du145細胞移植瘤的生長，其藥效學作用與雌莫司汀相似，Du145細胞移植瘤裸鼠，結果顯示，重組多肽RMP16的毒副作用明顯小于雌莫司汀，無明顯的毒副作用表現。該基因重組TNF-α衍生物RMP16可應用于制備具有如下功能的藥物：治療前列腺癌、淋巴瘤、慢性髓原白血病、宮頸癌、乳腺癌等腫瘤。
【專利說明】基因重組TNF-α衍生物RMP16及其制備方法與應用

【技術領域】
[0001]本發明屬于基因工程【技術領域】，特別涉及一種基因重組TNF- α衍生物RMP16及其制備方法與應用。

【背景技術】
[0002]TNF-α是較早發現的、研究最為深入的腫瘤壞死因子家族成員之一，抗腫瘤作用強，參與多種生理病理過程的調節。人TNF-α為單拷貝基因，定位在第六號染色體上(6Ρ12-13)，與MHC基因群緊密連鎖；TNF- α的CDNA大小約2.76kb，由4個外顯子和3個內含子組成。人TNF-α前體由233個氨基酸殘基組成，包括由第1、2號外顯子編碼的76個氨基酸殘基的信號肽；切除信號肽后形成非糖基化的成熟的人TNF-α，為157個氨基酸殘基，相對分子量為17kDa.。其中第69位和101位為兩個半胱氨酸，可形成分子內二硫鍵，對維持其空間結構有重要意義。
[0003]TNF-α作為一種蛋白類因子，其生物學活性主要是通過和細胞膜上特異受體結合實現的。TNF-α有兩種受體，一種是存在于大部分細胞表面的分子量為55_60kDa.的腫瘤壞死因子受體I (tumor necrosis factor receptor I , TNFR I ),另一種是主要存在于造血細胞表面的分子量為75_80kDa.的腫瘤壞死因子受體II (tumor necrosis factorreceptor II, TNFR II)。兩類TNFR均為跨膜糖蛋白，氨基酸序列分析顯示這兩種受體的胞外結構域的序列高度相似，都有保守的富含半胱氨酸的同源氨基酸序列；但是胞內結構域卻差異很大，TNFR I胞內段含有死亡結構域(death domain，DD)，而TNFR II沒有DD。TNFR I在大多數種類細胞的表面都表達，且大部分生物學功能是由TNFR I介導，包括殺細胞、抗病毒、誘導ICAM-1及IL-6的表達、促進成纖維細胞增殖、激活NF-K B等。TNFRII主要傳遞胸腺細胞和NK細胞等淋巴細胞的增殖信號，通過促進TNF-α與TNFR I結合而增加TNFR I誘導的作用。根據細胞及其微環境的不同，激活TNFR I后可通過激活不同的信號途徑介導細胞增殖、凋亡、壞死性凋亡等程序。
[0004]TNF- α具有很好抗腫瘤作用，被認為是最具潛質的癌癥治療藥物。但TNF- α在體內易被腎快速排泄和被各種蛋白酶分解，很不穩定，半衰期較短(15-30min)。若希望達到療效，則必須頻繁注射大劑量TNF-α，進而導致嚴重的不良反應，甚至引起休克死亡。TNF-a的上述缺陷，嚴重限制了其實際臨床應用，
[0005]研究表明，小分子多肽具有分子量小、活性高、副作用小、無免疫原性、結構簡單、易于穿透腫瘤細胞等特點，已成為腫瘤藥物研發的新熱點。這些都預示著小分子TNF-α衍生物在臨床方面將有良好的應用前景。設計高穩定性、高生物活性的TNF-α衍生物，特別是能與血漿中的載體蛋白結合的小分子TNF-α衍生物，可提高其生物利用度，發揮天然TNF-α抗腫瘤的同時，也極大降低了天然TNF-α具有的副作用。具有重要的藥用價值和產業化前景。


【發明內容】

[0006]為了克服現有技術的缺點與不足，本發明的首要目的在于提供一種基因重組TNF-α衍生物RMP16。該衍生物RMP16具有更高穩定性和更高生物活性。
[0007]本發明的另一目的在于提供所述基因重組TNF-α衍生物RMP16的制備方法。該制備方法根據TNF-α衍生物RMP16的氨基酸序列及大腸桿菌密碼子的偏好性，設計RMP16在原核表達系統的基因序列，采用基因工程技術，結合蛋白內含肽(intein)的可誘導剪切功能實現目的多肽RMP16的高效制備；該制備方法生產效率高，生產成本低。
