本發明屬于生物
技術領域：
，具體涉及一種多肽及其在制備治療和預防腫瘤的藥物中的應用。
背景技術：
：trb3(tribbleshomologue3)是tribbles同源蛋白家族成員之一，參與調節發育過程中細胞的增殖、遷移及形態形成。trb3作為假激酶蛋白家族成員，具有接頭蛋白樣的功能，參與多種蛋白復合體的組裝。多項研究認為，trb3可以與多種轉錄因子、泛素連接酶、細胞膜上ii型bmp受體以及mapk、pi3k信號通路成員蛋白發生相互作用，參與糖脂代謝、脂肪細胞分化、凋亡和應激等的調控。近來，多種證據表明，trb3在多種腫瘤細胞系和人腫瘤組織中呈現高表達，并且在腫瘤的發展過程中發揮重要的促進作用。研究發現，trb3通過與自噬貨車蛋白p62發生相互作用，抑制細胞的自噬活性，促進腫瘤細胞的增殖和轉移。由此可見，靶向trb3與p62之間的相互作用是治療腫瘤的一個潛在靶點。因此，研究和開發阻斷trb3與p62蛋白相互作用的物質，具有很好的抑制腫瘤發生和發展的成藥前景。蛋白-蛋白相互作用(ppis)在許多生物過程中扮演著重要的角色，例如細胞的增殖、生長、分化及程序性死亡。人類疾病中許多潛在的治療靶標主要是蛋白-蛋白相互作用。在蛋白-蛋白相互作用的過程中，α螺旋和β折疊二級結構是參與ppis的主要接觸面單元。近年來，用化學合成方式得到高活性、高選擇性的合成多肽類藥物已經成為新的研究熱點。然而，多肽與作用蛋白的結合能力非常弱，普通的線性多肽不能透過細胞膜且易被蛋白酶水解。因此，多肽類靶點藥物目前還有很多不足。由上可知，亟待獲得靶向trb3與p62之間的相互作用的，高活性、高選擇性的合成多肽類藥物。技術實現要素：本發明所要解決的技術問題是針對目前缺乏靶向trb3與p62之間的相互作用的，高活性、高選擇性的合成多肽類藥物的現狀，提供一種特異性結合trb3的多肽及其在制備治療和預防腫瘤的藥物中的應用。本發明的發明人經過深入的研究和反復的試驗發現，靶向trb3與p62蛋白相互作用的多肽a2(氨基酸序列參見序列表seqidno.8)與trb3的特異性結合能力和生物穩定性都比較低。而其與多肽a2在溶液中不能穩定形成活性所需的α螺旋構象直接相關。由此，發明人進行了針對性的研究和試驗，發現如果將多肽a2中特定位置的氨基酸殘基替換為側鏈可以相連的非天然氨基酸，如s-戊烯丙氨酸(s5)，則改造后的多肽具有穩定的α螺旋的二級結構，使改造后的多肽具有極高的親和力、抗酶解穩定性以及細胞穿膜性，即提高其α螺旋穩定性、trb3結合能力和代謝穩定性，抑制多種腫瘤細胞增殖和轉移。經實驗驗證，改造后的多肽能夠應用于制備治療和預防腫瘤的藥物中。基于發明人的研究工作，本發明提供下述的技術方案。本發明提供的技術方案之一是：一種特異性結合trb3的多肽，所述多肽的氨基酸序列如將序列表seqidno.8所示的氨基酸序列中的兩個或兩個以上的氨基酸替換為側鏈可相連的非天然氨基酸所示。所述的使其他側鏈相連的非天然氨基酸為本領域常規的非天然氨基酸，較佳的為s-戊烯丙氨酸(s5)。較佳的，所述的多肽中，所述替換的氨基酸的數目為兩個且所述替換的氨基酸的位置分別為第i位和第i+3位，或者，為第i位和第i+4位，其中1≤i≤7，i為正整數。更佳的，所述的多肽的氨基酸序列如將序列表seqidno.1、seqidno.2、seqidno.3、seqidno.4、seqidno.5、seqidno.6和seqidno.7中任一項所示。