專利名稱：一種復合型乳酸菌微生態(tài)制劑的制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及乳酸菌發(fā)酵領域，特別涉及一種復合型乳酸菌微生態(tài)制劑的制備方法。
背景技術：
隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的迅猛發(fā)展，乳酸菌制劑以其天然、無毒、無副作用、無污染、無殘留、安全可靠的優(yōu)越性越來越受到重視。作為一種有益的凈化水質(zhì)的“生物修復劑”，乳酸菌制劑在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的應用越來越受到重視，其應用于水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)主要集中于拌料投喂、發(fā)酵飼料及作為EM菌主導菌在水體潑灑。其中拌料投喂、發(fā)酵飼料研究集中于乳酸菌在水產(chǎn)動物腸胃棲息，及調(diào)節(jié)動物腸道菌群結(jié)構(gòu)和對飼料結(jié)構(gòu)的改變。潑灑調(diào)節(jié)水質(zhì)與乳酸菌可以調(diào)節(jié)養(yǎng)殖水體、改善養(yǎng)殖環(huán)境，抑制病原菌，抗病害，提高免疫力、促進動物生長有著密切的關系。這些應用與乳酸菌以下特性關系密切:首先，乳酸菌能很好適應水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境。水產(chǎn)養(yǎng)殖在養(yǎng)殖期間環(huán)境溫度變動范圍為20-35°C、鹽度變動范圍為0-38、pH值變動范圍為6.9-8.7，在這三者變動范圍內(nèi)乳酸菌均能較好生長。其次，乳酸菌大部分的菌種屬耐氧性厭氧菌，在無氧、低氧或高氧條件下均生長，不僅不與養(yǎng)殖動物競爭氧氣，而且還能在溶氧量較低的水體中下層大量生長繁殖，抑制病原菌滋生。另外，乳酸菌在使用上不受時間限制，暴雨、陰天、晴天、高溫條件下都可以使用。此外，乳酸菌作為一種最早使用的益生菌，與其它菌種相比，其菌體和代謝產(chǎn)物都為有益物，無毒素，實際應用中具有較高的安全性。這些乳酸菌在水產(chǎn)上的應用上的這些優(yōu)勢使得乳酸菌在水產(chǎn)方面有著廣泛的應用和研究。
但是，目前大部分的乳酸菌類微生態(tài)制劑包被的產(chǎn)品價格昂貴，使用成本非常高；而乳酸菌類微生態(tài)制劑水劑產(chǎn)品相對較便宜，但是大多數(shù)產(chǎn)品很不穩(wěn)定，活菌數(shù)較低，儲存周期很短，而且運輸成本較高；固體和液體乳酸菌類微生態(tài)制劑產(chǎn)品目前大多數(shù)采用發(fā)酵罐進行發(fā)酵，一方面生產(chǎn)工藝要求嚴格，需要專業(yè)的技術人員才能操作；另一方面，發(fā)酵罐的成本較高。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提出了一種復合型乳酸菌微生態(tài)制劑的制備方法，解決了現(xiàn)有技術中的不足，是一種培養(yǎng)設備及操作都很簡單，而且儲存時間和單一菌株發(fā)酵水劑相比很穩(wěn)定的乳酸菌微生態(tài)制劑的制備方法。
本發(fā)明的技術方案是這樣實現(xiàn)的:
一種復合型乳酸菌微生態(tài)制劑的制備方法，以養(yǎng)殖動物、養(yǎng)殖水體和底泥為菌源，通過在MRS液體培養(yǎng)基中富集后涂布固體MRS培養(yǎng)基分離出乳酸菌菌株；然后將分離出的乳酸菌菌株進行純化選育出2-5株溶鈣圈大，生長快，活力強的乳酸菌菌株；接著將進行純化選育后選育出的乳酸菌菌株擴大培養(yǎng)，制備復合種子液；最后將復合種子液接種發(fā)酵即得復合型乳酸菌微生態(tài)制劑。
進一步的，所述純 化選育出的乳酸菌菌株為四株。