[0008]本發明的再一目的在于提供所述基因重組TNF- α衍生物RMP16的應用。
[0009]本發明的目的通過下述技術方案實現:一種基因重組TNF-α衍生物RMP16，其氨基酸序列如下所示:MWQRPSSWIEGRLLTHTISRIAVSYQTKVNLL。
[0010]編碼所述的基因重組TNF- α衍生物RMP16的核苷酸序列為:
[0011 ] ATGTGGCAGCGCCCGAGCAGCTGGATTGAAGGTCGCCTGCTGACCCATACCATTAGCCGCATTGCGGTGAGCTATCAGACCAAAGTGAATCTGCTG ；
[0012]所述的基因重組TNF- α衍生物RMP16的制備方法，包括以下步驟:
[0013](I)設計并合成RMP16基因:
[0014]采用3條引物兩步法合成RMP16基因:
[0015]引物Fl:
[0016]5’-GGTGGTCATATGTGGCAGCGCCCGAGCAGCTGGATTGAAGGTCGCCTG-3’ ；
[0017]引物F2:
[0018]5’-GCTCACCGCAATGCGGCTAATGGTATGGGTCAGCAGGCGACCTTC-3’ ；
[0019]引物F3:
[0020]5’-CCACCATGCTCTTCCGCACAGCAGATTCACTTTGGTCTGATAGCTCACCGCAAT-3’ ；
[0021 ]其中，CATATG 為 Nde I 酶切位點，GCTCTTCCGCA 為 Sap I 酶切位點；GGTGGT 和CCACCAT為保護堿基；
[0022]首先將引物Fl和引物F2進行鏈延伸反應，然后以其產物為DNA模板，以Fl和F3為引物，PCR反應制得RMP16基因；
[0023](2)構建重組載體 pTXBl-RMP16:
[0024]用Ndel酶和Sapl酶分別對質粒pTXBl和步驟⑴制得的RMP16基因進行雙酶切，再將雙酶切后的RMP16基因和雙酶切后的質粒pTXBl連接，得到重組載體pTXBl_RMP16 ；
[0025](3)制備表達工程菌 pTXBl-RMP16/ER2566:
[0026]用重組載體pTXBl-RMP16轉化表達宿主菌大腸桿菌E.coli Strain ER2566，得到表達工程菌 pTXBl-RMP16/ER2566 ；
[0027](4)表達和純化:
[0028]①誘導表達工程菌PTXB1-RMP16L/ER2566表達由目的多肽、蛋白內含肽和幾丁質結合域(Chitin binding domain, CBD)組成的“三元”融合蛋白；
[0029]②得到的“三元”融合蛋白用幾丁質柱進行純化，“三元”融合蛋白吸附于幾丁質柱中，然后含有巰基乙醇的溶液過柱并充滿幾丁質柱環境中，反應；巰基乙醇的作用是誘導蛋白內含肽的N端切割，釋放目的多肽；然后用洗脫幾丁質柱的溶液洗柱，收集洗脫液；
[0030]③利用高效液相色譜技術純化目的多肽，得到基因重組TNF- α衍生物RMP16。
[0031]步驟(1)中所述的鏈延伸反應的條件優選為:94°C，1min ;60°C，5min ;72.C，1min ；
[0032]步驟(1)中所述的PCR反應的條件優選為:94°C，5min ;94°C、30s，60°C、30s，72。。、30s，31 次循環；72°C延伸 1min ；
[0033]步驟⑷②中所述的含有β_巰基乙醇的溶液的組成如下:20mM Tris-HCI,0.5MNaCl，ImM EDTA，50mM β -巰基乙醇，pH 8.0 ；
[0034]步驟(4)②中所述的反應的條件優選為23V反應24小時；
[0035]步驟(4)②中所述的洗脫幾丁質柱的溶液的組成優選如下:20mM Tris-HCl, 500mMNaCI，ImM EDTA, pH 8.0 ；
[0036]步驟(4)③中所述的利用高效液相色譜技術純化目的多肽RMP16的步驟如下:
[0037]A、流動相A為在體積百分比5%乙腈(CNCH3,溶質為純水)中添加三氟乙酸(TFA)得到，TFA的終濃度為體積百分比0.1% ;流動相B為100%乙腈(CNCH3)中添加三氟乙酸(TFA)，TFA的終濃度為體積百分比0.1% ;流速lmL/min，30min線性梯度洗脫；
