本發(fā)明涉及肺動脈高壓治療，具體為一種bmal1過表達腺病毒在肺動脈高壓治療中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、肺動脈高壓(ph)是一種嚴重的循環(huán)系統(tǒng)疾病，其定義是由多種異源性疾病因和不同的發(fā)病機制所引起的肺血管結(jié)構(gòu)和(或)功能的改變，這些改變導(dǎo)致肺血管阻力增加和肺動脈壓力升高，形成了一種復(fù)雜的臨床和病理生理綜合征，ph的病因極為復(fù)雜，可以是原發(fā)性的，也可以是繼發(fā)性的，原發(fā)性肺動脈高壓的病因目前尚不明確，可能與遺傳因素、藥物或毒素暴露及某些炎癥性疾病有關(guān)，而繼發(fā)性肺動脈高壓則可能與多種基礎(chǔ)疾病相關(guān)，如左心疾病、代謝性疾病等，不同的病因和發(fā)病機制導(dǎo)致肺血管的結(jié)構(gòu)和功能出現(xiàn)異常，如肺小動脈的痙攣、重構(gòu)等，這些改變使肺血管的順應(yīng)性降低，血流阻力增加，最終導(dǎo)致肺動脈壓力升高，隨著病情的發(fā)展，持續(xù)升高的肺動脈壓力會增加右心室的負擔(dān)，因為右心室是負責(zé)將血液泵入肺部的泵，長期的高負荷使得右心室逐漸肥厚、擴張，最終可能發(fā)展為右心衰竭，右心衰竭是一種嚴重的心臟病，表現(xiàn)為心臟泵血功能下降，無法滿足身體對血液和氧氣的需求，患者會出現(xiàn)疲勞、水腫等癥狀，診斷ph通常需要綜合臨床癥狀、超聲心動圖等檢查結(jié)果。

2、近年來，生物鐘基因bmal1在心血管系統(tǒng)中的作用逐漸受到關(guān)注，bmal1作為生物鐘的核心組成部分，參與調(diào)節(jié)多種生理過程，包括細胞增殖、遷移和代謝，研究表明，bmal1在肺動脈平滑肌細胞中的表達異常與肺動脈高壓的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，然而，關(guān)于bmal1如何具體影響pasmcs的增殖和遷移，以及如何通過調(diào)控bmal1來治療肺動脈高壓，目前尚不完全清楚。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于提供一種bmal1過表達腺病毒在肺動脈高壓治療中的應(yīng)用，具備高效準確，敏感度高的優(yōu)點，解決了背景技術(shù)中所提到的問題。

2、為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：一種bmal1過表達腺病毒在肺動脈高壓治療中的應(yīng)用，所述應(yīng)用包括：

3、bmal1過表達腺病毒可減輕肺動脈高壓中肺動脈平滑肌增殖遷移，具體為：構(gòu)建一種過腺病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)構(gòu)建大鼠肺動脈平滑肌細胞bmal1過表達模型，其包括如下步驟：

4、步驟一：進行cck8實驗，實驗表明缺氧后，轉(zhuǎn)染空載腺病毒及過表達bmal1的pasmc增殖均較常氧的pasmc增加，而缺氧后，轉(zhuǎn)染過表達bmal1的pasmc增殖較轉(zhuǎn)染空載腺病毒的pasmc減少；

5、步驟二：設(shè)置三組實驗組，分別為常氧狀態(tài)下空載腺病毒、缺氧狀態(tài)下空載腺病毒和缺氧狀態(tài)下bmal1過表達腺病毒、bmal1過表達腺病毒的大鼠肺動脈平滑肌細胞缺氧處理后的遷移能力較對照組缺氧后減少；

