專利名稱：：用于檢測alk-1基因突變的引物組、該引物組的用途及包含該引物組的試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及引物，具體涉及用于檢測ALK-1基因突變的引物組，本發(fā)明還涉及該引物組的用途，以及包含該引物組的試劑盒。
背景技術(shù)：
：活化素受體激酶I(activinreceptortypeI1-likekinase-l,ALK-1也稱為ACVRL1)位于12qll_ql4，含10個外顯子，基因組全長約15kb+。它突變能引起遺傳性出血性毛細(xì)血管擴張癥(hereditaryhemorrhagictelangiectasiaHHT)或遺傳性肺動脈高壓(heritablepulmonaryarterialhypertensionPAH)。有些突變攜帶者同時具有兩種病癥。HHT是一種常染色體顯性遺傳性出血性疾病，以皮膚黏膜多發(fā)性毛細(xì)血管擴張伴反復(fù)出血為特征，臨床上一般可分為I型HHT和II型HHT兩種表型。其中II型HHT由ALK-1基因突變引起，HHT-1I最常見的臨床表現(xiàn)為反復(fù)的自發(fā)性出血或輕度創(chuàng)傷出血，以鼻出血最常見，而臨床處理卻非常棘手。肺動脈高壓是各種原因引起的靜息狀態(tài)下右心導(dǎo)管測得的肺動脈平均壓(meanpulmonaryarterialpressure,mPAP)^25mmHg的一組臨床病理生理綜合征。肺動脈高壓可以作為一種疾病而獨立存在，更常見的是很多疾病進(jìn)展到一定階段的病理生理表現(xiàn)。由于肺血管重塑引起肺循環(huán)血流動力學(xué)改變，最終可導(dǎo)致右心衰竭，甚至死亡。這是一種極度惡性的疾病，七成多患者是年輕人，幾乎每個人都知道癌癥預(yù)后差，但沒有人知道肺動脈高壓室一種極度惡性疾病，它的病因復(fù)雜、發(fā)病率高、誤診率高、危害性強，其愈后是災(zāi)難性的，可以說，這種病就是心血管疾病中的癌癥。這種疾病平均發(fā)病年齡是36歲，75%患者集中于20-40歲年齡段，還有15%患者年齡在20歲以下，幾歲的孩子也會發(fā)病。世界上該病的發(fā)病率在IX1(Γ5IXΙΟ—6之間，其中約6%為家族性的。目前，ALKl基因突變的肺動脈高壓患者患病年齡比骨形成蛋白2(BMPR2)基因突變的患者更加年輕化，一旦發(fā)病進(jìn)展更加迅速，更加兇險。因此采用DNA檢測尋找ALK-1基因突變有助于查清病因，識別家系中高風(fēng)險的成員，以及未出生孩子的患病風(fēng)險，這對提高人口素質(zhì)，優(yōu)生優(yōu)育有重要的意義。對臨床上指導(dǎo)用藥，尋找病因，基因評估等具有重要的意義。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的之一是提供一種用于檢測ALK-1基因突變的引物組。ALK-1基因的第I到第10外顯子區(qū)，3’UTR和啟動子中的任意一個區(qū)域在結(jié)構(gòu)上發(fā)生堿基對組成或排列順序的改變，都視為ALK-1基因發(fā)生了突變。因而，根據(jù)ALK-1基因第I到第10外顯子區(qū)，3’UTR和啟動子序列分別設(shè)計出能專一性鑒別ALK-1基因是否突變的特異性引物組。可通過PCR擴增和測序測定ALK-1基因上述區(qū)域是否發(fā)生改變，以鑒定ALK-1基因是否發(fā)生突變。因此，本發(fā)明的用于檢測ALK-1基因突變的引物組可以是ALK-1基因第I到第10外顯子區(qū)、3’UTR和啟動子中任一區(qū)域?qū)?yīng)的引物組。本發(fā)明第一個目的提供的用于檢測ALK-1基因突變的引物組，包括ALK-1基因第I到第10外顯子區(qū)，3’UTR和啟動子中任一區(qū)域?qū)?yīng)的PCR擴增引物組，即選自ALK-1基因第I到第10外顯子區(qū)、3’UTR和啟動子分別對應(yīng)的PCR擴增引物組，具體地，所述引物組選自ALK-1基因的第I外顯子區(qū)(Exonl)的PCR擴增引物組、第2外顯子區(qū)(Exon2)的PCR擴增引物組、第3外顯子區(qū)(Exon3)的PCR擴增引物組、第4外顯子區(qū)(Exon4)的PCR擴增引物組、第5外顯子區(qū)(Εχοηδ)的PCR擴增引物組、第6外顯子區(qū)(Εχοη6)的PCR擴增引物組、第7外顯子區(qū)(Εχοη7)的PCR擴增引物組、第8外顯子區(qū)(ExonS)的PCR擴增引物組、第9外顯子區(qū)(Εχοη9)的PCR擴增引物組、第10外顯子區(qū)(ExonlO)的PCR擴增引物組、3’UTR的PCR擴增弓丨物組和啟動子的PCR擴增弓丨物組中的任意一組，所述的上述各PCR擴增弓丨物組為表I所示。