一種抗流感病毒廣譜中和性的中和分子1e1的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種抗流感病毒廣譜中和性的中和分子1E1，能夠中和多種亞型流感病毒。本發(fā)明的抗體的功能由其輕鏈和重鏈可變區(qū)基因特異性基因序列決定，能夠結(jié)合具有天然構(gòu)象的流感病毒血凝素蛋白(HA)的HA2亞基，能夠阻止多種亞型流感病毒侵染易感細(xì)胞。利用本發(fā)明的抗體可變區(qū)基因或互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)基因，可在利用原核和真核細(xì)胞的任何表達(dá)系統(tǒng)中改造和生產(chǎn)不同形式的基因工程抗體。
【專利說明】—種抗流感病毒廣譜中和性的中和分子1E1
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明提供一株能夠中和多種亞型流感病毒的全人單克隆抗體1E1，具有臨床上預(yù)防或治療多種流感病毒感染的潛力。
【背景技術(shù)】
[0002]自2009年4月起，甲型HlNl流感(A/H1N)疫情在世界范圍內(nèi)爆發(fā)。這一疫情從北美迅速傳播擴(kuò)散到5大洲200多個(gè)國家和地區(qū)。據(jù)世界衛(wèi)生組織報(bào)道，截止2010年4月9日，甲型A/H1N1流感疫情已在超過213個(gè)國家爆發(fā)，全球甲型HlNl流感死亡病例已超過
1.77萬例。在我國，據(jù)中國疾病預(yù)防控制中心報(bào)道，截至2010年3月31日，全國31個(gè)省份累計(jì)報(bào)告甲型HlNl流感確診病例12.7萬余人，已治愈12.2萬，死亡800例。
[0003]流感病毒屬于正粘病毒科，有包膜，呈球型、橢圓型或絲狀，病毒包膜來自宿主細(xì)胞的雙層類脂膜。流感病毒屬單鏈的RNA病毒。根據(jù)核蛋白(NP)和細(xì)胞質(zhì)蛋白(Ml)的差異，流感病毒可分為A、B、C(甲、乙、丙)三種亞型。對(duì)A型流感病毒，根據(jù)血凝素(HA)和神經(jīng)氨酸酶(NA)表面糖蛋白抗原性的不同，又可進(jìn)一步分為不同的亞型。目前，A型流感病毒有16種HA亞型(H1-H16)和9種NA亞型(N1-N9)。
[0004]A型流感病毒的基因組由8個(gè)單獨(dú)的單鏈RNA片段組成(見圖1)，每個(gè)RNA片段編碼一至兩個(gè)蛋白。因此A型流感病毒共有8個(gè)基因，編碼10種蛋白。其中，HA蛋白對(duì)于結(jié)合細(xì)胞表面受體和病毒與細(xì)胞的膜融合起重要作用，在感染細(xì)胞前，HA會(huì)水解成HAl和HA2,其中位于HAl上的受體結(jié)合區(qū)(receptor binding domain, RBD)的附近區(qū)域,在不同流感病毒株中高度變異(RBD本身比較保守)，是重要的中和性表位所在區(qū)域，目前發(fā)現(xiàn)的多種中和性抗體所針對(duì)的表`位大多位于HAl蛋白的RBD附近區(qū)域。但是這些抗體大多不具備中和不同亞型或同一亞型不同毒株流感病毒的能力。NA可以去除唾液酸，幫助子代病毒的釋放和避免病毒自身的聚集；PA、PB1和PB2三種聚合酶以及NP核蛋白主要用于病毒RNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄；基質(zhì)蛋白Ml負(fù)責(zé)核外輸送，M2負(fù)責(zé)形成離子通道；非結(jié)構(gòu)蛋白NSl是干擾素的抑制劑，NS2負(fù)責(zé)核外輸送。
[0005]目前，國家許可用于治療流感的藥物主要為以下兩大類:1)烷胺類(金剛烷胺和金剛乙胺)；2)流感病毒神經(jīng)氨酸酶抑制劑(奧司他韋和扎那米韋)。對(duì)烷胺類藥物，已出現(xiàn)大量的耐藥性流感毒株，因此目前世界衛(wèi)生組織不建議使用烷胺類藥物作為治療流感的藥物；目前大部分流感病毒(包括甲型HlNl流感)仍對(duì)奧司他韋和扎那米韋敏感，但在日本等地區(qū)也已經(jīng)出現(xiàn)耐藥性毒株，耐藥性毒株的出現(xiàn)限制了這些化學(xué)小分子藥物的大規(guī)模使用。
[0006]治療性抗體用于流感的等病毒感染性疾病的治療早有報(bào)道，抗血清用于治療SARS和重癥H5N1禽流感病毒感染者的案例已經(jīng)證明了抗體在治療病毒感染中發(fā)揮的重要作用。具有廣譜中和活性的抗流感病毒的治療性抗體具有以下潛在優(yōu)勢(shì)，一方面它可以阻斷病毒與靶細(xì)胞的結(jié)合，另一方面通過補(bǔ)體和T細(xì)胞、NK細(xì)胞等效應(yīng)細(xì)胞的作用，將被病毒感染的細(xì)胞殺死。[0007]因此，本領(lǐng)域很有必要針對(duì)流感病毒開發(fā)親和性良好且副作用低的治療性抗體，如人源化或全人源的抗體，以滿足臨床治療的需求。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明的目的在于提供一種抗流感病毒廣譜中和性全人單克隆抗體及其應(yīng)用。
[0009]在本發(fā)明的一個(gè)方面，提供一種分離的結(jié)合分子，所述的結(jié)合分子識(shí)別(較佳地為特異性識(shí)別)流感病毒HA蛋白中HA2蛋白亞基序列第345-504位之間的表位。
[0010]在一個(gè)優(yōu)選例中，所述結(jié)合分子包含SEQ ID NO:8所示重鏈CDRl區(qū)、SEQ ID NO:9所示重鏈⑶R2和SEQ ID NO: 10所示重鏈⑶R3區(qū)；其能識(shí)別并結(jié)合流感血凝素蛋白(HA)的HA2亞基中的表位。
[0011]在另一優(yōu)選例中，所述結(jié)合分子包含SEQ ID NO: 14所示輕鏈⑶Rl區(qū)、SEQ IDNO: 15所示輕鏈⑶R2和SEQ ID NO: 16所示輕鏈⑶R3區(qū)；其能識(shí)別并結(jié)合流感血凝素蛋白(HA)的HA2亞基中的表位。
[0012]在另一優(yōu)選例中，所述結(jié)合分子包含以下的氨基酸序列:SEQ ID N0:8所示的重鏈CDRl，SEQ ID NO:9 所示的重鏈 CDR2 和 SEQ ID NO: 10 所示的重鏈 CDR3，SEQ ID NO: 14 所示的輕鏈CDR1、SEQ ID NO: 15所示的輕鏈CDR2和SEQ ID NO: 16所示的輕鏈CDR3 ;其能識(shí)別并結(jié)合流感血凝素蛋白(HA)的HA2亞基中的表位。
[0013]在另一優(yōu)選例中，所述的結(jié)合分子包含重鏈可變區(qū)，所述的重鏈可變區(qū)具有SEQID NO:2所示的氨基酸序列。`
[0014]在另一優(yōu)選例中，所述的結(jié)合分子包含輕鏈可變區(qū)，所述的輕鏈可變區(qū)具有SEQID NO:4所示的氨基酸序列。
[0015]在另一優(yōu)選例中，所述的結(jié)合分子包含重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，其重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)分別具有SEQ ID N0:2和SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。
[0016]在另一優(yōu)選例中，所述的結(jié)合分子包含抗體的重鏈恒定區(qū)和或輕鏈恒定區(qū)。
[0017]在另一優(yōu)選例中，所述的結(jié)合分子是Fab、F(ab’ )、F(ab’)2、Fv、dAb、Fd、互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)片段、單鏈抗體(scFv)、二價(jià)單鏈抗體、單鏈?zhǔn)删w抗體、雙特異雙鏈抗體、三鏈抗體、四鏈抗體。
[0018]優(yōu)選的，所述的結(jié)合分子是人單克隆抗體。
[0019]更優(yōu)選的，所述的人單克隆抗體其重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)分別具有SEQ IDN0:2和SEQ ID N0:4所示的氨基酸序列，其重鏈恒定區(qū)選擇下組中重鏈類型之一的恒定區(qū):IgGl, IgG2a、IgG2b和IgG3，和其輕鏈恒定區(qū)選擇下組輕鏈類型的恒定區(qū)之一:κ鏈和λ鏈。