6、步驟三：提取鼠肺動脈平滑肌細胞蛋白進行western?blot實驗：bmal1過表達的肺動脈平滑肌細胞bmal1蛋白水平顯著上調(diào)；

7、bmal1過表達腺病毒可減輕肺動脈高壓的肺血管重構(gòu)，具體為：構(gòu)建通過缺氧結(jié)合su5416構(gòu)建小鼠肺動脈高壓疾病模型，通過滴鼻構(gòu)建小鼠肺血管bmal1過表達模型，其包括如下步驟：

8、步驟一：設(shè)置三組實驗組，分別為常氧狀態(tài)下空載腺病毒滴鼻、缺氧狀態(tài)下空載腺病毒滴鼻和缺氧狀態(tài)下bmal1過表達腺病毒滴鼻，通過右心導(dǎo)管測壓得出結(jié)論，肺動脈高壓疾病組小鼠右心壓力較對照組升高，bmal1過表達治療組小鼠缺氧給藥后右心壓力較肺高壓組下降；

9、步驟二：對步驟一種的小鼠進行肺血管造影；肺高壓組小鼠肺血管損傷較對照組加重,bmal1過表達治療組小鼠肺血管損傷較肺高壓組減輕；

10、步驟三：提取鼠的肺組織蛋白進行westen?blot實驗，驗證肺高壓組的小鼠肺組織bmal1蛋白表達較對照組下調(diào)，bmal1過表達治療組小鼠肺組織bmal1蛋白表達明顯上調(diào)。

11、優(yōu)選的，所述bmal1過表達腺病毒制備流程如下：

12、步驟一、重組質(zhì)粒的構(gòu)建

13、根據(jù)genbank中公布的bmal1編碼基因的cds序列，考慮密碼子偏好性、mrna二級結(jié)構(gòu)、重復(fù)序列、gc含量等，對bmal1編碼序列進行密碼子優(yōu)化。分別在5’、3端分別添加ecori、bamhi酶切位點，將化學(xué)合成的bmal1片段、穿梭質(zhì)粒pcadv分別用ecori與bamhi酶切，solution?i連接并轉(zhuǎn)化大腸埃希菌dh5α菌株(e.colidh5α)，在氨芐青霉素抗性平板上篩選。挑選轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒，采用mlul(位于ef1啟動子上游)和ecori雙酶切和dna測序鑒定重組質(zhì)粒(pcadv-bmal1)。

14、步驟二、重組質(zhì)粒的表達檢測

15、將0.8ug的pcadv-bmal1混勻于50μl無血清培養(yǎng)基中；2μl轉(zhuǎn)染試劑lip2000加入50μl無血清培養(yǎng)基中，室溫孵育5min；將上述溶液混勻后室溫孵育20min，加入融合度為60％-80％的hek293t細胞。轉(zhuǎn)染48h后，在熒光顯微鏡下觀察。ripa細胞裂解液冰上裂解細胞并離心收集細胞蛋白，bca定量并經(jīng)10％sds-page電泳后，轉(zhuǎn)印至pvdf膜，封閉后分別孵育抗flag(1:5000)和抗gapdh(1:5000)抗體，再孵育hrp-igg(1:5000)，化學(xué)發(fā)光法檢測目的蛋白的表達。

16、步驟三、ad-bmal1的包裝

17、按照admax腺病毒包裝試劑盒操作，具體步驟為：將2μg重組穿梭質(zhì)粒pcadv-bmal1與2μg骨架質(zhì)粒溶于250ml?opti-mem培養(yǎng)基，獲得質(zhì)粒稀釋液：10μl轉(zhuǎn)染試劑lip2000加入250μl?opti-mem培養(yǎng)基，為轉(zhuǎn)染試劑稀釋液。將轉(zhuǎn)染試劑稀釋液滴加入質(zhì)粒稀釋液中，室溫孵育20min后，加入hek293t中進行腺病毒包裝。在熒光顯微鏡下觀察，待大部分細胞出現(xiàn)典型的細胞病變效應(yīng)，且有50％以上的細胞脫壁時，收集細胞上清，即獲得ad-bmal1.