其中，上述seqidno.1-seqidno.7所示的氨基酸序列中可進行適當地氨基酸替換、缺失或添加，只要使改造后的氨基酸序列仍然能夠與trb3特異性結合并且保持改造前的活性即可。本發明提供的技術方案之二是：一種特異性結合trb3的多肽在制備治療和/或預防腫瘤的藥物中的應用。所述的腫瘤為本領域常規的腫瘤。較佳地是肝癌、肺癌、乳腺癌、腸癌或白血病。其中，所述肝癌為本領域常規的肝癌，較佳的為原發性肝癌或繼發性肝癌。所述肺癌為本領域常規的肺癌，較佳的為小細胞肺癌或非小細胞肺癌。所述乳腺癌為本領域常規的乳腺癌，較佳的為非浸潤性乳腺癌、早期浸潤性乳腺癌、浸潤性特殊類型乳腺癌或浸潤性非特殊類型乳腺癌。所述腸癌為本領域常規的腸癌，較佳的為結腸癌或直腸癌。所述白血病為本領域常規的白血病，較佳的為淋巴細胞型白血病或非淋巴細胞型白血病。所述預防是本領域常規的預防，較佳的指存在可能的腫瘤因素時，使用后防止或降低腫瘤的產生。所述治療是本領域常規的治療，較佳的指減輕腫瘤的程度，或者治愈腫瘤使之正常化，或者減緩腫瘤的進程。本發明提供的技術方案之三是：一種抗腫瘤的藥物組合物，其含有所述的特異性結合trb3的多肽作為活性成分。所述的活性成分是指具有預防或治療腫瘤功能的化合物。在所述藥物組合物中，所述特異性結合trb3的多肽可以單獨作為活性成分或和其他具有抗腫瘤活性的化合物一起作為活性成分。本發明所述的藥物組合物的給藥途徑較佳的為注射給藥或口服給藥。所述注射給藥較佳的包括靜脈注射、肌肉注射、腹腔注射、皮內注射或皮下注射等途徑。所述的藥物組合物為本領域常規的各種劑型，較佳的為固體、半固體或液體的形式，可以為水溶液、非水溶液或混懸液，更佳的為片劑、膠囊、顆粒劑、注射劑或輸注劑等。較佳地，本發明所述的藥物組合物還包括一種或多種藥用載體。所述的藥用載體為本領域常規藥用載體，所述的藥用載體可以為任意合適的生理學或藥學上可接受的藥物輔料。所述的藥物輔料為本領域常規的藥物輔料，較佳的包括藥學上可接受的賦形劑、填充劑或稀釋劑等。更佳地，所述的藥物組合物包括0.01-99.99％的上述蛋白質和0.01-99.99％的藥用載體，所述百分比為占所述藥物組合物的質量百分比。較佳地，所述的藥物組合物的施用量為有效量，所述有效量為能夠緩解或延遲疾病、退化性或損傷性病癥進展的量。所述有效量可以以個體基礎來測定，并將部分基于待治療癥狀和所尋求結果的考慮。在符合本領域常識的基礎上，上述各優選條件，可任意組合，即得本發明各較佳實例。本發明所用試劑和原料均市售可得。本發明的積極進步效果在于：本發明的多肽能夠特異性地與trb3結合，阻斷trb3和p62蛋白的相互作用，從而應用于治療和預防腫瘤的藥物的制備中。所制備的藥物在治療腫瘤疾病中，具有療效顯著，毒副作用少，使用安全的優點。附圖說明圖1為表面等離子共振方法驗證多肽a2、s1、s2、s3、s4、s5、s6和s7與trb3蛋白的結合能力。其中圖1(a)為多肽a2與trb3蛋白的動力學曲線；圖1(b)為多肽s1與trb3蛋白結合動力學曲線；圖1(c)為多肽s2與trb3蛋白結合動力學曲線；圖1(d)為多肽s3與trb3蛋白結合動力學曲線；圖1(e)為多肽s4與trb3蛋白結合動力學曲線；圖1(f)為多肽s5與trb3蛋白結合動力學曲線；圖1(g)為多肽s6與trb3蛋白結合動力學曲線；圖1(h)為多肽s7與trb3蛋白結合動力學曲線。圖1中的橫坐標為反應時間，單位為秒?？v坐標為反應芯片表面與多肽的反應強度，單位為ru。圖2為多肽a2、s1、s2、s3、s4、s5、s6和s7干擾trb3與p62蛋白相互作用圖譜。