技術領域：
：本發明涉及通過同時施用二肽基肽酶IV(DPPIV)抑制劑來避免與施用鈉葡萄糖共轉運蛋白2(SGLT2)抑制劑相關的胰高血糖素分泌增加的方法。本發明還涉及通過同時施用二肽基肽酶IV(DPPIV)抑制劑使與施用鈉葡萄糖共轉運蛋白2(SGLT2)抑制劑相關的胰高血糖素分泌正常化的方法。此外，本發明涉及治療糖尿病，1型與2型糖尿病，尤其是2型糖尿病，以及高血糖癥、高胰島素血癥、肥胖癥、高三酸甘油酯血癥、X綜合征、糖尿病并發癥、動脈粥樣硬化及相關疾病的方法，其包括施用SGLT2抑制劑和二肽基肽酶IV(DPPIV)抑制劑。
背景技術：
：：SGLT2為蛋白質家族的一員，其利用電化學鈉梯度（相對于細胞內的鈉濃度梯度）來轉運葡萄糖。不同Na+/葡萄糖轉運蛋白存在于不同組織中：SGLT1主要存在于小腸的腸黏膜及腎臟腎單位近端小管的S3段中；而SGLT2主要存在于腎臟腎單位近端小管的S1段中。糖尿病的原因在于胰島素的需求與供應之間的不匹配，從而導致葡萄糖水平增加。使用SGLT2抑制劑治療糖尿病而降低血漿葡萄糖的原理是：抑制葡萄糖在腎臟中的再吸收來，使得尿中的葡萄糖排泄增加。DeFronzo和Ferranini的論文表明：用SGLT2抑制劑的治療導致胰高血糖素分泌增加。目前還不清楚SGLT2抑制劑刺激胰高血糖素分泌的機制。胰高血糖素刺激肝臟葡萄糖產生，其抵消了SGLT2抑制劑降低葡萄糖的效果。本發明證實：出人意料的是，繼發于給予SGLT2抑制劑的胰高血糖素分泌增加可通過使用二肽基肽酶IV(DPPIV)抑制劑(例如沙格列汀(saxagliptin))來避免、正常化、甚至抵消，而且不影響β細胞的胰島素分泌；另外，出人意料的是，所述胰高血糖素分泌增加的避免、正常化和抵消不會增加低血糖的風險、響應于低血糖的損害及體重降低。因此，相信施用SGLT2抑制劑與二肽基肽酶IV(DPPIV)抑制劑(例如沙格列汀)將提供增強的血糖控制。發明概述一方面，本發明提供通過同時施用二肽基肽酶IV(DPPIV)抑制劑避免與施用SGLT2抑制劑相關的胰高血糖素分泌增加的方法。在另一方面，本發明提供通過同時施用二肽基肽酶IV(DPPIV)抑制劑使與施用SGLT2抑制劑相關的胰高血糖素分泌正常化的方法。在另一方面，本發明提供通過同時施用SGLT2抑制劑和二肽基肽酶IV(DPPIV)抑制劑來減少肝臟葡萄糖產生的方法。在又一方面，本發明提供改善哺乳動物中的血糖控制的方法，其包括向需要此控制的哺乳動物同時施用治療有效量的SGLT2抑制劑和二肽基肽酶IV(DPPIV)抑制劑。在另一方面，本發明提供治療哺乳動物的糖尿病，尤其是2型糖尿病的方法，其包括向需要這類治療的哺乳動物同時施用治療有效量的SGLT2抑制劑和二肽基肽酶IV(DPPIV)抑制劑。本發明的具體優選實施方案將從以下某些優選實施方案及權利要求的更詳細描述變得顯而易見。發明詳述本發明提供避免與施用鈉葡萄糖共轉運蛋白2(SGLT2)抑制劑或其藥學上可接受的鹽、其立體異構體或其前藥酯相關的胰高血糖素分泌增加的方法，其包括施用SGLT2抑制劑和二肽基肽酶IV(DPPIV)抑制劑。在另一個實施方案中，本發明提供使與施用鈉葡萄糖共轉運蛋白2(SGLT2)抑制劑或其藥學上可接受的鹽、其立體異構體或其前藥酯相關的胰高血糖素分泌正常化的方法，其包括施用SGLT2抑制劑和二肽基肽酶IV(DPPIV)抑制劑。在另一個實施方案中，本發明提供減少肝臟葡萄糖產生的方法，其包括施用鈉葡萄糖共轉運蛋白2(SGLT2)抑制劑或其藥學上可接受的鹽、其立體異構體或其前藥酯和二肽基肽酶IV(DPPIV)抑制劑。在又一個實施方案中，本發明提供通過避免胰高血糖素分泌增加來改善哺乳動物的血糖控制的方法，其包括向需要此控制的哺乳動物同時施用治療有效量的鈉葡萄糖共轉運蛋白2(SGLT2)抑制劑或其藥學上可接受的鹽、其立體異構體或其前藥酯和二肽基肽酶IV(DPPIV)抑制劑。在再一個實施方案中，本發明提供通過避免胰高血糖素分泌增加來治療哺乳動物的糖尿病、優選1型及2型糖尿病、更優選2型糖尿病的方法，其包括向需要這類治療的哺乳動物同時施用治療有效量的鈉葡萄糖共轉運蛋白2(SGLT2)抑制劑或其藥學上可接受的鹽、其立體異構體或其前藥酯和二肽基肽酶IV(DPPIV)抑制劑。