[0020]更優(yōu)選的，所述的人單克隆抗體其重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)分別具有SEQID NO:2和SEQ ID Ν0:4所示的氨基酸序列，其重鏈恒定區(qū)和輕鏈恒定區(qū)分別具有Genebank號(hào)ACK87036和ACK87038所示的氨基酸序列。
[0021]在另一優(yōu)選例中，所述的單克隆抗體識(shí)別流感病毒HA蛋白上的線性表位。
[0022]在另一優(yōu)選例中，所述的單克隆抗體識(shí)別流感病毒HA蛋白中ΗΑ2蛋白亞基序列第345-504位之間的表位(序列及位數(shù)的計(jì)算基于GenBank登錄號(hào)ACP41105.1的ΗΑ2蛋白)。
[0023]在本發(fā)明的一個(gè)方面，提供編碼所述的結(jié)合分子的核酸分子。[0024]在本發(fā)明的一個(gè)方面，提供所述的結(jié)合分子在制備用于診斷、治療和/或預(yù)防流感病毒所致的流感感染的藥物中的用途。
[0025]在另一優(yōu)選例中，所述的流感病毒的毒株選自如下一組:H1亞型流感病毒(如H1N1)、H3亞型流感病毒(如H3N2)和H9亞型流感病毒(H9N2)。
[0026]在本發(fā)明的一個(gè)方面，提供一種表達(dá)載體，所述表達(dá)載體中含有編碼所述的結(jié)合分子的DNA。
[0027]在本發(fā)明的一個(gè)方面，提供一種宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞中含有所述的表達(dá)載體。
[0028]在本發(fā)明的一個(gè)方面，提供一種組合物，它含有有效量的所述的單克隆抗體，以及藥學(xué)上可接受的載體。
[0029]在本發(fā)明的一個(gè)方面，提供一種檢測(cè)流感病毒的試劑盒，其包括所述的結(jié)合分子。
[0030]在另一優(yōu)選例中，所述的試劑盒還包括:抗原或抗體包被用試劑，洗滌試劑，第二抗體，標(biāo)記物(如辣根過氧化物酶、堿性磷酸酯酶、葡萄糖氧化酶、β -D-半乳糖苷酶、脲酶、過氧化氫酶、或葡萄糖淀粉酶)，顯色劑酶底物等。
[0031]在本發(fā)明的一個(gè)方面，提供一種(優(yōu)選非治療性地)抑制流感病毒的方法，所述的方法包括給予患者有效量的所述的結(jié)合分子。
[0032]在本發(fā)明的一個(gè)方面，提供一種(優(yōu)選非診斷性地)檢測(cè)流感病毒的方法，利用所述的結(jié)合分子與待測(cè)樣 品進(jìn)行接觸，通過檢測(cè)所述的結(jié)合分子與受試樣品的結(jié)合情況，獲得流感病毒的存在情況以及存在量。
[0033]本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內(nèi)容，對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0034]圖1、A型流感病毒結(jié)構(gòu)示意圖。
[0035]圖2、β -actin內(nèi)參的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳結(jié)果。
[0036]圖3、重鏈基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳結(jié)果。
[0037]圖4、輕鏈基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳結(jié)果。
[0038]圖5、全人單克隆抗體(IEl)濃度。
[0039]圖6、全人單克隆抗體(IEl)對(duì)HA/HA1蛋白的識(shí)別能力鑒定。
[0040]圖7、全人單克隆抗體(IEl)識(shí)別HA2蛋白G345到P504肽段。
[0041]圖8、全人單克隆抗體(IEl)識(shí)別Hl亞型流感病毒的廣譜性。
[0042]圖9、全人單克隆抗體IEl的廣譜中和活性。A:A/Sichuan/l/2009 (HlNl) ；B:A/Jiangx1-Donghu/312/2006(H3N2) ；C:A/Guangzhou/333/99 (H9N2)。
[0043]圖10、載體AbVec-hlgG的質(zhì)粒圖譜。
[0044]圖11、AbVec-hlgKappa 的質(zhì)粒圖譜。
【具體實(shí)施方式】
[0045]本發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究，獲得一種含有獨(dú)特的互補(bǔ)決定區(qū)(⑶R區(qū))的抗流感病毒廣譜中和性的結(jié)合分子，優(yōu)選全人單克隆抗體，該結(jié)合分子對(duì)于流感病毒具有廣譜中和作用。在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。[0046]結(jié)合分子
[0047]本發(fā)明提供了能特異性結(jié)合流感病毒的結(jié)合分子。優(yōu)選地，所述結(jié)合分子是人結(jié)合分子。優(yōu)選地，本發(fā)明的結(jié)合分子呈現(xiàn)對(duì)于流感病毒的中和活性。
[0048]本發(fā)明的結(jié)合分子可以是完整的免疫球蛋白分子，所述結(jié)合分子可以是抗原結(jié)合片段，包括但不限于Fab、F(ab’ )、F(ab，) 2、Fv、dAb、Fd、互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)片段、單鏈抗體(scFv)、二價(jià)單鏈抗體、單鏈卩遼菌體抗體、雙特異雙鏈抗體、三鏈抗體、四鏈抗體以及至少含有足以賦予與禽流感病毒毒株的特異性抗原結(jié)合免疫球蛋白的片段的(多)肽或其片段。
[0049]本發(fā)明的結(jié)合分子也可以特異性結(jié)合流感病毒的一或多個(gè)片段。對(duì)于治療和/或預(yù)防流感病毒的方法而言，所述結(jié)合分子優(yōu)選能特異性結(jié)合流感病毒的表面可及蛋白質(zhì)。在特定的實(shí)施方案中，本發(fā)明的結(jié)合分子能特異性結(jié)合流感病毒的HA2分子。
[0050]本發(fā)明還提供了所述的結(jié)合分子在制備診斷、預(yù)防和/或治療流感病毒感染的藥物中的應(yīng)用。這種感染可以在小群體中發(fā)生，但是也可以以季節(jié)流行病方式在世界范圍傳播，或者更嚴(yán)重地在全球蔓延，數(shù)百萬個(gè)體處于危險(xiǎn)之中。本發(fā)明提供了可以中和導(dǎo)致這種季節(jié)流行病以及潛在的全球性流行病的流感病毒毒株的感染的結(jié)合分子。重要的是，目前可以預(yù)期利用本發(fā)明的結(jié)合分子對(duì)于多種流感病毒毒株起到防護(hù)和治療作用，因?yàn)榧航?jīng)揭示了由于與在不同流感病毒毒株的HA蛋白之間共享的表位的結(jié)合，因此目前可以使用本發(fā)明的結(jié)合分子在這些毒株之間進(jìn)行交叉中和作用。本發(fā)明的結(jié)合分子可以大規(guī)模地制備和貯存，因?yàn)槠涮峁┝酸槍?duì)不同的流行性毒株的保護(hù)作用，且對(duì)于為將來可能發(fā)生的流感爆發(fā)做準(zhǔn)備是有利的。
[0051]CDR區(qū)是免疫學(xué)感 興趣的蛋白質(zhì)的序列。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，結(jié)合分子可包含本文揭示的二、三、四、五或者所有六個(gè)CDR區(qū)。優(yōu)選地，本發(fā)明的結(jié)合分子包含本文揭示的至少兩個(gè)⑶R。