表1:ALK_1基因PCR擴增引物序列ATT,I~引物~~ΓΓ門擴增產(chǎn)物長度ALK-1_Γ1序列(5’—3’))予列表編14、j予可(bp)PFIGCATCATTTCCGTCTATTCTCASEQIDNO.1,1---589IiimJ■PRTCTCCCGATCCGCACTCSEQ1DN0.2(promcLcitPF2ATACCCCTGTGCTGAGTGCSEQIDN0.3-----708__PR2AAATGTTTCTTATTCCAGCGTCSEQIDN0.4__PF.3GCTGGGCAATAGGAAACGSEQ丨DNO.5Exonl---—-—-71bPR3GGACTGATCTGGGAAAGGTGSEQIDN0.6PF4TCATGGCTCTTACTCCACCTCSEQIDN0.7Exon^605^PR4TCATGGCTCTTACTCCACCTCSEQIDN0.8PF5GAGGGACAGTAGGACAGAAATGSEQIDN0.9Exon3---τ-7———569PR5GCTGCTCCGAAGGAGGTTSEQIDNO.1OExon4PF6~GCAGGACTCTGGGATCTAAC'T—SEQIDNOil60權(quán)利要求1.用于檢測ALK-1基因突變的引物組，其特征在于，包括ALK-1基因的第I到第10外顯子區(qū)，3’UTR和啟動子中任一區(qū)域?qū)?yīng)的PCR擴增引物組，所述的PCR擴增引物組包括所述啟動子的PCR擴增引物組包括具有SEQIDNO.1所示的核苷酸序列的引物PFl和具有SEQIDNO.2所示的核苷酸序列的引物PRl的引物組、具有SEQIDNO.3所示的核苷酸序列的引物PF2和具有SEQIDNO.4所示的核苷酸序列的引物PR2的引物組；所述Exonl的PCR擴增引物組包括具有SEQIDNO.5所示的核苷酸序列的引物PF3和具有SEQIDNO.6所示的核苷酸序列的引物PR3的引物組；所述Exon2的PCR擴增引物組包括具有SEQIDNO.7所示的核苷酸序列的引物PF4和具有SEQIDNO.8所示的核苷酸序列的引物PR4的引物組；所述Exon3的PCR擴增引物組包括具有SEQIDNO.9所示的核苷酸序列的引物PF5和具有SEQIDNO.10所示的核苷酸序列的引物PR5的引物組；所述Exon4的PCR擴增引物組包括具有SEQIDNO.11所示的核苷酸序列的引物PF6和具有SEQIDNO.12所示的核苷酸序列的引物PR6；所述Exon5的PCR擴增引物組包括具有SEQIDNO.13所示的核苷酸序列的引物PF7和具有SEQIDNO.14所示的核苷酸序列的引物PR7的引物組；所述Exon6的PCR擴增引物組包括具有SEQIDNO.15所示的核苷酸序列的引物PF8和具有SEQIDNO.16所示的核苷酸序列的引物PR8的引物組；所述Exon7的PCR擴增引物組包括具有SEQIDNO.17所示的核苷酸序列的引物PF9和具有SEQIDNO.18所示的核苷酸序列的引物PR9的引物組；所述Exon8的PCR擴增引物組包括具有SEQIDNO.19所示的核苷酸序列的引物PFlO和具有SEQIDNO.20所示的核苷酸序列的引物PRlO的引物組；所述Exon9的PCR擴增引物組包括具有SEQIDNO.21所示的核苷酸序列的引物PFlI和具有SEQIDNO.22所示的核苷酸序列的引物PRll的引物組；所述ExonlO的PCR擴增引物組包括具有SEQIDNO.23所示的核苷酸序列的引物PF12和具有SEQIDNO.23所示的核苷酸序列的引物PR12的引物組；所述3’UTR的PCR擴增引物組包括具有SEQIDNO.24所示的核苷酸序列的引物PF13和具有SEQIDNO.24所示的核苷酸序列的引物PR13的引物組、具有SEQIDNO.25所示的核苷酸序列的引物PF14和具有SEQIDNO.25所示的核苷酸序列的引物PR14的引物組、具有SEQIDNO.26所示的核苷酸序列的引物PF15和具有SEQIDNO.26所示的核苷酸序列的引物PRl5的引物組。