專利名稱：用于檢測h5亞型禽流感病毒的重組ha蛋白及其編碼基因的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種用于檢測H5亞型禽流感病毒的重組HA蛋白及其編碼基因。
背景技術：
禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)是一種能引起禽類發生嚴重急性傳染病的A型流感病毒，其引起的禽流感被國際獸疫局(OIE)列為類A動物傳染病。該病毒很容易發生變異，至今已發現了 16個血凝素(HA)和9個神經氨酸酶(NA)亞型。其中，H5是一種高致病性亞型AIV，能引起禽類大規模死亡并給養禽業造成巨大的經濟損失。有證據表明，H5亞型AIV還能通過多種途徑傳播給人類及其它多種哺乳動物，如貓、狗、豬和虎等， 導致其發病甚至死亡。因此，快速準確檢測H5亞型禽流感病毒感染對該病的排查和防控具有重要意義。AIV基因組由8個獨立的RNA組成，共編碼10種蛋白。其中，HA蛋白是AIV的一個重要的表面抗原性蛋白，在病毒的吸附和穿膜、決定病毒致病力等方面起重要作用，也是病毒刺激機體產生中和抗體的重要抗原，在AIV的免疫學診斷中有重要意義。至今為止，有關該病的血清學診斷技術包括血凝抑制試驗(HI)、瓊脂擴散試驗 (AGP)、免疫熒光技術(IFA)、酶聯免疫吸附試驗(ELISA)等。血凝抑制試驗(HI)是禽流感及其亞型鑒定的常用方法，但操作復雜費時，需要與血凝試驗(HA)同時進行，而且對于具有相同神經氨酸酶亞型(NA)的病毒感染容易發生交叉反應，導致誤診。瓊脂擴散試驗(AGP)是利用可溶性抗原抗體在瓊脂糖凝膠內擴散，當抗原抗體發生免疫反應時，在瓊脂糖凝膠內形成肉眼可見的免疫復合物沉淀線，并依此判定結果。該方法特異性差、敏感性低，容易造成誤診。免疫熒光技術(IFA)是一種將免疫學方法與熒光標記技術結合起來研究特異蛋白抗原在細胞內分布的方法。該方法最早在1961年用于人類流感的快速診斷，在禽流感的診斷上也有應用。該方法具有敏感、快速、簡便、成本低等特點，但也存在非特異性熒光干擾而出現的假陽性結果問題。酶聯免疫吸附試驗(ELISA)是一類以酶標抗原或酶標抗體為主要試劑，通過復合物中的酶催化底物呈色而對被檢物進行定性或定量的標記免疫技術。該技術具有靈敏度高、特異性強、準確性好、操作簡單方便等特點，是目前對病毒抗原及其抗體檢測的常用技術。該技術最早于1974年被歐洲國家應用于禽流感的檢測，目前我國研發的禽流感ELISA 診斷方法包括禽流感病毒檢測ELISA和禽流感抗體檢測ELISA兩種。這兩種技術所使用的抗原是全病毒濃縮抗原，需要通過濃縮、純化和滅活等工藝來制備。禽流感病毒是一種很容易變異的病毒，具有潛在性生物安全危害。尤其是H5亞型禽流感病毒，是一種高致病性病毒，制備抗原時要求在至少P3級的生物安全設施中生產。生產成本大、儀器設備要求高，不能滿足實際生產需要，不利于這些技術的推廣應用。針對這些問題，有學者以血凝素(HA) 基因表達蛋白為抗原建立禽流感ELISA檢測技術，并已證明可用于對禽流感病毒的HA亞型進行分型。但由于HA基因中含有較多的大腸桿菌稀有密碼子，HA全長基因在原核細胞中進行表達時，序列中密集分布的稀有密碼子會對重組蛋白的表達產量有很大影響，無法滿足生產需要；而且這些稀有密碼子分布廣泛，對其進行改造需要耗費很大的人力和物力，大幅度增加研發成本。

發明內容
本發明的目的是提供一種用于檢測H5亞型禽流感病毒的重組HA蛋白及其編碼基因。所述蛋白為如下a)或b)的蛋白質a)由序列表序列2所示氨基酸序列組成的蛋白質； b)將序列表序列2的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和 /或添加且可與H5亞型禽流感病毒的抗血清特異結合的蛋白。序列表序列2所示的氨基酸序列由244個氨基酸殘基組成，含有H5亞型禽流感病毒的HA抗原表位。為了使上述(a)中的蛋白便于純化，可在由序列表序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質的氨基末端或羧基末端連接上如表I所示的標簽。表I標簽的序列
權利要求
1.一種蛋白質，是如下a)或b)的蛋白質a)由序列表序列2所示氨基酸序列組成的蛋白質；b)將序列表序列2的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且可與H5亞型禽流感病毒的抗血清特異結合的蛋白。
2.根據權利要求I所述的蛋白，其特征在于所述蛋白質為在序列表序列2所示氨基酸序列的氨基末端添加6個組氨酸的蛋白。
3.編碼權利要求I或2所述蛋白質的基因。
4.根據權利要求3所述的基因，其特征在于編碼權利要求I或2所述蛋白質的基因為如下I)或2)或3)的基因1)其核苷酸序列是序列表序列I的第289位至1020位所示的DNA分子；2)與I)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、 至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有 99%同源性且編碼權利要求I或2所述蛋白質的DNA分子；3)在嚴格條件下與I)或2)限定的DNA序列雜交且編碼權利要求I或2所述蛋白質的 DNA分子。
5.含有權利要求2或3所述基因的重組載體、表達盒、轉基因細胞系、重組菌或重組病毒。
6.根據權利要求5所述的重組載體，其特征在于所述重組載體為將權利要求3或4所述基因插入pET-32a(+)中得到表達權利要求I或2所述蛋白的重組載體。
7.根據權利要求6所述的重組載體，其特征在于所述重組載體為pET-32a(+)-HA，所述pET-32a (+) -HA是將序列表序列I的第289位至1020位所示基因連接到pET_32a (+)的多克隆位點處得到的重組載體。
8.根據權利要求7所述的重組載體，其特征在于所述pET-32a(+)-HA是將序列表序列I的第289位至1020位所示基因連接到pET-32a(+)的EcoR I位點處得到的重組載體。
9.根據權利要求5所述的重組菌，其特征在于所述重組菌為將權利要求5-8中任一所述重組載體導入大腸桿菌Rosetta-gamiB(DE3)中得到表達權利要求I或2所述蛋白的重組菌。
全文摘要
本發明公開了一種用于檢測H5亞型禽流感病毒的重組HA蛋白及其編碼基因。該蛋白是如下a)或b)的蛋白質a)由序列表序列2所示氨基酸序列組成的蛋白質；b)將序列表序列2的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且可與H5亞型禽流感病毒的抗血清特異結合的蛋白。本發明所提供的蛋白是在不改變原有基因信息的前提下，通過選擇HA基因中抗原表位集中、稀有密碼子之間距離相對較遠的區域作為目的基因進行表達，解決了HA全長基因在表達過程中由于部分區域存在密集分布的稀有密碼子而導致目的蛋白表達產量低的難題，開拓了一條方便、低廉、高效獲取檢測抗原的途徑。
文檔編號C12N15/63GK102603874SQ20121008537
公開日2012年7月25日 申請日期2012年3月28日 優先權日2012年3月28日
發明者劉加波, 龐耀珊, 范晴, 謝麗基, 謝志勤, 謝芝勛, 鄧顯文 申請人:廣西壯族自治區獸醫研究所