其中，所述的乳酸菌菌株進行純化采用滅菌的MRS液體培養(yǎng)基，進行富集培養(yǎng)，將富集的菌液涂于MRS斜面上，分離出在含碳酸鈣的MRS固體培養(yǎng)基上溶鈣圈大的菌株若干株，經(jīng)過兩次分離純化后待用；將分離純化后的若干株乳酸菌菌株分別接種于滅菌的MRS液體培養(yǎng)基中，在30°C -37°C溫度下培養(yǎng)46-50小時后吸取菌液在5000rpm下離心10-15min，棄去上清液保留菌體，向菌體中注入95%的生理鹽水得到稀釋菌液，然后用紫外分光光度計測定稀釋菌液OD543nm的吸光度，當所有稀釋菌液的吸光度值相同時，一般吸光度在0.8-1.2之間時，把所有的稀釋菌液按相同的體積比3-5%分別接種于滅菌的MRS液體培養(yǎng)基中，30°C _37°C下靜置培養(yǎng)24-48h，然后用紫外分光光度計測定稀釋菌液的OD543nm，選出8-12株的OD543nm測定值高的菌株，這個OD543nm測定值在0.5-1.0之間；然后把這些菌株的培養(yǎng)液在室溫下繼續(xù)放置10天，后用MRS固體培養(yǎng)基進行平板計數(shù)，培養(yǎng)時間為24-48h，溫度為30°C _37°C，選出計數(shù)結(jié)果高的菌株，最終選出四株乳酸菌菌株分別保種，一般計數(shù)結(jié)果的活菌數(shù)在109CFU/mL都可以進行保種。
上述MRS液體培養(yǎng)基的重量份組成為:大豆蛋白胨0.5-1.5份，牛肉膏0.5-1.5份，酵母浸粉0.2-0.6份，葡萄糖1.5-2.5份，磷酸氫二鉀0.1-0.3份，乙酸鈉0.3-0.7份，檸檬酸三銨0.1-0.3份，硫酸鎂0.05-0.06份，硫酸錳0.02-0.03份，吐溫0.05-0.15份，蒸餾水99-101份。
上述的含碳酸鈣的MRS固體培養(yǎng)基是在MRS液體培養(yǎng)基中按蒸餾水的重量加入1.5-1.8%的瓊脂粉和1-1.2%的碳酸鈣。
其中，所述的將進行純化選育后選出的四株乳酸菌菌株擴大培養(yǎng)，制備復合種子液為:將四株來源不同的乳酸菌菌株進行平板劃線，進行平板劃線所用的培養(yǎng)基為MRS固體培養(yǎng)基，滅菌后冷卻至44-46°C在超凈臺中倒入平板中，待平板冷卻凝固后按10倍梯度稀釋法進行平板涂布計數(shù)，并觀察雜菌。挑取單菌落接入滅菌的MRS液體培養(yǎng)基中進行擴大培養(yǎng)，在30 V -37 V下培養(yǎng)36h-48h，然后將四種培養(yǎng)液按體積比例10%，30%, 30%, 30%混合，然后接種于滅菌的MRS液體培養(yǎng)基中，接種量為5-20%，在30°C -37°C下混合培養(yǎng)24-48h獲得復合種子液。
其中，所述的將復合種子液接種發(fā)酵為:將復合種子液接種到液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，待攪拌均勻后密封在室溫下發(fā)酵3-5天，在密封發(fā)酵過程中每天攪拌兩次，并釋放氣體，同時在發(fā)酵過程中抽樣1-2次，用平板計數(shù)法觀察菌體的生長及雜菌率，并且測定pH值，當活菌數(shù)到達5X 108CFU/mL，雜菌率蘭5%，pH值在3.0-4.0的條件下停止發(fā)酵，即得復合型乳酸菌微生態(tài)制劑。
上述的液體發(fā)酵培養(yǎng)基的重量份組成為:蔗糖0.5-1份，酵母膏0.2-0.5份，乙酸鈉0.2-0.5份，磷酸氫二鉀0.05-1份，檸檬酸三銨0.1-0.5份，硫酸鎂0.058-0.065份、硫酸錳0.020-0.025份，吐溫0.05-0.1份，蒸餾水99-101份。
進一步的，上述的液體發(fā)酵培養(yǎng)基的重量份組成為:蔗糖0.8份，酵母膏0.4份，乙酸鈉0.3份，磷酸氫二鉀0.5份，檸檬酸三銨0.3份，硫酸鎂0.06份、硫酸錳0.023份，吐溫0.08份，蒸餾水100份。
上述液體發(fā)酵培養(yǎng)基的制備方法為:將酵母膏按比例加入自來水中蒸煮，待水開后繼續(xù)蒸煮5分鐘，后加入余下的成分，溶解完全后倒入消毒的塑料桶中冷卻待用。