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于檢測ALK-1基因突變的引物組，其特征在于，還包括ALK-1基因的第I到第10外顯子區(qū)，3’UTR和啟動子中任一區(qū)域?qū)?yīng)的PCR測序引物組，所述的PCR測序引物組包括所述啟動子的PCR測序引物組包括具有SEQIDNO.1所示的核苷酸序列的引物PFl和具有SEQIDNO.3所示的核苷酸序列的引物PF2；所述Exonl的PCR測序引物組包括具有SEQIDNO.5所示的核苷酸序列的引物PF3所述Exon2的PCR測序引物組包括具有SEQIDNO.7所示的核苷酸序列的引物PF4所述Exon3的PCR測序引物組包括具有SEQIDNO.9所示的核苷酸序列的引物PF5所述Exon4的PCR測序引物組包括具有SEQIDNO.11所示的核苷酸序列的引物PF6；所述Exon5的PCR測序引物組包括具有SEQIDNO.13所示的核苷酸序列的引物PF7；所述Exon6的PCR測序引物組包括具有SEQIDNO.15所示的核苷酸序列的引物PF8；所述Exon7的PCR測序引物組包括具有SEQIDNO.17所示的核苷酸序列的引物PF9；所述Exon8的PCR測序引物組包括具有SEQIDNO.19所示的核苷酸序列的引物PFlO；所述Exon9的PCR測序引物組包括具有SEQIDNO.21所示的核苷酸序列的引物PFll；所述ExonlO的PCR測序引物組包括具有SEQIDNO.23所示的核苷酸序列的引物PF12；所述3’UTR的PCR測序引物組包括具有SEQIDNO.24所示的核苷酸序列的引物PF13、具有SEQIDNO.25所示的核苷酸序列的引物PF14和具有SEQIDNO.26所示的核苷酸序列的引物PF15。3.權(quán)利要求1所述的PCR擴增引物組在制備通過PCR擴增自生物樣品獲得核酸樣品檢測ALK-1基因是否突變的試劑中的用途。4.包含權(quán)利要求1的引物組的用于檢測ALK-1基因突變的試劑盒，其特征在于，包括ALK-1基因的第I到第10外顯子區(qū)，3’UTR和啟動子分別對應(yīng)的PCR擴增引物組中的一組或兩組以上的PCR擴增引物組，所述的PCR擴增引物組如權(quán)利要求1所示。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的用于檢測ALK-1基因突變的試劑盒，其特征在于，還包含有權(quán)利要求2所述的PCR測序引物組。6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的用于檢測ALK-1基因突變的試劑盒，其特征在于，還包括常規(guī)PCR擴增試劑、PCR產(chǎn)物純化試劑和DNA測序試劑。7.一種使用權(quán)利要求1或2所述的引物組或者權(quán)利要求4或5所述的試劑盒對ALK-1基因的PCR擴增方法，其特征在于，取所述的ALK-1基因的第I到第10外顯子區(qū)，3’UTR和啟動子分別對應(yīng)的PCR擴增引物組中的一組或兩組以上的PCR擴增弓丨物組對ALK-1基因進(jìn)行PCR擴增反應(yīng)，所述PCR擴增反應(yīng)包括30個擴增循環(huán)反應(yīng)，其條件為變性溫度9894°C，退火溫度為5560°C，延伸溫度72°C。8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的ALK-1基因的PCR擴增方法，其特征在于，所述的PCR擴增反應(yīng)中每20μI的反應(yīng)體系中使用O.2IμI的各引物和IO-1OOng模板DNA。9.根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的ALK-1基因的PCR擴增方法，其特征在于，還包括PCR產(chǎn)物純化步驟，所述產(chǎn)物純化的條件為37°C孵育60min，70°ClOmin。全文摘要本發(fā)明公開了用于檢測ALK-1基因突變的引物組，至少包括ALK-1基因第1到第10外顯子區(qū)，3’UTR和啟動子中任一區(qū)域?qū)?yīng)的PCR擴增引物組和PCR測序引物組。本發(fā)明還公開了所述引物組的用途、包含所述引物組的試劑盒以及使用所述引物組對ALK-1基因進(jìn)行PCR擴增方法。所述的引物組可以專一性鑒別ALK-1基因是否突變，確保了測定結(jié)果的準(zhǔn)確性和唯一性。文檔編號C12Q1/68GK102994628SQ20121025555公開日2013年3月27日申請日期2012年7月23日優(yōu)先權(quán)日2012年7月23日發(fā)明者盧文菊,張晨婷,王健申請人:廣州醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院