其中a顯示a2、s1、s2和s3干擾trb3與p62蛋白的相互作用；其中b顯示s4、s5、s6和s7干擾trb3與p62蛋白的相互作用。“一”表示輸入，即細胞裂解液內trb3蛋白與p62蛋白的蛋白量；“二”表示輸出，即經過p62抗體沉淀之后所含trb3蛋白與p62蛋白的蛋白量。圖3為多肽s1、s2、s3、s4、s5、s6和s7抑制肝癌細胞hepg2生長結果圖。橫坐標為給藥時間，單位為天。縱坐標為細胞數量，單位為萬。對照為多肽a2。圖4為多肽s1、s2、s3、s4、s5、s6和s7抑制肺癌細胞a549生長結果圖。橫坐標為給藥時間，單位為天?？v坐標為細胞數量，單位為萬。對照為多肽a2。圖5為多肽s1、s2、s3、s4、s5、s6和s7抑制乳腺癌細胞mda-mb-231生長結果圖。橫坐標為給藥時間，單位為天?？v坐標為細胞數量，單位為萬。對照為多肽a2。圖6為多肽s1、s2、s3、s4、s5、s6和s7抑制腸癌細胞hct-8生長結果圖。橫坐標為給藥時間，單位為天?？v坐標為細胞數量，單位為萬。對照為多肽a2。圖7為多肽s1、s2、s3、s4、s5、s6和s7抑制白血病細胞k562生長結果圖。橫坐標為給藥時間，單位為天?？v坐標為細胞數量，單位為萬。對照為多肽a2。圖8為多肽a2、s1、s2、s3、s4、s5、s6和s7抑制肝癌細胞hepg2遷移結果圖?？v坐標為細胞劃痕后修復面積比，單位為百分數。對照為多肽a2。***表示p<0.001。圖9為多肽a2、s1、s2、s3、s4、s5、s6和s7抑制肺癌細胞a549遷移結果圖?？v坐標為細胞劃痕后修復面積比，單位為百分數。對照為多肽a2。***表示p<0.001。圖10為多肽a2、s1、s2、s3、s4、s5、s6和s7抑制乳腺癌細胞mda-mb-231遷移結果圖?？v坐標為細胞劃痕后修復面積比，單位為百分數。對照為多肽a2。***表示p<0.001。圖11為多肽a2、s1、s2、s3、s4、s5、s6和s7抑制腸癌細胞hct-8遷移結果圖。縱坐標為細胞劃痕后修復面積比，單位為百分數。對照為多肽a2。***表示p<0.001。圖12為多肽a2、s1、s2、s3、s4、s5、s6和s7抑制白血病細胞k562克隆形成結果圖?？v坐標為克隆形成數，單位為個。對照為多肽a2。***表示p<0.001。具體實施方式下面通過實施例的方式進一步說明本發明，但并不因此將本發明限制在所述的實施例范圍之中。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，按照常規方法和條件，或按照商品說明書選擇。若無特別說明，實施例中所用的pbs溶液，指濃度為0.1m、ph值為7.2的磷酸鹽緩沖液。實施例中的室溫為本領域常規的室溫，較佳的為15-30℃。實驗結果用均值±標準誤表示，經參數或者非參數方差檢驗，經比較p<0.05認為有顯著性差異，p<0.01認為有極其顯著性差異。實施例1多肽的合成多肽a2的氨基酸序列參見序列表seqidno.8。多肽a2由北京賽百盛基因技術有限公司合成并純化。引入兩個非天然氨基酸s-戊烯丙氨酸(s5)進行固相多肽鏈合成。固相多肽鏈合成完成后采用釕作為催化劑進行烯烴復分解反應(rcm)環化即得目標多肽。最后將目標多肽從樹脂上切割下來進行純化。上述固相多肽鏈合成及純化的步驟由中肽生化有限公司公司完成。