與現(xiàn)有技術相比， 本發(fā)明的有益效果是:
本發(fā)明從水產(chǎn)養(yǎng)殖動物腸道、養(yǎng)殖水體和底泥中篩選乳酸菌，通過不斷地純化，篩選到生長速度高，產(chǎn)酸能力強，溫度適應范圍寬的多株菌株進行復配發(fā)酵，發(fā)酵液含有比單菌株發(fā)酵更多的代謝產(chǎn)物及風味物質(zhì)，通過復配發(fā)酵，菌株之間互相影響，形成的菌液穩(wěn)定性更高，活性更好，儲存時間更長。通過養(yǎng)殖試驗發(fā)現(xiàn)，復合發(fā)酵液拌料對魚類具有較好的誘食作用，同時提高養(yǎng)殖動物的免疫力。此外，用該復合乳酸菌發(fā)酵液潑灑養(yǎng)殖水體，發(fā)現(xiàn)對水質(zhì)指標具有明顯的改善作用，潑灑復合發(fā)酵液的氨氮的降低幅度是35.56%，而對照組的氨氮增加了 45.49%，而潑灑復合發(fā)酵液的亞硝酸鹽的降低幅度是對照組的2倍。
(I)采用由多種不同來源形態(tài)不同的乳酸菌復配而成，形成了具有多樣性、復雜而又穩(wěn)定的乳酸菌群落，各個菌株能互利共存，優(yōu)勢互補，協(xié)同發(fā)揮作用，功能強大，在養(yǎng)殖水體中使用對水質(zhì)指標的改善效果更好，是單一的乳酸菌制劑所無法實現(xiàn)的。
(2)本發(fā)明最大的特點是采用了簡易的發(fā)酵設備，簡易的發(fā)酵設備不但可以節(jié)約成本，而且操作簡單。本發(fā)明沒有采用目前廣泛使用的發(fā)酵罐，而只是使用了塑料桶來發(fā)酵，沒有復雜的發(fā)酵工序及操作說明，不但可以節(jié)約購買發(fā)酵罐的成本，而且在發(fā)酵過程中不需要加熱，節(jié)約了電費；另外，該發(fā)酵工藝操作簡單，對專業(yè)性操作知識要求較低，可以很好的為所有養(yǎng)殖用戶所用。
(3)本發(fā)明的產(chǎn)品為水劑產(chǎn)品，但具有固體包被乳酸菌產(chǎn)品的穩(wěn)定性且不需要噴霧干燥、包被等復雜工序及材料，在一定程度上節(jié)約了成本。
(4)本發(fā)明產(chǎn)品的代謝產(chǎn)物更加豐富。乳酸菌不是一個微生物分類學上的名稱，細菌分類有數(shù)百個屬，不同屬甚至不同菌株之間的代謝產(chǎn)物都有較大的差異，所以共同發(fā)酵能夠產(chǎn)生更加豐富的代謝產(chǎn)物，豐富的酶系、風味物質(zhì)、有機酸、乳酸菌素等代謝產(chǎn)物使得產(chǎn)品的味道更好，營養(yǎng)更豐富。豐富的風味物質(zhì)及有機酸使得在拌料使用時誘食效果更強，豐富的酶系可降解單一菌株沒法降解的大分子蛋白質(zhì)及產(chǎn)生更多的益生元，對養(yǎng)殖動物腸道的改善效果更佳。
(5)目前水劑乳酸菌制劑的最大的缺點是產(chǎn)品不穩(wěn)定，長時間儲存有益活菌數(shù)會迅速下降，導致使用效果不明顯。而本產(chǎn)品的乳酸菌經(jīng)過復配聯(lián)合發(fā)酵，菌株之間互相影響，使得產(chǎn)品更加穩(wěn)定，和一般的單菌株發(fā)酵液相比，儲存時間至少延長30天。
(6)功 能更全面。根據(jù)資料及研究顯示，乳酸菌在水產(chǎn)養(yǎng)殖中使用具有提高機體免疫力，促進養(yǎng)殖動物生長，抑制有害菌繁殖，促進藻類生長，降低氨氮亞鹽，改善水質(zhì)，降低水體有機物積累，減少耗氧的功能，但是一般來說單一的菌株發(fā)酵液只能發(fā)揮其中的一種功能，而復配產(chǎn)品菌株多，可以全面的發(fā)揮這些功能。
具體實施方式
下面對本發(fā)明中的技術方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發(fā)明的其中的幾個實施例，而不是全部的實施例。基于本發(fā)明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有作出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發(fā)明保護的范圍。