[0038]B、線性梯度洗脫中流動相B由O~58% (v/v)，收集目的多肽洗脫峰，光吸收檢測波長為218nm ;并進行質譜鑒定。
[0039]所述的基因重組TNF-α衍生物RMP16應用于制備治療如下疾病的藥物:前列腺癌、淋巴瘤、慢性髓原白血病、宮頸癌、乳腺癌等腫瘤。
[0040]所述的基因重組TNF-α衍生物RMP16應用于制備治療TNFR I型受體相關疾病的藥物，有如下作用:誘導腫瘤細胞凋亡、阻滯腫瘤細胞周期和抑制腫瘤血管生成等作用。
[0041]本發明相對于現有技術具有如下的優點及效果:
[0042](I)本發明所制備的基因重組多肽RMP16，是TNF- α衍生物，與天然TNF- α相比，它具有天然TNF-α的活性中心序列(75~94位氨基酸)，因此具有相似的受體激動性，SP高生物活性；同時，重組多肽RMP16克服了天然TNF-α易被各種蛋白酶分解和代謝的缺陷，穩定性高，可結合血漿載體蛋白，體內半衰期長。
[0043]( 2)基因重組多肽RMP16克服了天然TNF-α由于特定的蛋白結構而存在的副作用，且具有天然TNF- a通過激活受體TNFRI而產生的抗腫瘤作用。
[0044]這些區別使得重組多肽RMP16在生理環境中具有更高的穩定性和對TNFRI受體的激活活性，與TNFRI受體結合后，激活TNF-a信號傳導通路，發揮誘導腫瘤細胞凋亡、阻滯腫瘤細胞周期和抑制腫瘤血管生成等作用。
[0045](3)本發明所制備的高穩定性基因重組TNF- a衍生物RMP16在治療前列腺癌、乳腺癌、宮頸癌、慢性髓原白血病、食管癌等腫瘤中有顯著的療效。
[0046](4)本發明的所述重組多肽RMP16的制備方法效率高、成本低，應用前景廣闊。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0047]圖1是RMP16基因合成及重組表達質粒pTXBl_RMP16構建示意圖；圖中:MCS—多克隆位點；CBD—幾丁質結合結構域；intein—內含肽。
[0048]圖2是SDS-PAGE檢測融合蛋白Intein_CBD-RMP16表達的鑒定圖；其中，泳道I是IPTG誘導前菌體破碎上清液；泳道2是IPTG誘導后菌體破碎上清液。
[0049]圖3是制備的重組多肽RMP16的飛行質譜鑒定圖。
[0050]圖4為制備的重組多肽RMP16對多種腫瘤細胞的生長抑制作用的檢測結果圖。
[0051]圖5為重組多肽RMP16對Dul45移植瘤生長的抑制作用的檢測結果圖。
[0052]圖6為重組多肽RMP16對治療裸鼠的肝臟(圖6A)、腎臟(圖6B)的毒副作用檢測的病理切片圖。

【具體實施方式】
[0053]下面結合實施例及附圖對本發明作進一步詳細的描述，但本發明的實施方式不限于此。
[0054]實施例1
[0055]表達工程菌pTXBl-RMP16/ER2566的構建和表達
[0056]具體步驟如下:
[0057](1)RMP16編碼序列的獲得:
[0058]按照大腸桿菌的密碼偏好性設計編碼RMP16的cDNA，設計3條引物，采用兩步法獲得該序列(如圖1所示):
[0059]引物Fl:
[0060]5’-GGTGGTCATATGTGGCAGCGCCCGAGCAGCTGGATTGAAGGTCGCCTG-3’ ；
[0061]引物F2:
[0062]5’-GCTCACCGCAATGCGGCTAATGGTATGGGTCAGCAGGCGACCTTC-3’ ；
[0063]引物F3:
[0064]5’-CCACCATGCTCTTCCGCACAGCAGATTCACTTTGGTCTGATAGCTCACCGCAAT-3’ ；
[0065]其中，CATATG為 Nde I 酶切位點，GCTCTTCCGCA 為 Sap I 酶切位點；GGTGGT 和CCACCAT為保護堿基。
[0066]①鏈延伸反應:
[0067]反應體系為:引物Fl (250 μ M/L) 2 μ L，引物 F2 (250 μ M/L) 2 μ L, 1XTaKaRaBuffer (含有 4mmol/L MgCl2) 2 μ L，dNTP 2 μ L, H2O 11.5 μ L，TaKaRa Taq 酶 0.5 μ L ;
[0068]反應條件為:94°C,1min ;降至 60°C,5min ；72°C, 1min ；
[0069]得到延伸反應液。
[0070]②PCR 反應:
[0071]反應體系為:以延伸反應液為DNA模板，引物Fl (25 μ M/L) 2 μ L，F3 (25 μ M/L) 2 μ L，延伸反應液 1.5 μ L，dNTP 2 μ L，10XTaKaRa Ex Buffer 2 μ L, TaKaRa Taq 酶
0.5 μ L, H2O 10 μ L ；
[0072]反應條件為:94°C,5min;94 °C、30s，60 °C、30s，72 °C、30s，31 次循環；72°C 延伸1min ；
[0073]得到PCR產物。
[0074](2)構建重組載體pTXBl-RMP16，如圖1所示:
[0075]用NdeI和SapI進行酶切步驟⑴得到的PCR產物，利用PCR產物純化試劑盒進行純化(根據說明書進行操作)。
[0076]用Nde I 和 BspQ I [Sap I 的同功酶，New England B1labs (NEB)公司】對上一步得到的PCR純化產物進行酶切。先進行Nde I單酶切，酶切反應體系:DNA (PCR純化產物)2 μ g，1XNEB Buffer 5 μ L, Nde I 酶(20000U/mL) I μ L，補足超純水至 50 μ L，37°C 酶切 1.5h;Nde I 單酶切完成后，加入 BspQ I 酶(10000U/mL) I μ L，50°C 酶切 1.5h。
[0077]質粒pTXBl(New England B1labs (NEB)公司)也用 Nde I 和 BspQ I (Sap I 的同功酶)進行酶切，酶切條件同上。
[0078]將雙酶切后的RMP16基因和雙酶切后的質粒pTXBl連接，連接體系和連接時間、大腸桿菌DH5CI (購自大連寶生物公司)感受態細胞的制作、轉化以及篩選(卡那霉素)，根據《分子克隆》進行操作。將RMP16基因克隆到質粒pTXBl的NdeI和SapI位點間，得到重組載體 PTXB1-RMP16。
[0079](3)表達和純化:
[0080]①將重組質粒pTXBl_RMP16轉化表達宿主菌E.coli Strain ER2566 (New EnglandB1labs (NEB)公司)，得到表達工程菌pTXBl_RMP16/ER2566 ;挑取單克隆于5mL含50 μ g/mL卡那霉素的Luria-Bertani (broth)培養基(簡稱LB培養基)，搖菌培養過夜,再擴大，以體積比為I: 100的比例接于IL含50mg/L卡那霉素的LB培養基，37°C搖菌至OD600為0.8，加入異丙基-β -D-硫代半乳糖苷(IPTG))至終濃度0.8mmol/L，37°C誘導表達6h。6000rpm離心 20min 收集菌體,將菌體重懸于60mL Buffer A溶液(20mM Tris-HCl, 500mM NaCI, ImMEDTA，pH 8.0)中，然后用低溫超高壓連續流細胞破碎儀進行破碎，破碎條件為=Buffer A溶液稀釋菌體的濃度為18% (m/v)，破碎壓力為1700bar，制冷溫度為4°C。
[0081 ] 破碎產物在4 °C，20000rpm離心30min，收集上清，該上清稱為破碎上清液。SDS-PAGE檢測融合蛋白Intein-CBD-RMP16的表達，鑒定結果如圖2所示。
[0082]實施例2
[0083]重組TNF- α衍生物RMP16的純化、制備和鑒定