其中，兩個s-戊烯丙氨酸插入在多肽a2氨基酸序列中的第i、i+3位或者i、i+4位，由此得到不同序列的改造后的多肽(氨基酸序列參見序列表seqidno.1-seqidno.7)，其具體插入位點如下所示：s1：s5-gly-trp-s5-thr-arg-leu-leu-gln-thr-lys；插入位點第i、i+3位，i＝1；s2：gly-s5-trp-leu-thr-s5-leu-leu-gln-thr-lys；插入位點第i、i+4位，i＝2；s3：gly-gly-s5-leu-thr-arg-s5-leu-gln-thr-lys；插入位點第i、i+4位，i＝3；s4：gly-gly-trp-s5-thr-arg-leu-s5-gln-thr-lys；插入位點第i、i+4位，i＝4；s5：gly-gly-trp-leu-s5-arg-leu-leu-s5-thr-lys；插入位點第i、i+4位，i＝5；s6：gly-gly-trp-leu-thr-s5-leu-leu-gln-s5-lys；插入位點第i、i+4位，i＝6；s7：gly-gly-trp-leu-thr-arg-s5-leu-gln-thr-s5；插入位點第i、i+4位，i＝7。實施例2用表面等離子共振的方法檢測多肽與trb3蛋白的結合能力表面等離子共振實驗在表面等離子共振儀biacoret200中進行，操作步驟按照等離子共振儀biacoret200的說明書進行。具體步驟如下：1.將純化的trb3蛋白(購自rd公司)通過氨基偶聯到cm5芯片上(購自ge公司)，按10μl/min的流速洗脫除去未結合的蛋白，并且平衡芯片表面2小時。其中，氨基偶聯、洗脫和平衡的具體步驟參見ge公司cm5芯片的相關說明書。2.自動進樣250μl不同濃度(800、400、200、50、12.5、6.25和3.125nm)的實施例1所制備的s1-s7和a2多肽片段，整個表面等離子共振實驗在25℃進行。所使用的緩沖液為hbs-ep緩沖液[0.01mhepes、0.15mnacl、3mmedta和0.005％(w/w)表面活性劑]。用biacoret200自帶分析軟件模擬不同濃度多肽與trb3的結合曲線，結果如圖1(a)-(h)和表1所示。圖1(a)-(h)和表1說明，肽段s1、s2、s3、s4、s5、s6和s7與trb3蛋白的親和力明顯高于多肽a2與trb3蛋白的親和力。表1多肽s1-s7和a2與trb3蛋白的親和力測試實施例3圓二色譜法檢測多肽的α螺旋率用圓二色譜儀(購自日本jasco公司)檢測多肽的α螺旋率。將實施例1所制備的多肽a2、s1、s2、s3、s4、s5、s6和s7溶解到pbs溶液中，將圓二色譜儀的上機濃度調整為1mg/ml，結果如表2所示。表2說明，多肽s1、s2、s3、s4、s5、s6和s7的α螺旋率明顯高于多肽a2，由于多肽的α螺旋二級結構介導多肽與trb3蛋白結合，因此，多肽s1-s7的α螺旋率的提高與其和trb3蛋白結合能力的增加，以及多種腫瘤細胞的增殖和轉移有關。其中，α螺旋率指保持二級結構α螺旋的肽段數量占總肽段數量的百分比。表2圓二色譜法測定多肽α螺旋率多肽名稱a2s1s2s3s4s5s6s7α螺旋率0.87％42.1％39.6％50.2％47.8％46.0％41.6％45.0％實施例4免疫共沉淀的方法驗證多肽在細胞水平抑制蛋白p62與trb3的結合其中，免疫共沉淀有關試劑如下：裂解液a液：0.6057gtris堿、1.7532gnacl、0.1017gmgcl2·6h2o、0.0742gedta、10ml甘油和10ml10％(v/v)np40，加去離子水至150ml，用hcl調ph值至7.6，定容至191ml，充分混勻，0.45μm濾膜過濾，4℃儲存。