[0052]本發(fā)明的另一方面包括本文所述結(jié)合分子的功能變體。如果變體能與親代結(jié)合分子競爭特異性結(jié)合流感病毒或其蛋白片段，則認(rèn)為該變體分子是本發(fā)明結(jié)合分子的功能變體。換句話說，所述功能變體仍能結(jié)合流感病毒或其片段。優(yōu)選地，所述功能變體能競爭性特異性結(jié)合由親代結(jié)合分子特異性結(jié)合的至少兩(或更多個(gè))不同的流感病毒毒株或其片段。此外，如果某分子對(duì)于親代結(jié)合分子對(duì)其具有中和活性的流感病毒、優(yōu)選對(duì)于至少兩(或多個(gè))流感病毒毒株具有中和活性，則認(rèn)為該分子是本發(fā)明結(jié)合分子的功能變體。功能變體包括但不限于一級(jí)結(jié)構(gòu)序列基本相似、但是含有例如在親代結(jié)合分子中未發(fā)現(xiàn)的體外或體內(nèi)化學(xué)和/或生物化學(xué)修飾的衍生物。這種修飾包括乙酞化、酞化、核苷酸或者核苷酸衍生物的共價(jià)附著、脂質(zhì)或者脂質(zhì)衍生物的共價(jià)附著、交聯(lián)、二硫鍵形成、糖基化、羥基化、甲基化、氧化、聚乙二醇化、蛋白酶解加工、磷酸化等。換句話說，親代結(jié)合分子的氨基酸和/或核苷酸序列中的修飾不顯著影響或改變由所述核苷酸序列編碼的或者含有所述氨基酸序列的所述結(jié)合分子的結(jié)合特性，即所述結(jié)合分子仍能識(shí)別并結(jié)合其靶位。
[0053]所述功能變體可以具有保守序列修飾，包括核苷酸和氨基酸取代、添加和缺失。這些修飾可以通過本領(lǐng)域己知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)導(dǎo)入，例如定向誘變和隨機(jī)PCR介導(dǎo)的誘變，并且可包含天然以及非天然核苷酸和氨基酸。
[0054]保守氨基酸取代包括其中氨基酸殘基由具有相似結(jié)構(gòu)或者化學(xué)性質(zhì)的另一氨基酸殘基置換的取代。具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基的家族己經(jīng)在本領(lǐng)域中限定。這些家族包括具有堿性側(cè)鏈的氨基酸(例如賴氨酸、精氨酸、組氨酸)、酸性側(cè)鏈氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、無電荷極性側(cè)鏈氨基酸(例如天冬酞胺、谷氨酞胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半膚氨酸、色氨酸)、非極性側(cè)鏈氨基酸(例如甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、分支側(cè)鏈氨基酸(例如蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)以及芳香側(cè)鏈氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸)。本領(lǐng)域技術(shù)人員明白也可以使用除了上述家族之外的其它氨基酸殘基家族分類方式。另外，變體可具有非保守的氨基酸取代，例如氨基酸由具有不同結(jié)構(gòu)或者化學(xué)性質(zhì)的另一氨基酸殘基置換。相似的小變異也可包括氨基酸缺失或者插入，或者這二者。使用本領(lǐng)域熟知的計(jì)算機(jī)程序可以發(fā)現(xiàn)確定哪些氨基酸殘基可以被取代、插入或者缺失而不消除免疫學(xué)活性的指導(dǎo)。
[0055]此外，功能變體可包含氨基酸序列在氨基末端或者羧基末端或者這兩端的截短體。本發(fā)明的功能變體與親代結(jié)合分子相比可具有相同或不同的、更高或更低的結(jié)合親和性，但是仍能結(jié)合流感病毒或其片段。例如，本發(fā)明的功能變體與親代結(jié)合分子相比對(duì)于流感病毒HlNl或其片段可具有增加或降低的結(jié)合親和性。優(yōu)選地，可變區(qū)包括但不限于構(gòu)架區(qū)、高變區(qū)或CDR區(qū)的氨基酸序列被修飾。通常，輕鏈和重鏈可變區(qū)包含三個(gè)高變區(qū)，包括三個(gè)CDR，以及更保守的區(qū)域，即所謂的構(gòu)架區(qū)((FR)。高變區(qū)包含來自CDR的氨基酸殘基和來自高變環(huán)的氨基酸殘基。在本發(fā)明范圍內(nèi)的功能變體與本文所述親代結(jié)合分子具有至少大約50%至大約99%、優(yōu)選至少大約60%至大約99%、更優(yōu)選至少大約70%至大約99%、甚至更優(yōu)選至少大約80%至大約99%、最優(yōu)選至少大約90%至大約99%、特別是至少大約95%至大約99%，以及特別是至少大約97%至大約99%的氨基酸序列同源性。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的計(jì)算機(jī)算法如Gap或者Bestfit可用于最佳地排列氨基酸序列以進(jìn)行對(duì)比以及明確相似或相同的氨基酸殘基。功能變體可以通過使用本領(lǐng)域己知的普通分子生物學(xué)方法改變親代結(jié)合分子或其一部分而獲得，所述方法包括但不限于易錯(cuò)PCR、寡核苷酸指導(dǎo)的誘變、定點(diǎn)誘變以及重鏈和/或輕鏈改組法。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的功能變體對(duì)于流感病毒具有中和活性。所述中和活性與親代結(jié)合分子相比可以相同或者更高或更低。此后，當(dāng)使用術(shù)語(人)結(jié)合分子時(shí)，其也涵蓋所述(人)結(jié)合分子的功能變體。
[0056]作為本發(fā)明的優(yōu) 選方式，所述的結(jié)合分子是單克隆抗體，優(yōu)選它包括人源的恒定區(qū)(如人源恒定區(qū)IgH序列和IgKappa序列)。所述的抗流感病毒單克隆抗體的重鏈可變區(qū)、輕鏈可變區(qū)以及位于重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)均具有獨(dú)特的不同于現(xiàn)有技術(shù)的結(jié)構(gòu)，且它們是全人源的。
[0057]本發(fā)明包括:具有所述單克隆抗體的相應(yīng)氨基酸序列的單克隆抗體，具有所述單克隆抗體可變區(qū)鏈的單克隆抗體。本發(fā)明還包括具有含所述的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)的輕鏈和重鏈的任何抗體，以及⑶R區(qū)與本發(fā)明的單克隆抗體的⑶R具有90%以上(較佳地95%以上)的同源性的任何抗體。
[0058]抗體的抗原結(jié)合特性可由位于重鏈和輕鏈可變區(qū)的3個(gè)特定的區(qū)域來描述，稱為互補(bǔ)決定區(qū)(complementarity determining region,CDR),所述的CDR區(qū)將可變區(qū)間隔成
4個(gè)框架區(qū)域(FR)，4個(gè)FR的氨基酸序列相對(duì)比較保守，不直接參與結(jié)合反應(yīng)。這些CDR形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)，通過其間的FR形成的β折疊在空間結(jié)構(gòu)上相互靠近，重鏈上的⑶R和相應(yīng)輕鏈上的CDR構(gòu)成了抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)。可以通過比較同類型的抗體的氨基酸序列來確定是哪些氨基酸構(gòu)成了 FR或⑶R區(qū)域。[0059]對(duì)于本發(fā)明的單克隆抗體重鏈和輕鏈序列，可以用常規(guī)方法測(cè)定。
[0060]經(jīng)驗(yàn)證，本發(fā)明的抗流感病毒單克隆抗體的CDR區(qū)是全新的，其針對(duì)的是一個(gè)獨(dú)特的流感病毒HA蛋白上的抗原表位，技術(shù)構(gòu)思不同于現(xiàn)有的抗流感病毒抗體。本發(fā)明的抗流感病毒單克隆抗體所識(shí)別的表位為線性表位；更佳地所述的單克隆抗體識(shí)別流感病毒HA蛋白中HA2蛋白亞基序列第345-504位之間的表位。
[0061]本發(fā)明的單克隆抗體是全人源的，其重鏈、輕鏈可變區(qū)以及恒定區(qū)均來源于人抗體。因此，其在具有特別優(yōu)異的識(shí)別和中和流感病毒的作用的同時(shí)，還具有免疫原性低、安全性高的特點(diǎn)。