[0084]取20mL幾丁質珠(NEB公司產品#S6651L)裝填1.5 X 20cm層析柱，以10倍柱體積的Buffer A溶液洗柱；實施例1中的破碎上清液以0.5mL/min的流速上注；用10倍柱體積的Buffer A溶液以2mL/min過柱，以洗去雜蛋白或未親和結合的融合蛋白，用60mLBuffer B 溶液(20mM Tris-HCl, 0.5M NaCl, ImM EDTA，50mMβ -巰基乙醇，pH 8.0)自然過柱，使β_巰基乙醇均勻分布并浸泡柱內填料，然后封閉進、出口端，上述反應體系在23°C反應24h，以誘導蛋白內含肽的N端切割，釋放目的多肽RMP16。用Buffer A溶液洗脫并用潔凈的燒杯收集目的多肽溶液，再經高效液相色譜(HPLC)純化、制備得到純度為質量百分比96%以上的重組多肽RMP16，目的多肽的制備條件為:流動相A(5% CNCH3:95% H2O,
0.1 % TFA)，流動相B (100% CNCH3,0.1 % TFA)，流速I mL/min，線性梯度洗脫，收集目的多肽洗脫峰，檢測波長218nm。目的多肽RMP16的純度通過分析性HPLC測定(條件同目的多肽的制備條件)。制備的目的多肽RMP16利用質譜技術鑒定(結果如圖3所示)，質譜檢測分子量為3.786kDa.，與其理論值相符合。
[0085]實施例3
[0086]制備的重組多肽RMP16對多種腫瘤細胞的生長的抑制作用
[0087]前列腺癌Dul45、淋巴瘤Raj1、白血病K562細胞株(均購自美國菌種保藏中心(ATCC))培養于RPM1-1640+10% FBS培養液(美國Gibco公司產品)中。宮頸癌HeLajL腺癌MCF-7細胞株(均購自美國菌種保藏中心(ATCC))培養于DMEM+10% FBS培養液(美國Gibco公司產品)中。所有細胞株均培養在37°C、飽和濕度及體積分數為5%的CO2培養箱中，每隔2~3天換液或傳代一次，取對數生長期細胞，以6X 13個/孔接種于96孔板，每孔100 μ L，置CO2培養箱培養24h貼壁后，用一定濃度的藥物進行處理48h，每濃度設6復孔，設置實驗組、對照組及空白組，倒置顯微鏡下觀察細胞生長情況并拍照記錄。處理結束采用CCK-8法進行細胞活力檢測，每孔加入10 μ L CCK-8溶液(Yeasen公司)，在培養箱內孵育I~2h (控制對照組細胞的OD值約1.0左右)，酶標儀測定吸光度OD值(波長450nm，參考波長630nm)。
[0088]按下列公式計算藥物對細胞的生長抑制率:生長抑制率IR(% ) = [1-(實驗組OD值一空白組OD值)/ (對照組OD值一空白組OD值)]X 100%。計算各濃度的抑制率。
[0089]實驗結果如圖4所示，選取的5株腫瘤細胞株為研究對象，RMP16分別在20μΜ、10μΜ、5μΜ、2.5μΜ、1.25μΜ、0.625 μ M的終濃度下作用48h，檢測其細胞生長抑制作用。經CCK-8檢測，RMP16對5株人腫瘤細胞的生長均有明顯的抑制作用，RMP16具有廣譜的抗腫瘤活性，對前列腺癌細胞DU145的抑制效果尤為突出，對應的IC50為17.20± 1.95μ M。對人Burkitt's淋巴瘤Raji細胞的IC50為228.31 ±35.35 μ M ;對人慢性髓原白血病Κ-562細胞的IC50為150.34±33.54 μ M ;對人宮頸癌HeLa細胞的IC50為44.63 ±2.85 μ M ;對人乳腺癌 MCF-7 細胞的 IC50 為 54.29 ±13.70 μ M0
[0090]實施例4
[0091]重組多肽RMP16對Dul45移植瘤生長的抑制作用
[0092]BALB/c-nu/nu裸鼠【購自廣東省醫學實驗動物中心，實驗動物質量合格證號0110231，許可證號:SCXK(粵)2008-0002】，30只，雄性，4周齡，體重17~19g，由暨南大學實驗動物管理中心提供SPF級【Specific Pathogen free，許可證號:SYXK (粵)2012-0117】條件飼養，恒定溫度(22~24°C )，恒定濕度(50%~70% )，無特定病原體，12h黑白交替，每籠6只；飼養籠、墊料、飼料和水均經高壓蒸汽滅菌。隔離一周后，動物生長狀況良好，進食進水正常，無異常病態表現。