裂解液b液：200μl2mβ-磷酸甘油、4ml2.5mnaf、2ml100mmpmsf、200μl1mdtt和1mg/ml的leu、pep及apr各200μl，總體積9ml，于-20℃儲存。其中，2mβ-磷酸甘油、2.5mnaf、100mmpmsf、1mdtt和1mg/ml的leu、pep及apr均以母液形式儲存，除pmsf的母液以甲醇為溶劑配制以外，其余均以水為溶劑。使用時，將裂解液b液解凍，按裂解液b液:裂解液a液1:100體積比將裂解液b液加入裂解液a液中并混勻。免疫共沉淀洗液：1％(v/v)np40、150mmnacl、20mmhepes、ph7.510％(v/v)甘油和1mmedta。proteina/gplus-agarose購自美國santacruz公司。具體操作步驟如下：1.將肝癌hepg2細胞(購自中國醫學科學院基礎醫學研究所)鋪90mm2培養皿，待細胞貼壁后分別加入1mg/ml的實施例1制得的多肽a1、s1、s2、s3、s4、s5、s6或s7，在37℃孵育箱中孵育12小時后收集細胞。2.以100:1的體積比將裂解液a液和裂解液b液配置成10ml裂解液，加550μl裂解液裂解步驟1收集的細胞，收獲細胞中總蛋白，將各組蛋白調整至相同濃度。每組蛋白各取200μg，作為對照。3.分別取200μg步驟2所得的各組蛋白，加入2μgp62抗體(購自sigma公司)，同時加入10μlproteina/gplus-agarose(購自santacruze公司)充分重懸，4℃緩慢旋轉搖動過夜。4℃、3000rpm離心5min，小心吸除上清。加入0.5ml免疫共沉淀洗液，混勻，冰浴靜置1min后4℃、3000rpm離心30秒，小心吸除上清。重復洗滌5次，最后一次離心前靜置5min。小心吸除上清，加入30μl2×sds凝膠加樣緩沖液，混勻，95℃變性3min，迅速轉移至冰浴冷卻。12000rpm室溫離心2min，上清即為沉淀的蛋白樣品，取部分或全部進行sds-聚丙烯酰胺凝膠電泳。結果如圖2所示。圖2的結果說明，多肽s1、s2、s3、s4、s5、s6和s7干擾trb3/p62蛋白相互作用能力明顯高于多肽a2。實施例5細胞計數實驗驗證多肽s1、s2、s3、s4、s5、s6和s7可以抑制腫瘤細胞的生長具體操作步驟如下：1.收集對數生長期的肝癌細胞hepg2(購自中國醫學科學院基礎醫學研究所)、肺癌細胞a549(購自中國醫學科學院基礎醫學研究所)、結腸癌細胞hct-8(購自中國醫學科學院基礎醫學研究所)、乳腺癌細胞mda-mb-231(購自中國醫學科學院基礎醫學研究所)和白血病細胞k562(購自中國醫學科學院基礎醫學研究所)，調整細胞濃度，制成15萬個/ml的細胞懸液。2.將1ml步驟1所制得的細胞懸液加入12孔板進行培養(其中hepg2、a549、hct-8和mda-mb-231細胞所用培養基為dmem培養基，k562細胞所用培養基為1640培養基，均購自invitrogen公司；培養溫度為37℃，培養基體積為1ml)，12小時后換成新的培養基，并且加入1μg/ml實施例1所制得的多肽s1、s2、s3、s4、s5、s6和s7。每隔一天進行傳代一次，并進行計數。培養12天后繪制出生長曲線。實驗結果見圖3-7。圖3-7說明多肽s1、s2、s3、s4、s5、s6和s7相比于a2更能夠抑制腫瘤細胞的生長。