[0062]在本發(fā)明的實(shí)施例中，本發(fā)明從接種2009年甲型HlNl流感病毒裂解疫苗(2009/Cal)志愿者體內(nèi)獲得外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)，使用⑶197lgG+/HA為特異性標(biāo)志物，經(jīng)流式細(xì)胞儀分選(FACS)獲得識(shí)別HA蛋白特異性B細(xì)胞。使用文獻(xiàn)已報(bào)道的單細(xì)胞RT-PCR 技術(shù)(Journal of Immunological Methods 329 (2008) 112-124)，獲得了抗體基因并在293T細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)獲得全人單克隆抗體1E1。ELISA表位分析得知這株抗體識(shí)別血凝素HA蛋白的HA2亞基，HA2在不同種屬流感病毒中具有保守性，表明這株抗體可能的識(shí)別廣譜性。微中和實(shí)驗(yàn)證明此抗體能夠中和A/Sichuan/1/2009 (HlNl)，A/Jiangx1-Donghu/312/2006 (H3N2), A/Guangzhou/333/99 (H9N2)流感病毒，表明此株抗體具有廣譜中和活性，在臨床上具有預(yù)防和治療多種亞型流感病毒感染的潛在價(jià)值。
[0063]另一方面，本發(fā)明包括免疫綴合物，即包含本文所述至少一個(gè)結(jié)合分子以及進(jìn)一步包含至少一個(gè)標(biāo)記如可檢測(cè)的部分/物質(zhì)的分子。本發(fā)明還涉及本發(fā)明免疫綴合物的混合物或者至少一種本發(fā)明免疫綴合物與另一分子的混合物，所述另一分子如治療劑或者另一結(jié)合分子或免疫綴合物。本發(fā)明的免疫綴合物可包含一個(gè)以上的標(biāo)記。這些標(biāo)記可以彼此相同或不同，并且可以與結(jié)合分子非共價(jià)地結(jié)合/綴合。所述標(biāo)記也可以通過共價(jià)鍵與人結(jié)合分子直接結(jié)合/綴合。或者，所述標(biāo)記可以通過一或多種連接化合物與所述結(jié)合分子結(jié)合/綴合。標(biāo)記與結(jié)合分子`的綴合技術(shù)為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。
[0064]本發(fā)明的免疫綴合物的標(biāo)記可以是治療劑，但是它們也可以是可檢測(cè)的部分/物質(zhì)。適于治療和/或預(yù)防的標(biāo)記可以是毒素或者其功能部分、抗生素、酶、增強(qiáng)吞噬作用或者免疫刺激作用的其它結(jié)合分子。包含可檢測(cè)物質(zhì)的免疫綴合物可診斷性地用于例如評(píng)定對(duì)象是否己經(jīng)感染流感病毒毒株或者作為臨床實(shí)驗(yàn)程序的一部分監(jiān)測(cè)流感病毒感染的發(fā)生或進(jìn)展以例如確定指定治療方案的功效。然而，它們也可以用于其它檢測(cè)和/或分析和/或診斷目的。可檢測(cè)的部分/物質(zhì)包括但不限于酶、輔基、熒光材料、發(fā)光材料，生物發(fā)光材料、放射性材料、正電子發(fā)射金屬以及非放射性順磁性金屬離子。為了檢測(cè)和/或分析和/或診斷目的用于標(biāo)記結(jié)合分子的標(biāo)記依賴于使用的特定檢測(cè)/分析/診斷技術(shù)和/或方法例如免疫組織化學(xué)染色(組織)樣品、流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)、激光掃描細(xì)胞計(jì)量術(shù)檢測(cè)、熒光免疫測(cè)定、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)、放射免疫測(cè)定(RIA)、生物測(cè)定(例如吞噬作用測(cè)定)、蛋白質(zhì)印跡應(yīng)用等。對(duì)于本領(lǐng)域已知的檢測(cè)/分析/診斷技術(shù)和/或方法合適的標(biāo)記為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。
[0065]此外，本發(fā)明的人結(jié)合分子或者免疫綴合物也可以附著于固體支持物上，其特別用于流感病毒HA蛋白或其片段的體外免疫測(cè)定或者純化。這種固體支持物可以是多孔或者無孔的、平面或非平面的。本發(fā)明的結(jié)合分子可以與標(biāo)記序列如膚融合以便于純化。所述標(biāo)記序列的例子包括但不限于六組氨酸標(biāo)記、血凝素(HA)標(biāo)記、myc標(biāo)記或者flag標(biāo)記。或者，一種抗體可以與另一種抗體綴合形成抗體異源綴合物(heteroconjugate)。
[0066]另一方面，本發(fā)明的結(jié)合分子可以與一或多個(gè)抗原綴合/附著。優(yōu)選地，這些抗原是由給予了結(jié)合分子-抗原綴合物的對(duì)象的免疫系統(tǒng)識(shí)別的抗原。所述抗原可以彼此相同，但也可以是不同的。使附著抗原和結(jié)合分子的綴合方法為本領(lǐng)域所熟知，包括但不限于使用交聯(lián)劑。本發(fā)明的結(jié)合分子結(jié)合流感病毒并且附著于結(jié)合分子的抗原將引發(fā)對(duì)于所述綴合物的有力T細(xì)胞攻擊，最終導(dǎo)致流感病毒的破壞。
[0067]除了通過直接或間接(例如通過接頭)綴合而化學(xué)產(chǎn)生免疫綴合物之外，所述免疫綴合物可以作為融合蛋白而產(chǎn)生，所述融合蛋白包含本發(fā)明的結(jié)合分子及合適的標(biāo)記。融合蛋白可以通過本領(lǐng)域已知方法產(chǎn)生，例如通過構(gòu)建核酸分子以及隨后表達(dá)所述核酸分子而重組產(chǎn)生，所述核酸分子包含符合讀框的編碼結(jié)合分子的核苷酸序列以及編碼合適標(biāo)記的核苷酸序列。
[0068]本發(fā)明另一方面提供了編碼本發(fā)明的至少一種結(jié)合分子、其功能變體或者免疫綴合物的核酸分子。這種核酸分子可以用作中間物以進(jìn)行克隆，例如用于如上述的親和力成熟方法中。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述核酸分子是分離或純化的。DNA分子的序列可以用常規(guī)技術(shù)，或利用雜交瘤技術(shù)獲得。
[0069]本領(lǐng)域技術(shù)人員將意識(shí)到這些核酸分子的功能變體也是本發(fā)明的一部分。功能變體是這樣的核酸序列，通過使用標(biāo)準(zhǔn)遺傳密碼可以將其直接翻譯以提供與從親代核酸分子中翻譯的序列相同的氨基酸序列。
[0070]一旦獲得了有關(guān)的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關(guān)序列。這通常是將其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細(xì)胞，然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細(xì)胞中分離得到有關(guān)序列。[0071 ] 此外，還可用人工合成的方法來合成有關(guān)序列，尤其是片段長度較短時(shí)。通常，通過先合成多個(gè)小片段，然后再進(jìn)行連接可獲得序列很長的片段。
[0072]目前，已經(jīng)可以完全通過化學(xué)合成來得到編碼本發(fā)明的結(jié)合分子(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可將該DNA序列引入本領(lǐng)域中已知的各種現(xiàn)有的DNA分子(或如載體)和細(xì)胞中。此外，還可通過化學(xué)合成將突變引入本發(fā)明的結(jié)合分子的序列中。