實施例1:
一種復合型乳酸菌微生態(tài)制劑的制備方法，以養(yǎng)殖動物、養(yǎng)殖水體和底泥為菌源，通過在MRS液體培養(yǎng)基中富集后涂布固體MRS培養(yǎng)基分離出乳酸菌菌株；然后將分離出的乳酸菌菌株進行純化選育出三株溶鈣圈大，生長快，活力強的乳酸菌菌株；接著將進行純化選育后選育出的乳酸菌菌株擴大培養(yǎng)，制備復合種子液；最后將復合種子液接種發(fā)酵即得復合型乳酸菌微生態(tài)制劑:
(I)以養(yǎng)殖動物、養(yǎng)殖水體和底泥為菌源，通過在MRS液體培養(yǎng)基中富集后涂布固體MRS培養(yǎng)基分離出乳酸菌菌株；
(2)將分離出的乳酸菌菌株進行純化選育出三株溶鈣圈大，生長快，活力強的乳酸菌菌株:
乳酸菌菌株進行純化采用滅菌的MRS液體培養(yǎng)基，進行富集培養(yǎng)，將富集的菌液涂于MRS斜面上，分離出在含碳酸鈣的MRS固體培養(yǎng)基上溶鈣圈大的菌株，經(jīng)過兩次分離純化后選出18株待用；將分離純化后的18株乳酸菌菌株分別接種于滅菌的MRS液體培養(yǎng)基中，在32°C溫度下培養(yǎng)46小時后吸取5ml菌液在5000rpm下離心15min，棄去上清液保留菌體，向菌體中注入95%的生理鹽水得到稀釋菌液，然后用紫外分光光度計測定稀釋菌液OD543mn的吸光度，當所有稀釋菌液的吸光度值相同時，當吸光度在1.1時，把所有的稀釋菌液按相同的體積比例3%分別接種于滅菌的MRS液體培養(yǎng)基中，32°C下靜置培養(yǎng)24h，然后用紫外分光光度計測定稀釋菌液的OD543nm,選出10株的OD543nm測定值高的菌株，這個OD543nm測定值在0.8時；然后把這些菌株的培養(yǎng)液在室溫下繼續(xù)放置10天，后用MRS固體培養(yǎng)基進行平板計數(shù)，培養(yǎng)時間為·46h，溫度為30°C，選出計數(shù)結(jié)果最高的菌株，最終選出三株乳酸囷囷株分別保種；
上述所用的MRS液體培養(yǎng)基的組成為:大豆蛋白胨lg，牛肉膏l(xiāng)g，酵母浸粉0.5g，葡萄糖2g，磷酸氫二鉀0.2g，乙酸鈉0.5g，檸檬酸三銨0.2g，硫酸鎂0.058g,硫酸錳0.025g,吐溫 0.1g,蒸懼水 IOOg0
上述的含碳酸鈣的MRS固體培養(yǎng)基是在MRS液體培養(yǎng)基中按蒸餾水的重量加入1.5%的瓊脂粉和1.0%的碳酸鈣；即:大豆蛋白胨lg，牛肉膏l(xiāng)g，酵母浸粉0.5g，葡萄糖2g，磷酸氫二鉀0.2g，乙酸鈉0.5g，檸檬酸三銨0.2g，硫酸鎂0.058g,硫酸錳0.025g,吐溫0.lg，蒸懼水100g、瓊脂粉1.5g、碳酸I丐1.0g。
(3)將進行純化選育后選育出的乳酸菌菌株擴大培養(yǎng)，制備復合種子液:
將三株來源不同的乳酸菌菌株進行平板劃線，進行平板劃線所用的培養(yǎng)基為MRS固體培養(yǎng)基，滅菌后冷卻至45°C在超凈臺中倒入平板中，待平板冷卻凝固后按10倍梯度稀釋法進行平板涂布計數(shù)，并觀察雜菌。挑取單菌落接入滅菌的MRS液體培養(yǎng)基中進行擴大培養(yǎng)，在32°C下培養(yǎng)36h，然后將三種培養(yǎng)液按體積比例20%，40%，40%混合，然后接種于滅菌的MRS液體培養(yǎng)基中，接種量為10%，在36°C下混合培養(yǎng)46h獲得復合種子液；
(4)將復合種子液接種發(fā)酵即得復合型乳酸菌微生態(tài)制劑:
將復合種子液接種到液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，待攪拌均勻后密封在室溫下發(fā)酵3.5天，在密封發(fā)酵過程中每天攪拌兩次，并釋放氣體，同時在發(fā)酵過程中抽樣2次，用平板計數(shù)法觀察菌體的生長及雜菌率，并且測定pH值，當活菌數(shù)到達5 X 108CFU/mL，雜菌率=5%，PH值在3.5的條件下停止發(fā)酵，即得復合型乳酸菌微生態(tài)制劑。