[0093]取對數生長期的人前列腺癌Dul45細胞，用無血清的RPM1-1640培養基(美國Gibco公司產品)重懸細胞，制備成細胞濃度為1.5X 17個/mL的單細胞懸液。用酒精棉球消毒實驗組裸鼠右側背部皮膚，用ImL注射器于皮下接種Dul45細胞懸液0.2mL (約3 X 16個細胞)/只，余下6只未接種腫瘤細胞，作為空白對照組。接種一周后，裸鼠右側背部均明顯見到瘤體，直徑約3mm大小，成瘤率100%。造模成功后，隨機分為4組，每組6只，尾靜脈注射給藥，每天一次，總共給藥4周，即:陰性對照組:尾靜脈注射0.9% NaCl 0.1mL ；RMP16組:尾靜脈注射40 μ M RMP160.1mL0
[0094]用藥4周后,處死,剖出腫瘤塊,稱量瘤重,計算抑瘤率(inhibit1n rate, IR):抑瘤率(IR) = (I 一治療組平均瘤重/對照組平均瘤重)X 100%。
[0095]實驗結果如圖5所示，RMP16組對移植瘤的平均抑瘤率為76.11% (瘤重與0.9%NaCl組比較，P〈0.01)，表明RMP16對人前列腺癌Dul45裸鼠移植瘤具有生長抑制作用。
[0096]實施例5
[0097]重組多肽RMP16對治療裸鼠的肝臟、腎臟的毒副作用檢測
[0098]Dul45移植瘤裸鼠分別經重組多肽RMP16、0.9% NaCl> Estramustine (雌莫司汀，臨床用于治療前列腺癌的藥物，Phamacia公司)治療4周后的裸鼠，處死后迅速摘取肝臟和腎臟，以正常裸鼠作為空白對照。摘取的肝臟和腎臟用10%中性Formal in (福爾馬林)固定，經乙醇脫水和石蠟包埋后，進行HE染色，染色步驟如下:
[0099]①烘片:60°C烘烤30min ；
[0100]②脫臘:二甲苯I lOmin—二甲苯II lOmin—無水乙醇I 5min—無水乙醇II 5min — 95 % 乙醇 I 5min — 95 % 乙醇 II 5min — 80 % 乙醇 5min —自來水洗 Imin ；
[0101 ] ③染色:蘇木素染1min —自來水洗Imin — I %鹽酸酒精20s —自來水洗Imin —伊紅染1min —自來水洗Imin ；
[0102]④透明:80 %乙醇2min — 95 %乙醇II 2min — 95 %乙醇I 2min—無水乙醇II 2min —無水乙醇 I 2min — 二甲苯 II 5min — 二甲苯 I 1min ；
[0103]⑤固封:中性樹膠封片，37 °C烘烤48h。
[0104]實驗結果如圖6A所示，正常肝細胞以中央靜脈為中心，單行排列成板狀結構，肝細胞體積大、胞質豐富，肝細胞條索之間為肝血竇。RMP16組與正常組比較，未出現壞死、炎癥等異常。而陽性對照Estramustine (雌莫司汀，臨床用于治療前列腺癌的藥物，Phamacia公司)組，門管區有較多的炎細胞浸潤。
[0105]實驗結果如圖6B所示，正常腎皮質主要包括腎小球及其周圍腎小管，腎小球主要由毛細血管組成，球囊腔清晰可見。與正常組相比，RMP16組腎組織未出現炎癥、壞死等現象；而陽性對照Estra mustine組，腎小管腔內管型均質紅染，出現透明管型，可能有一定腎毒。
[0106]實驗結果表明，重組多肽RMP16的毒副作用明顯小于臨床用藥Estramustine。
[0107]上述實施例為本發明較佳的實施方式，但本發明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發明的保護范圍之內。
【權利要求】
1.一種基因重組TNF-α衍生物RMP16，其特征在于:其氨基酸序列如SEQ ID N0.1所/Jn ο
2.根據權利要求1所述的基因重組TNF-α衍生物RMP16，其特征在于:編碼所述的基因重組TNF-α衍生物RMP16的核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示。
3.權利要求1或2所述的基因重組TNF-α衍生物RMP16的制備方法，其特征在于:包括以下步驟: (1)設計并合成RMP16基因: 采用3條引物兩步法合成RMP16基因: 引物Fl:
5’-GGTGGTCATATGTGGCAGCGCCCGAGCAGCTGGATTGAAGGTCGCCTG-3’ ； 引物F2:
5’-GCTCACCGCAATGCGGCTAATGGTATGGGTCAGCAGGCGACCTTC-3’ ； 引物F3:
5’-CCACCATGCTCTTCCGCACAGCAGATTCACTTTGGTCTGATAGCTCACCGCAAT-3’ ；
其中，CATATG 為 Nde I 酶切位點，GCTCTTCCGCA 為 Sap I 酶切位點；GGTGGT 和 CCACCAT為保護堿基； 首先將引物Fl和引物F2進行鏈延伸反應，然后以其產物為DNA模板，以Fl和F3為引物，PCR反應制得RMP16基因； (2)構建重組載體pTXB1-RMP16: 用Ndel酶和Sapl酶分別對質粒pTXBl和步驟(1)制得的RMP16基因進行雙酶切，再將雙酶切后的RMP16基因和雙酶切后的質粒pTXBl連接，得到重組載體pTXBl_RMP16 ； (3)制備表達工程菌pTXBl-RMP16/ER2566: 用重組載體PTXB1-RMP16轉化表達宿主菌大腸桿菌E.coli Strain ER2566，得到表達工程菌 PTXB1-RMP16/ER2566 ； (4)表達和純化: ①誘導表達工程菌PTXB1-RMP16L/ER2566表達由目的多肽、蛋白內含肽和幾丁質結合域組成的“三元”融合蛋白； ②得到的“三元”融合蛋白用幾丁質柱進行純化，“三元”融合蛋白吸附于幾丁質柱中，然后含有β-巰基乙醇的溶液過柱并充滿幾丁質柱環境中，反應；β-巰基乙醇的作用是誘導蛋白內含肽的N端切割，釋放目的多肽；然后用洗脫幾丁質柱的溶液洗柱，收集洗脫液； ③利用高效液相色譜技術純化目的多肽，得到基因重組TNF-α衍生物RMP16。
4.根據權利要求3所述的制備方法，其特征在于:步驟(1)中所述的鏈延伸反應的條件為-MV，1min ；60°C，5min ；72°C，1min0
5.根據權利要求3所述的制備方法，其特征在于:步驟⑴中所述的PCR反應的條件為:94°C,5min ；94°C>30s,60°C >30s, 72°C>30s, 31 次循環；72°C延伸 1min0
6.根據權利要求3所述的制備方法，其特征在于:步驟(4)②中所述的反應的條件為23°C反應24小時。
7.根據權利要求3所述的制備方法，其特征在于:步驟(4)②中所述的含有β-巰基乙醇的溶液的組成如下:20mM Tris-HCI，0.5M NaCl，ImM EDTA,50mM^ -巰基乙醇，pH 8.0 ；步驟(4)②中所述的洗脫幾丁質柱的溶液的組成如下:20mM Tris-HCl, 500mM NaCI，ImM EDTA，pH 8.0。
8.根據權利要求3所述的制備方法，其特征在于:步驟(4)③中所述的利用高效液相色譜技術純化目的多肽RMP16的步驟如下: A、流動相A為在體積百分比5%乙腈中添加三氟乙酸得到，TFA的終濃度為體積百分比0.1% ;流動相B為100%乙腈中添加三氟乙酸，TFA的終濃度為體積百分比0.1% ;流速lmL/min, 30min線性梯度洗脫； B、線性梯度洗脫中流動相B由體積百分比O~58%，收集目的多肽洗脫峰，光吸收檢測波長為218nm ;并進行質譜鑒定。
9.權利要求1或2所述的基因重組TNF-α衍生物RMP16的應用，其特征在于:所述的基因重組TNF-α衍生物RMP16用于制備治療如下疾病的藥物:前列腺癌、淋巴瘤、慢性髓原白血病、宮頸癌、乳腺癌。
10.權利要求1或2所述的基因重組TNF-a衍生物RMP16的應用，其特征在于:所述的基因重組TNF- a 衍生物RMP16用于制備治療TNFR I型受體相關疾病的藥物。
【文檔編號】C12N15/70GK104177489SQ201410367873
【公開日】2014年12月3日 申請日期:2014年7月29日 優先權日:2014年7月29日
【發明者】馬義, 洪岸, 姜石松 申請人:暨南大學