[0073]本發(fā)明還涉及包含上述的適當(dāng)DNA序列以及適當(dāng)啟動(dòng)子或者控制序列的載體。這些載體可以用于轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞，以使其能夠表達(dá)蛋白質(zhì)。優(yōu)選的，本發(fā)明的載體是例如含病毒啟動(dòng)子的質(zhì)粒表達(dá)載體，且在所述表達(dá)載體中分別插入了抗流感病毒單克隆抗體重鏈可變區(qū)(VH)與恒定區(qū)的IgH (來自人源IgH的恒定區(qū))融合序列和輕鏈可變區(qū)VL與人體Igkappa(來自人源Igkappa的恒定區(qū))融合序列。
[0074]宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞，如細(xì)菌細(xì)胞；或是低等真核細(xì)胞，如酵母細(xì)胞；或是高等真核細(xì)胞，如哺乳動(dòng)物細(xì)胞。代表性例子有:細(xì)菌細(xì)胞如大腸桿菌，鏈霉菌屬；鼠傷寒沙門氏菌；真菌細(xì)胞如酵母；植物細(xì)胞；昆蟲細(xì)胞如果蠅S2或Sf9 ;動(dòng)物細(xì)胞如CH0、C0S7、NS0或Bowes黑素瘤細(xì)胞等。特別適用于本發(fā)明的宿主細(xì)胞是真核宿主細(xì)胞，尤其是哺乳動(dòng)物細(xì)胞，如293細(xì)胞。
[0075]用重組DNA轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)技術(shù)進(jìn)行。當(dāng)宿主為原核生物如大腸桿菌時(shí)，能吸收DNA的感受態(tài)細(xì)胞可在指數(shù)生長期后收獲，用CaCl2法處理，所用的步驟在本領(lǐng)域眾所周知。另一種方法是使用MgCl2。如果需要，轉(zhuǎn)化也可用電穿孔的方法進(jìn)行。當(dāng)宿主是真核生物，可選用如下的DNA轉(zhuǎn)染方法:磷酸鈣共沉淀法，或常規(guī)機(jī)械方法如顯微注射、電穿孔、脂質(zhì)體包裝等。
[0076]獲得的轉(zhuǎn)化子可以用常規(guī)方法培養(yǎng)，表達(dá)本發(fā)明的結(jié)合分子。根據(jù)所用的宿主細(xì)胞，培養(yǎng)中所用的培養(yǎng)基可選自各種常規(guī)培養(yǎng)基。在適于宿主細(xì)胞生長的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)宿主細(xì)胞生長到適當(dāng)?shù)募?xì)胞密度后，用合適的方法(如溫度轉(zhuǎn)換或化學(xué)誘導(dǎo))誘導(dǎo)選擇的啟動(dòng)子，將細(xì)胞再培養(yǎng)一段時(shí)間。
[0077]本發(fā)明的結(jié)合分子優(yōu)選的是采用哺乳動(dòng)物細(xì)胞來生產(chǎn)，哺乳動(dòng)物細(xì)胞通常需要在含血清的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。需要對(duì)細(xì)胞進(jìn)行無血清的適應(yīng)過程后，方可讓細(xì)胞在無血清培養(yǎng)基中正常的生長。
[0078]如果需要，可利用其物理的、化學(xué)的和其它特性通過各種分離方法分離和純化重組的蛋白。這些方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。這些方法的例子包括但并不限于:常規(guī)的復(fù)性處理、用蛋白沉淀劑處理(鹽析方法)、離心、滲透破菌、超聲處理、超離心、分子篩層析(凝膠過濾)、吸附層析、離子交換層析、高效液相層析(HPLC)和其它各種液相層析技術(shù)及這些方法的結(jié)合。
[0079]本發(fā)明的結(jié)合分子也可以在轉(zhuǎn)基因非人哺乳動(dòng)物如兔、山羊或者牛中產(chǎn)生，并且分泌進(jìn)例如其乳中。
[0080]藥物組合物
[0081 ] 本發(fā)明的結(jié)合分子可用于制備抑制流感病毒的組合物。
[0082]基于本發(fā)明的新發(fā)現(xiàn)，還提供了一種可抑制流感病毒或流感病毒感染相關(guān)疾病的組合物，其包含:有效 量的本發(fā)明所述的結(jié)合分子；以及藥學(xué)上可接受的載體。
[0083]本文所用的術(shù)語“藥學(xué)上可接受的”是指當(dāng)分子本體和組合物適當(dāng)?shù)亟o予動(dòng)物或人時(shí)，它們不會(huì)產(chǎn)生不利的、過敏的或其它不良反應(yīng)。本文所用的“藥學(xué)上可接受的載體”應(yīng)當(dāng)與本發(fā)明的結(jié)合分子相容，即能與其共混而不會(huì)在通常情況下大幅度降低組合物的效果O
[0084]可作為藥學(xué)上可接受的載體或其組分的一些物質(zhì)的具體例子是糖類，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，如玉米淀粉和土豆淀粉；纖維素及其衍生物，如羧甲基纖維素鈉、乙基纖維素和甲基纖維素；西黃蓍膠粉末；麥芽；明膠；滑石；固體潤滑劑，如硬脂酸和硬脂酸鎂；硫酸鈣；植物油，如花生油、棉籽油、芝麻油、橄欖油、玉米油和可可油；多元醇，如丙二醇、甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇；海藻酸；乳化劑，如Tween?;潤濕劑，如月桂基硫酸鈉；著色劑；調(diào)味劑；壓片劑、穩(wěn)定劑；抗氧化劑；防腐劑；無熱原水；等滲鹽溶液；和磷酸鹽緩沖液等。
[0085]本發(fā)明的組合物可根據(jù)需要制成各種劑型，并可由醫(yī)師根據(jù)患者種類、年齡、體重和大致疾病狀況、給藥方式等因素確定對(duì)病人有益的劑量進(jìn)行施用。給藥方式例如可以采用注射或其它治療方式。
[0086]本發(fā)明的結(jié)合分子可以以未分離的或者分離的形式使用。此外，本發(fā)明的結(jié)合分子可以單獨(dú)應(yīng)用或者于包含至少一種本發(fā)明的結(jié)合分子(或其變體或片段)的混合物中應(yīng)用。換句話說，所述結(jié)合分子可以組合應(yīng)用，例如作為包含兩或更多種本發(fā)明的結(jié)合分子、其變體或片段的藥物組合物。例如，具有不同但互補(bǔ)活性的結(jié)合分子可以組合在一個(gè)治療方案中以達(dá)到希望的預(yù)防、治療或診斷作用，但是或者也可以將具有相同活性的結(jié)合分子組合在一個(gè)治療方案中以達(dá)到希望的預(yù)防、治療或診斷作用。任選地，所述混合物進(jìn)一步包含至少一種其它治療劑。優(yōu)選地，所述治療劑如MZ抑制劑(例如amantidine、金剛乙胺(rimantadine))和/或神經(jīng)氨酸酶抑制劑(例如扎那米韋((zanamivir)、奧司他韋(oseltamivir))可用于預(yù)防和/或治療流感病毒感染。
[0087]所述藥物組合物可包含兩或多個(gè)對(duì)于流感病毒具有中和活性的結(jié)合分子。在一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)組合應(yīng)用時(shí)，所述結(jié)合分子呈現(xiàn)協(xié)同中和活性。換句話說，所述組合物包含至少兩種具有中和活性的結(jié)合分子，特征在于所述結(jié)合分子在中和流感病毒中起協(xié)同作用。如本文所用，術(shù)語“協(xié)同”是指當(dāng)組合應(yīng)用時(shí)，結(jié)合分子的組合作用高于單獨(dú)應(yīng)用時(shí)的加合作用。所述協(xié)同作用的結(jié)合分子可以結(jié)合流感病毒的相同或不同片段上的不同結(jié)構(gòu)。計(jì)算協(xié)同作用的方式是通過組合指數(shù)計(jì)算。組合指數(shù)(Cl)的概念己經(jīng)由Chou andTalalay(1984)描述。
[0088]本發(fā)明的結(jié)合分子或藥物組合在用于人體之前可以在合適的動(dòng)物模型系統(tǒng)中檢測(cè)。這種動(dòng)物模型系統(tǒng)包括但不限于小鼠、雪貂(ferret)和猴。感病毒流感病毒中也可以協(xié)同作用。