其中，多肽s1相對于多肽a2對肺癌細胞的生長的抑制水平高達4倍，多肽s2相對于多肽a2對肝癌和結腸癌細胞的生長的抑制水平高達3倍，多肽s3相對于多肽a2對肺癌細胞的生長的抑制水平高達3倍，多肽s4相對于多肽a2對乳腺癌細胞的生長的抑制水平高達3倍，多肽s5相對于多肽a2對肺癌細胞的生長的抑制水平高達3倍，多肽s6相對于多肽a2對白血病細胞的生長的抑制水平高達3倍，多肽s7相對于多肽a2對乳腺癌細胞的生長的抑制水平高達3倍。實施例6細胞劃痕實驗驗證多肽a1、s1、s2、s3、s4、s5、s6和s7抑制腫瘤細胞劃痕后的愈合具體操作步驟如下：1.先用記號筆在6孔板背后，用直尺比著劃橫線，橫穿過孔。2.在每個孔中分別加入5×105個腫瘤細胞，在dmem培養基中37℃孵育箱培養過夜后細胞貼壁。該腫瘤細胞為對數生長期的肝癌細胞hepg2、肺癌細胞a549、結腸癌細胞hct-8和乳腺癌細胞mda-mb-231。3.第二天用槍頭比著直尺，盡量垂直于背后的橫線進行劃痕，槍頭要垂直。4.用pbs洗細胞3次，去除劃下的細胞，加入新的培養基，同時加入1μg/ml實施例1所制備的多肽a1、s1、s2、s3、s4、s5、s6和s7。5.然后放入37℃5％(v/v)co2培養箱培養，24小時后取樣拍照。實驗結果見圖8-11和表3-6，其中損傷修復面積比指修復后的損傷面積與修復前的損傷面積的比值，單位為百分數。表3-6的結果說明，損傷修復面積比越大說明腫瘤細胞的遷移能力越強，細胞劃痕后愈合能力越強。因此多肽s1、s2、s3、s4、s5、s6和s7可以降低腫瘤細胞劃痕后的愈合能力。表3多肽s1-s7和a2抑制肝癌細胞hepg2遷徙多肽名稱損傷修復面積比a2(對照)79.4±1.05s122.6±0.33s218.7±0.51s319.8±0.69s412.1±0.47s513.3±0.31s629.1±0.41s720.0±0.35表4多肽s1-s7和a2抑制肺癌細胞a549遷徙表5多肽s1-s7和a2抑制結腸癌細胞hct-8遷徙多肽名稱損傷修復面積比a2(對照)67.7±2.33s124.5±1.97s218.2±2.30s312.7±2.37s412.6±2.29s512.5±2.60s612.1±1.92s711.2±1.01表6多肽s1-s7和a2抑制乳腺癌細胞mda-mb-231遷徙多肽名稱損傷修復面積比a2(對照)91.3±3.22s136.7±2.91s220.3±2.11s310.5±1.92s421.7±3.35s520.4±4.47s610.4±1.96s717.9±1.05實施例7克隆形成實驗驗證多肽a1、s1、s2、s3、s4、s5、s6和s7抑制白血病細胞的克隆形成其操作步驟如下：1.鋪下層瓊脂：5％(w/w)瓊脂沸水浴至完全融化，冷卻至50℃，加9倍體積37℃預溫的1640培養液(購自invitrogen公司)，混勻，加入24孔板，每孔0.8ml，室溫凝固備用。2.鋪上層瓊脂：9.4ml細胞懸液中加入0.6ml50℃5％(w/w)瓊脂，混勻，加入已鋪好下層瓊脂的24孔板，每孔0.8ml。室溫凝固。每孔細胞數100個。其中，細胞懸液的制備方法為：將白血病細胞k562用1640培養液稀釋，調整濃度為132個細胞/ml。3.將步驟2所得的細胞用1640培養液在37℃孵育箱中孵育培養3周，計算克隆形成數量。其結果如圖12和表7所示。