上述的液體發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為:蔗糖0.5g，酵母膏0.3g，乙酸鈉0.2g，磷酸氫二鉀0.08g,檸檬酸三銨0.2g，硫酸鎂0.06g、硫酸錳0.02g,吐溫0.08g,蒸餾水IOOgo
上述液體發(fā)酵培養(yǎng)基的制備方法為:先將酵母膏加入自來水中蒸煮，待水開后繼續(xù)蒸煮5分鐘，后加入余下的成分，溶解完全后倒入消毒的塑料桶中冷卻待用。
實施例2:
—種復合型乳酸菌微生態(tài)制劑的制備方法，以養(yǎng)殖動物、養(yǎng)殖水體和底泥為菌源，通過在MRS液體培養(yǎng)基中富集后涂布固體MRS培養(yǎng)基分離出乳酸菌菌株；然后將分離出的乳酸菌菌株進行純化選育出四株溶鈣圈大，生長快，活力強的乳酸菌菌株；接著將進行純化選育后選育出的乳酸菌菌株擴大培養(yǎng)，制備復合種子液；最后將復合種子液接種發(fā)酵即得復合型乳酸菌微生態(tài)制劑:
(I)以養(yǎng)殖動物、養(yǎng)殖水體和底泥為菌源，通過在MRS液體培養(yǎng)基中富集后涂布固體MRS培養(yǎng)基分離出乳酸菌菌株；
(2)將分離出的乳酸菌菌株進行純化選育出四株溶鈣圈大，生長快，活力強的乳酸菌菌株:
乳酸菌菌株進行純化采用滅菌的MRS液體培養(yǎng)基，進行富集培養(yǎng)，將富集的菌液涂于MRS斜面上，分離出在含碳酸鈣的MRS固體培養(yǎng)基上溶鈣圈大的菌株，經(jīng)過兩次分離純化后選出20株待用；將分離純化后的20株乳酸菌菌株分別接種于滅菌的MRS液體培養(yǎng)基中，在37°C溫度下培養(yǎng)48小時后吸取5ml菌液在5000rpm下離心lOmin，棄去上清液保留菌體，向菌體中注入95%的生理鹽水得到稀釋菌液，然后用紫外分光光度計測定稀釋菌液OD543mn的吸光度，當所有稀釋菌液的吸光度值相同時，當吸光度在0.8時，把所有的稀釋菌液按相同的體積比例5%分別接種于滅菌的MRS液體培養(yǎng)基中，36°C下靜置培養(yǎng)48h，然后用紫外分光光度計測定稀釋菌液的OD543nm,選出12株的OD543nm測定值高的菌株，這個OD543nm測定值在0.6時；然后把這些菌株的培養(yǎng)液在室溫下繼續(xù)放置10天，后用MRS固體培養(yǎng)基進行平板計數(shù)，培養(yǎng)時間為28h，溫度為35°C，選出計數(shù)結(jié)果最高的菌株，最終選出四株乳酸囷囷株分別保種；
上述所用的MRS液體培養(yǎng)基的組成為:大豆蛋白胨1.5g，牛肉膏0.5g，酵母浸粉0.3g，葡萄糖1.5g，磷酸氫二鉀0.1g,乙酸鈉0.3g，檸檬酸三銨0.3g，硫酸鎂0.052g,硫酸錳0.023g，吐溫 0.05g,蒸餾水 99g。
上述的含碳酸鈣的MRS固體培養(yǎng)基是在MRS液體培養(yǎng)基中按蒸餾水的重量加入1.8%的瓊脂粉和1.1% 的碳酸鈣；即:大豆蛋白胨1.5g，牛肉膏0.5g，酵母浸粉0.3g，葡萄糖1.5g，磷酸氫二鉀0.1g,乙酸鈉0.3g，檸檬酸三銨0.3g，硫酸鎂0.052g，硫酸猛0.023g,吐溫0.05g,蒸餾水99g、瓊脂粉1.782g、碳酸鈣1.089g。
(3)將進行純化選育后選育出的乳酸菌菌株擴大培養(yǎng)，制備復合種子液:
將四株來源不同的乳酸菌菌株進行平板劃線，進行平板劃線所用的培養(yǎng)基為MRS固體培養(yǎng)基，滅菌后冷卻至44°C在超凈臺中倒入平板中，待平板冷卻凝固后按10倍梯度稀釋法進行平板涂布計數(shù)，并觀察雜菌。挑取單菌落接入滅菌的MRS液體培養(yǎng)基中進行擴大培養(yǎng)，在36°C下培養(yǎng)46h，然后將四種培養(yǎng)液按體積比例10%，30%, 30%, 30%混合，然后接種于滅菌的MRS液體培養(yǎng)基中，接種量為15%，在35°C下混合培養(yǎng)36h獲得復合種子液；