[0089]可以調(diào)整給藥方案以提供最佳的所需應(yīng)答(例如治療應(yīng)答)。合適的劑量范圍可例如是0.01-lOOmg/kg體重,優(yōu)選0.l_15mg/kg體重。此外,例如可以給予一次推注、隨時(shí)間給予多次分開劑量或者根據(jù)治療情況的緊急性而可以按比例降低或增加劑量。本發(fā)明的分子和組合物優(yōu)選是無菌的。使得這些分子和組合物無菌的方法為本領(lǐng)域所熟知。用于診斷、預(yù)防和/或治療的其它分子可以以與本發(fā)明的結(jié)合分子相似的給藥方案給予。如果單獨(dú)給予其它分子，則可以在給予本發(fā)明的一或多種人結(jié)合分子或藥物組合物之前、同時(shí)或者之后給予患者。對(duì)于人患者的精確給藥方案通常在臨床實(shí)驗(yàn)期間挑選出。
[0090]檢測(cè)試劑和試劑盒
[0091]本發(fā)明的結(jié)合分子可用于制備檢測(cè)流感病毒的試劑或試劑盒。
[0092]如本文所用，術(shù)語“待測(cè)樣品”涵蓋了多種樣品類型，包括生物學(xué)來源的血液及其它體液樣品，實(shí)體組織樣品如活檢組織樣品或者組織培養(yǎng)物，或者衍生自其中的細(xì)胞或者其后代。該術(shù)語還包括在獲得后已經(jīng)通過任何方式處理的樣品，例如用試劑處理、溶解、或者富集某些成分如蛋白質(zhì)或者多核苷酸。該術(shù)語涵蓋了得自任何物種的各種臨床樣品，也包括培養(yǎng)的細(xì)胞、細(xì)胞上清和細(xì)胞溶解產(chǎn)物。
[0093]以所述的結(jié)合分子為基礎(chǔ)，可制備方便、快速且準(zhǔn)確地檢測(cè)流感病毒(如甲型流感病毒；更特別地如甲型HlNl、H3N2、H9N2病毒)的試劑盒。
[0094]因此，本發(fā)明提供了一種用于檢測(cè)樣品中是否存在流感病毒的檢測(cè)試劑盒，該試劑盒中含有本發(fā)明的抗流感病毒的結(jié)合分子。
[0095]在獲得了本發(fā)明提供的結(jié)合分子后，可以方便地制備出用于特異性檢測(cè)流感病毒的檢測(cè)試劑盒。
[0096]作為本發(fā)明的一種檢測(cè)方式，采用間接ELISA法，將待測(cè)的抗原包被于固相載體上，利用本發(fā)明的結(jié)合分子進(jìn)行檢測(cè)。
[0097]作為本發(fā)明的一種優(yōu)選方式，所述的結(jié)合分子是抗體，可根據(jù)雙抗夾心法的原理來檢測(cè)。雙抗夾心法常規(guī)的做法是將一抗(如本發(fā)明的單克隆抗體)固定于載體，然后使一抗與抗原反應(yīng)，洗滌后再與二抗反應(yīng)(所述的二抗攜帶可檢測(cè)信號(hào)，或可與攜帶可檢測(cè)信號(hào)的物質(zhì)結(jié)合)，最后進(jìn)行化學(xué)發(fā)光或酶聯(lián)顯色反應(yīng)檢測(cè)信號(hào)。雙抗夾心法特別適用于具有兩個(gè)或兩個(gè)以上表位的抗原的檢測(cè)。
[0098]為了在檢測(cè)時(shí)更方便，所述試劑盒中除了含有本發(fā)明的結(jié)合分子以外，還可以包含其它檢測(cè)試劑或輔助試劑，所述的輔助試劑例如是ELISA試劑盒中常規(guī)使用的一些試劑，這些試劑的特性以及它們的配制方法均是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，如顯色劑、標(biāo)記物、二抗、抗抗體、增敏劑等。本領(lǐng)域人員應(yīng)理解，各種變化形式的檢測(cè)試劑盒均是包含在本發(fā)明中的，只要在其中利用了本發(fā)明的結(jié)合分子作為識(shí)別流感病毒的試劑。
[0099]此外，在所述試劑盒中還可包含使用說明書，用于說明其中裝載的試劑的使用方法。
[0100]在獲得了本發(fā)明提供的結(jié)合分子和/或試劑盒后，可以利用多種免疫學(xué)相關(guān)方法來檢測(cè)樣品中HA蛋白或其含量，從而得知待測(cè)樣品的供體是否感染流感病毒，這些方法均被包含在本發(fā)明中。較佳地，所述的方法是以非疾病診斷為目的的。
[0101]作為一種優(yōu)選方式，本發(fā)明提供一種體外(非診斷或治療性地)檢測(cè)流感病毒的方法，包括以下步驟:
[0102](al)將待測(cè)樣品包被于固相載體；
[0103](a2)將本發(fā)明的結(jié)合分子加樣于(al)的固相載體，從而使待測(cè)樣品中的流感病毒與結(jié)合分子結(jié)合，形成帶有“流感病毒-本發(fā)明的結(jié)合分子” 二元復(fù)合物的固相載體；
[0104](a3)將特異性結(jié)合本發(fā)明的結(jié)合分子的檢測(cè)物加樣于(a2)的固相載體，形成帶有“流感病毒-本發(fā)明的結(jié)合分子-檢測(cè)物”三元復(fù)合物的固相載體；所述的檢測(cè)物上攜帶一標(biāo)記物；
[0105](a4)檢測(cè)三元復(fù)合`物中的標(biāo)記物，確定待檢測(cè)樣品中流感病毒的存在與否以或存在的量。
[0106]按照上述方法，只要設(shè)置已知濃度的抗原對(duì)照，制作濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過比照濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線就可以得出待測(cè)樣品中的流感病毒含量。
[0107]本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)在于:
[0108](I)提供了一種具有全新的結(jié)合分子，其是全人源的，與其它動(dòng)物源性(如鼠源性)抗流感病毒的分子相比，免疫原性大大減少，且親和性良好。不僅治療效果好，而且副作用低。
[0109](2)本發(fā)明的結(jié)合分子能夠結(jié)合具有天然構(gòu)象的流感病毒血凝素蛋白(HA)的HA2亞基，能夠阻止多種亞型流感病毒侵染易感細(xì)胞。
[0110]下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如J.薩姆布魯克等編著，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南，科學(xué)出版社中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
[0111]1.材料和方法
[0112]以下說明本發(fā)明即一株能夠中和多種流感病毒廣譜中和性全人單克隆抗體制備以及抗體特性分析過程。分為兩部分:
[0113](I)單細(xì)胞RT-PCR法獲得抗體基因以及抗體表達(dá)；
[0114](2)抗體特性分析。[0115]具體過程如下:
[0116]1、外周血單核細(xì)胞(PBMC)的獲得
[0117]從根據(jù)血凝抑制實(shí)驗(yàn)篩選的志愿者體內(nèi)抽取外周血，采用常規(guī)Ficoll-Paque密度梯度離心，得到IO7以上個(gè)外周血單核細(xì)胞(PBMC)。
[0118]2、HA特異性記憶B細(xì)胞分選
[0119]使用FITC-CD19/APC-1gG/Cy3-HA(FITC-CD19/APC-1gG 購自 BD，Cy3-HA 制備方法為:由桿狀病毒昆蟲細(xì)胞蛋白表達(dá)系統(tǒng)(Invitrogen)表達(dá)制備HA蛋白，并用生物素蛋白標(biāo)記試劑盒(Thermo Scientific)標(biāo)記后,和Cy3_鏈霉親和素(Sigma)偶聯(lián))為標(biāo)志物,經(jīng)流式細(xì)胞儀獲得特異性B細(xì)胞至96孔R(shí)T-PCR板，每孔一個(gè)細(xì)胞，獲得HA特異性記憶B細(xì)胞。
[0120]3、抗體基因
[0121]使用RT-PCR和Nested-PCR技術(shù)，獲得抗體基因(參見NatProtoc.2009; 4 (3): 372-84)。連接 pGEM_T Easy (Promega)載體,進(jìn)行測(cè)序,常規(guī)方法驗(yàn)證抗體基因。如文獻(xiàn)Kenneth Smith et al.Rapid generation of fully human monoclonalantibodies specific to a vaccinating antige.Nat Protoc.2009; 4 (3): 372-384所述構(gòu)建載體AbVec-hlgG和AbVec-hlgKappa,載體圖譜分別如圖10和11，序列分別為genebank號(hào)FJ475055和FJ475056所述，其中分別包含編碼人IgGl重鏈和輕鏈恒定區(qū)的堿基序列，編碼人IgGl重鏈和輕鏈恒定區(qū)的氨基酸序列為Genebank號(hào)ACK87036和ACK87038所述。然后將重、輕鏈基因分別連接表達(dá)載體AbVec-hlgG(插入位點(diǎn)為AgeI和Sail)和AbVec-hlgKappa (插入位點(diǎn)為 AgeI 和 BsiwI)。