表7的結果說明，多肽s1-s7相對于多肽a2對白血病細胞克隆形成的抑制水平顯著提高。表7多肽s1-s7和a2抑制白血病細胞的克隆形成多肽名稱克隆形成數(個)a2(對照)110±2.94s153±5.7s247±2.3s327±5.5s430±5.4s534±6.1s629±5.3s719±2.1實施例8腫瘤皮下生長實驗驗證多肽a2、s1、s2、s3、s4、s5、s6和s7抑制腫瘤細胞在小鼠體內的生長操作步驟如下：1.實驗耗材及試劑：滅菌ep管1.5ml，15ml離心管，槍頭，濾網(100目)，脫脂棉球，鑷子數把，酒精棉球，無菌1ml注射器，500ml燒杯(滅菌，用前照紫外)，pbs(過濾)，胰酶，血清。2.實驗動物及分組：4-6周齡雄性裸鼠80只(購自北京維通利華實驗動物有限公司)，隨機分為8組：a2、s1、s2、s3、s4、s5、s6和s7組，每組10只。3.細胞制備：將貼壁培養的腫瘤細胞用胰酶消化，到達胰酶消化時間后(此時細胞狀態應為單細胞且剛好貼壁不掉)，吸掉胰酶。用含有1％血清的pbs按2ml/皿終止，將細胞吹下，移至15ml離心管中，1200轉離心5min。棄上清，pbs重懸，過100目濾網一次；細胞計數，調整細胞終濃度至2.5×107/ml。該腫瘤細胞為對數生長期的肝癌細胞hepg2、肺癌細胞a549、結腸癌細胞hct-8和乳腺癌細胞mda-mb-231。懸浮的白血病細胞k562直接收集至15ml離心管，1200轉離心5min。棄上清，pbs重懸，過100目濾網一次；細胞計數，調整細胞終濃度至2.5×107/ml。4.腫瘤細胞接種：接種5×106個腫瘤細胞(細胞懸液200μl)于裸鼠左上腹部近腋下皮下。5.腫瘤生長觀察：皮下注射腫瘤細胞后一周用多肽進行治療(5mg/kg體重，每周兩次)，游標卡尺紀錄腫瘤大小。其結果如表8-表12所示，各表中多肽s1-s7與對照組a2比較的p值均小于0.001。腫瘤體積越大表明腫瘤生長越快，因此多肽s1、s2、s3、s4、s5、s6和s7可以抑制腫瘤細胞在小鼠體內生長。表8多肽s1-s7和a2抑制肝癌細胞hepg2在小鼠體內生長表9多肽s1-s7和a2抑制結腸癌細胞hct-8在小鼠體內生長多肽名稱腫瘤體積(mm3)a2(對照)1754±107.9s1583.4±68.2s2501.8±81.9s3488.8±62.4s4496.5±81.7s5606.4±74.3s6511.1±54.6s7619.8±75.5表10多肽s1-s7和a2抑制乳腺癌細胞mda-mb-231在小鼠體內生長多肽名稱腫瘤體積(mm3)a2(對照)2379.4±165.4s1666.1±74.3s2718.7±67.5s3570.8±69.4s4730.1±84.7s5737.3±83.1s6629.5±54.1s7598.8±75.9表11多肽s1-s7和a2抑制肺癌細胞a549在小鼠體內生長表12多肽s1～s7和a2抑制白血病細胞k562在小鼠體內生長多肽名稱腫瘤體積(mm3)a2(對照)1996.4±1.05s1572.6±63.9s2638.9±75.1s3699.8±69.0s4722.1±94.7s5703.3±73.6s6693.1±54.8s7589.9±75.2上述實施例結果表明，本發明的多肽具有顯著的抗腫瘤作用，可作為活性成份用于制備抗腫瘤的藥物。應理解，在閱讀了本發明的上述內容之后，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。當前第1頁12