(4)將復合種子液接種發(fā)酵即得復合型乳酸菌微生態(tài)制劑:
將復合種子液接種到液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，待攪拌均勻后密封在室溫下發(fā)酵4天，在密封發(fā)酵過程中每天攪拌兩次，并釋放氣體，同時在發(fā)酵過程中抽樣2次，用平板計數(shù)法觀察菌體的生長及雜菌率，并且測定pH值，當活菌數(shù)到達5 X 108CFU/mL，雜菌率=5%，pH值在4.0的條件下停止發(fā)酵，即得復合型乳酸菌微生態(tài)制劑。
上述的液體發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為:蔗糖0.Sg,酵母膏0.4g，乙酸鈉0.3g，磷酸氫二鉀0.5g，檸檬酸三銨0.3g，硫酸鎂0.06g、硫酸錳0.023g,吐溫0.08g,蒸餾水IOOgo
上述液體發(fā)酵培養(yǎng)基的制備方法為:先將酵母膏加入自來水中蒸煮，待水開后繼續(xù)蒸煮5分鐘，后加入余下的成分，溶解完全后倒入消毒的塑料桶中冷卻待用。
實施例3:
一種復合型乳酸菌微生態(tài)制劑的制備方法，以養(yǎng)殖動物、養(yǎng)殖水體和底泥為菌源，通過在MRS液體培養(yǎng)基中富集后涂布固體MRS培養(yǎng)基分離出乳酸菌菌株；然后將分離出的乳酸菌菌株進行純化選育出五株溶鈣圈大，生長快，活力強的乳酸菌菌株；接著將進行純化選育后選育出的乳酸菌菌株擴大培養(yǎng)，制備復合種子液；最后將復合種子液接種發(fā)酵即得復合型乳酸菌微生態(tài)制劑:
(I)以養(yǎng)殖動物、養(yǎng)殖水體和底泥為菌源，通過在MRS液體培養(yǎng)基中富集后涂布固體MRS培養(yǎng)基分離出乳酸菌菌株；
(2)將分離出的乳酸菌菌株進行純化選育出五株溶鈣圈大，生長快，活力強的乳酸菌菌株:
乳酸菌菌株進行純化采用滅菌的MRS液體培養(yǎng)基，進行富集培養(yǎng)，將富集的菌液涂于MRS斜面上，分離出在含碳酸鈣的MRS固體培養(yǎng)基上溶鈣圈大的菌株，經(jīng)過兩次分離純化后選出22株待用；將分離純化后的22株乳酸菌菌株分別接種于滅菌的MRS液體培養(yǎng)基中，在35°C溫度下培養(yǎng)50小時后吸取5ml菌液在5000rpm下離心12min，棄去上清液保留菌體，向菌體中注入95%的生理鹽水得到稀釋菌液，然后用紫外分光光度計測定稀釋菌液OD543mn的吸光度，當所有稀釋菌液的吸光度值相同時，當吸光度在0.9時，把所有的稀釋菌液按相同的體積比例4%分別接種于滅菌的MRS液體培養(yǎng)基中，35 0C下靜置培養(yǎng)36h，然后用紫外分光光度計測定稀釋菌液的OD543nm,選出8株的OD543nm測定值高的菌株，這個OD543nm測定值在1.0時；然后把這些菌株的培養(yǎng)液在室溫下繼續(xù)放置10天，后用MRS固體培養(yǎng)基進行平板計數(shù)，培養(yǎng)時間為28h，溫度為35°C，選出計數(shù)結(jié)果最高的菌株，最終選出五株乳酸囷囷株分別保種；
上述所用的MRS液體培養(yǎng)基的組成為:大豆蛋白胨0.8g，牛肉膏0.8g，酵母浸粉0.4g，葡萄糖2.5g，磷酸氫二鉀0.1g,乙酸鈉0.1g,檸檬酸三銨0.1g,硫酸鎂0.052g,硫酸錳0.03g,吐溫 0.12g,蒸懼水 IOlg0
上述的含碳酸鈣的MRS固體培養(yǎng)基是在MRS液體培養(yǎng)基中按蒸餾水的重量加入1.6%的瓊脂粉和1.1%的碳酸鈣；即大豆蛋白胨0.Sg，牛肉膏0.Sg，酵母浸粉0.4g，葡萄糖2.5g，磷酸氫二鉀0.1g,乙酸鈉0.7g，檸檬酸三銨0.lg，硫酸鎂0.052g，硫酸錳0.03g,吐溫0.12g，蒸餾水101g、瓊脂粉1.616g、碳酸鈣1.lllg。
(3)將進行純化選育后選育出的乳酸菌菌株擴大培養(yǎng)，制備復合種子液:
將五株來源不同的乳酸菌菌株進行平板劃線，進行平板劃線所用的培養(yǎng)基為MRS固體培養(yǎng)基，滅菌后冷卻至46 °C在超凈臺中倒入平板中，待平板冷卻凝固后按10倍梯度稀釋法進行平板涂布計數(shù)，并觀察雜菌。挑取單菌落接入滅菌的MRS液體培養(yǎng)基中進行擴大培養(yǎng)，在36°C下培養(yǎng)40h，然后將五種培養(yǎng)液按體積比例12%，22%，22%，22%，22%混合，然后接種于滅菌的MRS液體培養(yǎng)基中，接種量為20%，在33°C下混合培養(yǎng)24h獲得復合種子液；
(4)將復合種子液接種發(fā)酵即得復合型乳酸菌微生態(tài)制劑:
將復合種子液接種到液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，待攪拌均勻后密封在室溫下發(fā)酵3天，在密封發(fā)酵過程中每天攪拌兩次，并釋放氣體，同時在發(fā)酵過程中抽樣2次，用平板計數(shù)法觀察菌體的生長及雜菌率，并且測定pH值，當活菌數(shù)到達5 X 108CFU/mL，雜菌率=5%，pH值在3.0的條件下停止發(fā)酵，即得復合型乳酸菌微生態(tài)制劑。
上述的液體發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為:蔗糖1.0g,酵母膏0.5g，乙酸鈉0.5g，磷酸氫二鉀0.8g，檸檬酸三銨0.5g，硫酸鎂0.065g、硫酸錳0.025g,吐溫0.lg，蒸餾水IOlgo
上述液體發(fā)酵培養(yǎng)基的制備方法為:先將酵母膏加入自來水中蒸煮，待水開后繼續(xù)蒸煮5分鐘，后加入余下的成分，溶解完全后倒入消毒的塑料桶中冷卻待用。
以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何 修改、等同替換、改進等，均應包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
權利要求
1.一種復合型乳酸菌微生態(tài)制劑的制備方法，其特征在于:它以養(yǎng)殖動物、養(yǎng)殖水體和底泥為菌源分離出乳酸菌菌株；然后將分離出的乳酸菌菌株進行純化選育出2-5株溶鈣圈大，生長快，活力強的乳酸菌菌株；接著將進行純化選育后選育出的乳酸菌菌株擴大培養(yǎng)，制備復合種子液；最后將復合種子液接種發(fā)酵即得復合型乳酸菌微生態(tài)制劑。
2.根據(jù)權利要求1所述的一種復合型乳酸菌微生態(tài)制劑的制備方法，其特征在于:所述純化選育出的乳酸菌菌株為四株。
3.根據(jù)權利要求2所述的一種復合型乳酸菌微生態(tài)制劑的制備方法，其特征在于:所述的乳酸菌菌株進行純化采用滅菌的MRS液體培養(yǎng)基，進行富集培養(yǎng)，將富集的菌液涂于MRS斜面上，分離出在含碳酸鈣的MRS固體培養(yǎng)基上溶鈣圈大的菌株若干株，經(jīng)過兩次分離純化后待用；將分離純化后的若干株乳酸菌菌株分別接種于滅菌的MRS液體培養(yǎng)基中，在300C _37°C溫度下培養(yǎng)46-50小時后吸取菌液在5000rpm下離心10_15min，棄去上清液保留菌體，向菌體中注入95%的生理鹽水得到稀釋菌液，然后用紫外分光光度計測定稀釋菌液OD543nmW吸光度，當所有稀釋菌液的吸光度值相同時，把所有的稀釋菌液按相同的體積比3-5%分別接種于滅菌的MRS液體培養(yǎng)基中，30°C _37°C下靜置培養(yǎng)24_48h，然后用紫外分光光度計測定稀釋菌液的OD543nm，選出的OD543nm測定值高的菌株；然后把這些菌株的培養(yǎng)液在室溫下繼續(xù)放置10天，后用MRS固體培養(yǎng)基進行平板計數(shù)，培養(yǎng)時間為24-48h，溫度為300C _37°C，選出計數(shù)結(jié)果高的菌株，最終選出4株乳酸菌菌株分別保種。