[0122]4、抗體表達(dá)
[0123]脂質(zhì)體法瞬時(shí)轉(zhuǎn)染 293T細(xì)胞，進(jìn)行全人抗體表達(dá)。
[0124]I)在轉(zhuǎn)染前I天將1.0X IO6細(xì)胞接種到6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中；
[0125]2)A 管:500μ1 Opt1-MEM(Invitrogen) +4 μ g IgG+4 μ g IgL
[0126]3)Β 管:500μ1 0pt1-MEM+20 μ I Lipofectamine Reagent (Invitrogen)
[0127]4)靜置5分鐘后,將A管與B管混合,在室溫靜置20min ；
[0128]5) A、B管混合物加入細(xì)胞培養(yǎng)盤中，37°C孵育6h ；
[0129]6) 6h 后，吸除含有 Lipofectamine Reagent 的培養(yǎng)液，每孔加入 2mlFreeStyle?293Expression Medium(Invitrogen)；
[0130]7) 72h后，收集含全人抗體的細(xì)胞上清，4°C，3000rpm, 5min,保存?zhèn)溆谩?br> [0131]5、抗體濃度測(cè)定
[0132]ELISA方法測(cè)定全人抗體濃度。
[0133]I)包被 Goat Ant1-Human IgG (Fab Specific)Antibody (購自 Sigma)于 ELISA板，10 μ g/ml,每孔 100 μ 1,4°C過夜；
[0134]2) PBST 洗板，3 次；
[0135]3)封閉:18/111185八，每孔20(^ l，37°C，2h ；
[0136]4) PBST 洗板，3 次；
[0137]5)使用倍比稀釋的人IgG(購自Sigma)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線,濃度400ng/ml、200ng/ml、100ng/ml、50ng/ml、25ng/ml、12.5ng/ml、6.25ng/ml、0ng/ml, 100 μ I/ 孔；前述制備的全人抗體細(xì)胞上清稀釋5000倍，每孔ΙΟΟμ l，37°C，2h ；[0138]6) PBST 洗板，3 次；
[0139]7)加入 Goat Ant1-Human IgG (Fe specific)-Peroxidase antibody (購自Sigma), 1:10000 稀釋，每孔 ΙΟΟμ l，37°C，lh ；
[0140]8) PBST 洗板，3 次；
[0141]9)TMB 底物(購自 Sigma)，每孔 ΙΟΟμ l，37°C，15min，避光反應(yīng)；
[0142]10)加入 2M H2SO4,每孔 50 μ I ；
[0143]11)測(cè)定0D450，并進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。
[0144]6、抗原特異性檢測(cè)
[0145]檢測(cè)表達(dá)的全人抗體是否識(shí)別HA蛋白、HAl蛋白、2009甲型HlNl流感病毒疫苗裂解液(2009/Cal)和 2008-2009 季節(jié)流感病毒疫苗裂解液(A/Brisbane/59/2007 (HlNl))。ELISA進(jìn)行檢測(cè)，分別包被HA-His (桿狀病毒昆蟲細(xì)胞蛋白表達(dá)系統(tǒng)(Invitrogen)表達(dá))、IOO0C 5分鐘熱變性HA-His、HAl-Fc (桿狀病毒昆蟲細(xì)胞蛋白表達(dá)系統(tǒng)(Invitrogen)表達(dá)),2009甲型HlNl流感疫苗裂解液(2009/Cal)(購自華蘭生物)和2008-2009季節(jié)流感疫苗裂解液(A/Brisbane/59/2007 (HlNl))(購自華蘭生物)。
[0146]I)分別包被HA-HiS、熱變性HA-His、HAl-Fc、2009甲型HlNl流感疫苗裂解液(2009/Cal)和 2008-2009 季節(jié)流感疫苗裂解液(A/Brisbane/59/2007 (HlNl))于 ELISA板，
10μ g/ml,每個(gè)樣品兩個(gè)復(fù)孔，每孔100 μ 1,4 C過夜；
[0147]2) PBST 洗板，3 次；
[0148]3)封閉:1%BSA，每孔 200μ l，37°C，2h ;
[0149]4) PBST 洗板，3 次；
[0150]5)根據(jù)測(cè)定濃度，調(diào)整本發(fā)明全人抗體至300μ g/ml，每孔100μ 1，鼠源單克隆抗體S-95-7(識(shí)別位于HAl上的構(gòu)象依賴表位，其保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)CCTCC NO:C201024)為陽性對(duì)照，37°C，2h ；
[0151]6) PBST 洗板，3 次；
[0152]7)Goat Ant1-Human IgG (Fe specific)-Peroxidase antibody,1: 10000稀釋，每孔100μ 1，加到HA-His、熱變性HA-His、2009甲型HlNl流感病毒疫苗裂解液和2008-2009季節(jié)流感病毒疫苗裂解液ELISA板；GoatAnt1-Human IgG (Fabspecific) -Peroxidase antibody, 1: 10000 稀釋，每孔 100 μ I,加到 HAl-Fc ELISA 板,37°C, Ih ；
[0153]8) PBST 洗板，3 次；
[0154]9) TMB 底物(購自 Sigma)，每孔 100μ l，37°C，15min，避光反應(yīng)；
[0155]10)加入 2M H2SO4,每孔 50 μ I ；
[0156]11)測(cè)定0D450，并進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。
[0157]7、抗體中和活性測(cè)定
[0158](I)微中和試驗(yàn)
[0159]DMDCK細(xì)胞(購自ATCC)鋪至96孔板，DMEM+10% (v/v) FBS培液培養(yǎng)，12h后生長至90%，備用。
[0160]2) 96孔板，抗體用DMEM+0.2%BSA 2 X梯度稀釋，終體積50 μ I/孔。
[0161]3)每孔加入50 μ I含100個(gè)TCID5tl病毒(預(yù)先用DMEM+0.2%BSA稀釋至100TCID50/50 μ I)。病毒為:A/Sichuan/l/2009 (HlNl)，A/Jiangx1-Donghu/312/2006 (H3N2)或 A/Guangzhou/333/99(H9N2)。
[0162]4)每塊板還包括對(duì)照:
[0163]病毒對(duì)照(PC，不加抗體)——50 μ I DMEM 0.2%BSA+50 μ I病毒(病毒種類如4)所列)；
[0164]MDCK 細(xì)胞對(duì)照(NC)-100 μ I DMEM 0.2%BSA ；
[0165]5) 37 °C 5%(v/v)C02，lh，使抗體與病毒充分作用。
[0166]6) MDCK 單層細(xì)胞吸去培液，PBS 洗兩遍，加 100 μ I DMEM+0.2%BSA+2 μ g/mlTPCK-trypsin。
[0167]7)將抗體-病毒孵育混合物100 μ I全部對(duì)應(yīng)移至MDCK細(xì)胞平板中。
[0168]8)37°C，5%C02，20h。
[0169]10)PBS洗一遍。預(yù)冷的80%(v/v)丙酮-PBS溶液固定IOmin ；
[0170](2) ELISA