18、步驟四、ad-bmal1的擴增和純化

19、ad-bmal1感染hek293t細胞，培養(yǎng)2-3d后，加入10％np40裂解細胞，12000r/min離心10min收集上清。每100ml上清加入50ml病毒沉淀液(20％peg8000,2.5m?nacl)，冰浴1h，12000r/min離心20min收集沉淀，并重懸于10ml密度為1.10g/ml的csci溶液。密度梯度離心法純化病毒。收集病毒，4℃過夜透析后，-80℃保存。

20、步驟五、ad-bmal1滴度測定

21、分別將100μl?10-4-10-7稀釋的ad-bmal1加入293t細胞中培養(yǎng)48h。預(yù)冷甲醛固定后1％bsa封閉，依次孵育抗腺病毒外殼蛋白hexon抗體、hrp標記的羊抗鼠igg(1:5000)。二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine，dab)染色，在顯微鏡明場下計陽性細胞個數(shù)。病毒滴度(pfu/ml)＝(感染細胞數(shù)/視野數(shù))x(每孔視野數(shù))x(稀釋倍數(shù))/(0.1ml)。

22、步驟六、ad-bmal1表達目的蛋白鑒定

23、分別以ad和rad-bmal1感染293t細胞，感染后48h制備細胞總蛋白，western?blot檢測bmal1的表達，陽性對照為帶his標簽的純化bmal1重組蛋白，一抗為bmal1單克隆抗體(1:1000)1，二抗為羊抗鼠hrp-igg(1:5000)。同時，用ad和ad-bmal1感染293t細胞，感染后24h用免疫熒光檢測bmal1表達，一抗為bmal1單克隆抗體(1:500)二抗為紅色熒光cy3標記的羊抗鼠igg(1:200)，以dapi染色細胞核，熒光觀察。

24、優(yōu)選的，所述腺病毒轉(zhuǎn)染方式包括如下步驟：

25、步驟一：第一天，將狀態(tài)良好的目的細胞接種到培養(yǎng)皿中。保證第二天感染時細胞匯合度介于50％至70％；

26、步驟二：第二天，預(yù)熱培養(yǎng)基，取出病毒，放到冰上融化，用桌面離心機簡易離心，使病毒液聚集管底；棄去培養(yǎng)基，將準備好的病毒加入無血清培養(yǎng)基中混勻后，加入培養(yǎng)皿；

27、步驟三：2h后(中間每0.5h均勻搖晃一次，增加感染效率)，補加步驟3中等量的含10％fbs正常培養(yǎng)基；

28、步驟四：12-24h后更換新鮮的正常培養(yǎng)基；

29、步驟五：感染48-72h后觀察熒光表達及做相關(guān)檢測。

30、優(yōu)選的，所述bmal1過表達腺病毒訂購于和元生物，基因名稱:bmal1，基因id:11865，轉(zhuǎn)錄本:nm_001368412.1，物種:rat，基因大小:1899。

31、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果如下：

32、本發(fā)明通過構(gòu)建小鼠模型，闡述bmal1過表達腺病毒通過調(diào)節(jié)相關(guān)信號通路，能夠有效抑制缺氧條件下肺動脈平滑肌細胞的增殖和遷移，有助于減輕肺血管重構(gòu)，并且通過構(gòu)建小鼠模型，解釋bmal1過表達腺病毒能夠降低右心壓力，減輕肺血管損傷，從而改善肺動脈高壓的臨床癥狀，為肺動脈高壓治療提供新靶點：本發(fā)明揭示了bmal1過表達腺病毒在肺動脈高壓中的重要作用，為開發(fā)針對該疾病的新型治療方法提供了潛在的靶點，通過深入探究bmal1的作用機制，有助于進一步理解肺動脈高壓的病理生理過程，推動該領(lǐng)域研究的深入發(fā)展，該bmal1過表達腺病毒在肺動脈高壓治療中的應(yīng)用具備高效準確，敏感度高的優(yōu)點，解決了背景技術(shù)所提到的問題。