4.根據(jù)權利要求3所述的一種復合型乳酸菌微生態(tài)制劑的制備方法，其特征在于:所述MRS液體培養(yǎng)基的重量份組成為:大豆蛋白胨0.5-1.5份，牛肉膏0.5-1.5份，酵母浸粉0.2-0.6份，葡萄糖1.5-2.5份，磷酸氫二鉀0.1-0.3份，乙酸鈉0.3-0.7份，檸檬酸三銨0.1-0.3份，硫酸鎂0.05-0.06份，硫酸錳0.02-0.03份，吐溫0.05-0.15份，蒸餾水99-101份。
5.根據(jù)權利要求4所述的一種復合型乳酸菌微生態(tài)制劑的制備方法，其特征在于:所述的含碳酸鈣的MRS固體培養(yǎng)基是在MRS液體培養(yǎng)基中按蒸餾水的重量加入1.5-1.8%的瓊脂粉和1_1.2%的碳酸隹丐 。
6.根據(jù)權利要求2所述的一種復合型乳酸菌微生態(tài)制劑的制備方法，其特征在于:所述的將進行純化選育后選出的四株乳酸菌菌株擴大培養(yǎng)，制備復合種子液為:將四株來源不同的乳酸菌菌株進行平板劃線，挑取單菌落接入滅菌的MRS液體培養(yǎng)基中進行擴大培養(yǎng)，在30°C _37°C下培養(yǎng)36h-48h，然后將四種培養(yǎng)液按體積比例10%，30%, 30%, 30%混合，然后接種于滅菌的MRS液體培養(yǎng)基中，接種量為5-20%，在30°C _37°C下混合培養(yǎng)24_48h獲得復合種子液。
7.根據(jù)權利要求6所述的一種復合型乳酸菌微生態(tài)制劑的制備方法，其特征在于:所述平板劃線所用的培養(yǎng)基為MRS固體培養(yǎng)基。
8.根據(jù)權利要求2所述的一種復合型乳酸菌微生態(tài)制劑的制備方法，其特征在于:所述的將復合種子液接種發(fā)酵為:將復合種子液接種到液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，待攪拌均勻后密封在室溫下發(fā)酵3-5天，在密封發(fā)酵過程中每天攪拌兩次，并釋放氣體，同時在發(fā)酵過程中抽樣1-2次，用平板計數(shù)法觀察菌體的生長及雜菌率，并且測定pH值，當活菌數(shù)到達5X108CFU/mL,雜菌率=5%，pH值在3.0-4.0的條件下停止發(fā)酵，即得復合型乳酸菌微生態(tài)制劑。
9.根據(jù)權利要求8所述的一種復合型乳酸菌微生態(tài)制劑的制備方法，其特征在于:所述液體發(fā)酵培養(yǎng)基的重量份組成為:蔗糖0.5-1份，酵母膏0.2-0.5份，乙酸鈉0.2-0.5份，磷酸氫二鉀0.05-1份，檸檬酸三銨0.1-0.5份，硫酸鎂0.058-0.065份、硫酸錳0.020-0.025 份，吐溫 0.05-0.1 份，蒸餾水 99-101 份。
10.根據(jù)權利要求9所述的一種復合型乳酸菌微生態(tài)制劑的制備方法，其特征在于:所述液體發(fā)酵培養(yǎng)基的重量份組成為:蔗糖0. 8份，酵母膏0.4份，乙酸鈉0.3份，磷酸氫二鉀·0.5份，檸檬酸三銨0.3份，硫酸鎂0.06份、硫酸錳0.023份，吐溫·0.08份，蒸餾水100份。
全文摘要
本發(fā)明提出了一種復合型乳酸菌微生態(tài)制劑的制備方法，屬于乳酸菌發(fā)酵領域。它以養(yǎng)殖動物、養(yǎng)殖水體和底泥為菌源分離出乳酸菌菌株；然后將分離出的乳酸菌菌株進行純化選育出2-5株溶鈣圈大，生長快，活力強的乳酸菌菌株；接著將進行純化選育后選育出的乳酸菌菌株擴大培養(yǎng)，制備復合種子液；最后將復合種子液接種發(fā)酵即得復合型乳酸菌微生態(tài)制劑，與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的有益效果是它是一種培養(yǎng)設備及操作都很簡單，而且儲存時間和單一菌株發(fā)酵水劑相比很穩(wěn)定的乳酸菌微生態(tài)制劑的制備方法。
文檔編號C12N1/20GK103146611SQ20131008067
公開日2013年6月12日 申請日期2013年3月12日 優(yōu)先權日2013年3月12日
發(fā)明者薛愛琴, 羅國強, 蘇艷秋, 顧繼銳 申請人:通威股份有限公司