[0171]I)固定好的細(xì)胞板PBS+0.05%(v/v) Tween 20 (漂洗液)洗3遍。
[0172]2)用 PBS+1%BSA 0.l%Tween 20 (稀釋液)1:10000 稀釋 ant1-NP (HRP)抗體，50 μ I/孔，室溫I小時(shí)。
[0173]3)漂洗液洗6遍。
[0174]4)新配制的底物 2mg OPD (o-phenylenediamine,鄰苯二胺)加入到 4ml 0.05M 朽1檬酸緩沖液(含0.03g/ml過硼酸鈉)中，50 μ I/孔，室溫5min。
[0175]5) 2M H2SO4 終止反應(yīng)，50 μ I/孔。
[0176]6)分光光度計(jì)490nm讀板。
[0177]7)至少做兩次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。
[0178]I1.實(shí)施例
[0179]實(shí)施例1、HA特異性記憶B細(xì)胞
[0180]使用FITC-CD19/APC-1gG/Cy3-HA為特異性標(biāo)志物，獲得了若干個(gè)HA特異性B細(xì)胞。
[0181]實(shí)施例2、抗體基因
[0182]RT-PCR和Nested-PCR法獲得抗體重、輕鏈可變區(qū)基因，分子量為400bp左右，β-actin作為內(nèi)參(343bp)，電泳圖譜見圖2，圖3和圖4。將來源于同一個(gè)B細(xì)胞抗體重輕鏈基因可變區(qū)連接T載體，測(cè)序并進(jìn)行表達(dá)載體構(gòu)建。
[0183]IEl重鏈可變區(qū)基因序列如下(SEQ ID NO:1):
[0184]GAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAAC AAGTATGCCATGAGC(C PR IV TGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCA Α,Τ,ΤΤΑΤΟ,Τ.ΠΤΤΤΑ.,ΠΤΛΤΑΠΑΟΑΤ:CGTGAAGGGC(CDR2、CGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAAGACGTTGTATCTTCAAATGACCAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTTTATTACTGTGCGAAA GATCGGQTAATTTATGTACCATCAACTGGCArAfCDRSUTTaArTrrTaaaar
CAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTAATC[0185]備注:其中使用雙下劃線標(biāo)注的依次為重鏈基因CD R1(SEQ ID NO: 5), CDR2 (SEQID N0:6)，CDR3(SEQ ID NO:7)序列。
[0186]IEl重鏈可變區(qū)氨基酸序列如下(SEQ ID NO:2):
[0187]
【權(quán)利要求】
1.一種分離的結(jié)合分子，其特征在于，所述的結(jié)合分子識(shí)別流感病毒HA蛋白中HA2蛋白亞基序列第345-504位之間的表位。
2.如權(quán)利要求1所述的結(jié)合分子，其特征在于，所述結(jié)合分子包含SEQID NO:8所示重鏈CDRl區(qū)、SEQ ID NO:9所示重鏈CDR2和SEQ ID NO: 10所示重鏈CDR3區(qū)。
3.如權(quán)利要求1所述的結(jié)合分子，其特征在于，所述結(jié)合分子包含SEQID N0:14所示輕鏈CDRl區(qū)、SEQ ID NO: 15所示輕鏈CDR2和SEQ ID NO: 16所示輕鏈CDR3區(qū)。
4.如權(quán)利要求1所述的結(jié)合分子，其特征在于，所述結(jié)合分子包含以下的氨基酸序列:SEQ ID NO:8所示的重鏈CDRl，SEQ ID NO:9所示的重鏈CDR2和SEQ ID NO: 10所示的重鏈 CDR3, SEQ ID NO: 14 所示的輕鏈 CDR1，SEQ ID NO: 15 所示的輕鏈 CDR2 和 SEQ ID NO: 16所示的輕鏈⑶R3。
5.如權(quán)利要求1-4任一所述的結(jié)合分子，其特征在于，包含重鏈可變區(qū)，所述的重鏈可變區(qū)具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。
6.如權(quán)利要求1-4任一所述的結(jié)合分子，其特征在于，包含輕鏈可變區(qū)，所述的輕鏈可變區(qū)具有SEQ ID N0:4所示的氨基酸序列。
7.如權(quán)利要求1-4任一所述的結(jié)合分子，其特征在于，包含重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，其重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)分別具有SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。
8.如權(quán)利要求1-4任一所述的結(jié)合分子，其特征在于，所述的結(jié)合分子是Fab、F(ab’)、F(ab’)2、Fv, dAb、Fd、互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)片段、單鏈抗體(scFv)、二價(jià)單鏈抗體、單鏈?zhǔn)删w抗體、雙特異雙鏈抗體、三鏈抗體、四鏈抗體； 優(yōu)選的，所述的結(jié)合分子是人單克隆抗體； 更優(yōu)選的，所述的人單克隆抗體其重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)分別具有SEQID NO:2和SEQ ID N0:4所示的氨基酸序列，其重鏈恒定區(qū)選擇下組中重鏈類型之一的恒定區(qū):IgGl、IgG2a、IgG2b和IgG3，和其輕鏈恒定區(qū)選擇下組輕鏈類型的恒定區(qū)之一:κ鏈和λ鏈； 更優(yōu)選的，所述的人單克隆抗體其重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)分別具有SEQID NO:2和SEQ ID Ν0:4所示的氨基酸序列，其重鏈恒定區(qū)和輕鏈恒定區(qū)分別具有Genebank號(hào)ACK87036和ACK87038所示的氨基酸序列。
9.編碼權(quán)利要求1-8任一所述的結(jié)合分子的核酸分子。
10.權(quán)利要求1-8任一所述的結(jié)合分子在制備用于診斷、治療和/或預(yù)防流感病毒所致的流感感染的藥物中的用途。
11.如權(quán)利要求10所述的用途，其特征在于，所述的流感病毒的毒株選自如下一組:H1亞型流感病毒、H3亞型流感病毒和H9亞型流感病毒。
12.—種表達(dá)載體,其特征在于,所述表達(dá)載體中含有編碼權(quán)利要求1-7任一所述的結(jié)合分子的DNA。
13.一種宿主細(xì)胞，其特征在于，所述宿主細(xì)胞中含有權(quán)利要求12所述的表達(dá)載體。
14.一種組合物，其特征在于，它含有有效量的權(quán)利要求1-8任一所述的單克隆抗體，以及藥學(xué)上可接受的載體。
15.一種檢測(cè)流感病毒的試劑盒，其包括權(quán)利要求1-8任一所述的結(jié)合分子。
16.一種抑制流感病毒的方法，其特征在于，所述的方法包括給予患者有效量的權(quán)利要求1-8任一所述的結(jié)合分子。
17.—種檢測(cè)流感病毒的方法，其特征在于，利用權(quán)利要求1-8任一所述的結(jié)合分子與待測(cè)樣品進(jìn)行接觸，通過檢測(cè)所述的結(jié)合分子與受試樣品的結(jié)合情況，獲得流感病毒的存在情況以及存在量。`
【文檔編號(hào)】C12N15/63GK103665153SQ201210342406
【公開日】2014年3月26日 申請(qǐng)日期:2012年9月14日 優(yōu)先權(quán)日:2012年9月14日
【發(fā)明者】孫兵, 陳愛中, 邊超, 胡偉斌, 王同燕, 凌志洋 申請(qǐng)人:中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院