在一個實施方案中，本發明提供其中哺乳動物為人的方法。本發明中使用的SGLT2抑制劑最優選對SGLT2是選擇性的（相對于SGLT1）。對SGLT2的高選擇性，正如同達格列凈(dapagliflozin)的情況，有利于用于本發明中，因為其避免了不可預期的對腸道SGLT1抑制的影響。某種給定抑制劑對于SGLT2的選擇性可通過比較SGLT1和SGLT2分析測得的EC50值確定。簡言之，使用MARATHONREADYTM人腎臟cDNA(Clontech,MountainView,CA)和根據公開的序列(基因庫(Genbank)登錄號：NM_003041和NM_000343)設計的引物，通過PCR克隆人SGLT1(hSGLT1)及人SGLT2(hSGLT2)全長cDNA序列。將hSGLT1及hSGLT2序列克隆入用于哺乳動物表達的pIRESneo載體(Clontech,MountainView,CA)中，并將其穩定轉染入中國倉鼠卵巢(CHO)細胞中。基于對G418抗生素(GENETICIN?，Invitrogen,Carlsbad,CA)的抗性及14C-α-甲基-D-吡喃葡萄糖苷(14C-AMG)攝取分析中的活性選擇SGLT表達克隆。使用標準細胞培養技術維持表達hSGLT1或hSGLT2的細胞。通過添加100μl/孔含有鈉的無蛋白分析緩沖液(Hepes/TrispH7.4、137mMNaCl、5.4mMKCl、2.8mMCaCl2、1.2mMMgSO4)、10μM14C-AMG和抑制劑或二甲亞砜(DMSO)介質來啟動在96孔培養盤中的鈉依賴性葡萄糖轉運分析，且在37℃下培養盤中培育2h。通過在含鈉條件下觀測到的計數減去在不含鈉攝取條件下觀測到的每分鐘計數(CPM)來計算鈉依賴性14C-AMG攝取。在鈉存在下一式三份地分析在不同濃度下的抑制劑，且通過比較含抑制劑孔中的CPM與僅含DMSO介質的孔中的CPM來計算抑制百分比。已知的SGLT抑制劑根皮苷(Phlorizin)在每一分析中平行地進行評估。使用XLFit(IDBS,Guilford,UK)將劑量-反應曲線擬合為經驗四參數模型以確定半最大反應下的抑制劑濃度(EC50)。SGLT2選擇性表示為有利于SGLT2的EC50比率。有利于SGLT2的EC50選擇性比率為至少10且更優選至少100的SGLT2抑制劑適合用于本發明。適合根據本發明使用的SGLT2抑制劑包含C-芳基葡糖苷或O-芳基葡糖苷。C-芳基葡糖苷及O-芳基葡糖苷在治療糖尿病中為有效的。參見美國專利第6,774,112號，其以全文引用的方式并入本文中。可用于本發明方法中的C-芳基葡糖苷(也稱為C-葡糖苷)SGLT2抑制劑的實例包括但不限于以下：1)如美國專利第6,515,117號及第6,414,126號中所公開的C-芳基葡糖苷，所述專利的公開內容以全文引用的方式并入本文中用于任何目的；2)如美國專利申請案第11/233617號(美國專利申請公開案第2006/0063722A1號)中所描述的C-芳基葡糖苷，該申請案的公開內容以全文引用的方式并入本文中；3)美國專利第6,774,112號中所描述的C-芳基葡糖苷，該專利的公開內容以全文引用的方式并入本文中；4)如美國專利申請公開案第2005/0209166號中所公開的經吡喃葡萄糖基取代的苯衍生物，該公開案的公開內容以全文引用的方式并入本文中；及5)如美國專利申請公開案第S2006/0074031號中所公開的經D-吡喃糖基取代的苯基化合物，該公開案的公開內容以全文引用的方式并入本文中。可用于本發明的方法中的O-葡糖苷SGLT2抑制劑的實例包括但不限于以下：1)如美國專利申請公開案第2006/0194809號中所公開的5-硫代-β-D-吡喃葡萄糖苷，該公開案的公開內容以全文引用的方式并入本文中用于任何目的；2)如WO03/01180中所公開的葡萄吡喃基氧基苯衍生物，WO03/01180的公開內容以全文引用的方式并入本文中用于任何目的；3)如美國專利第6,908,905號中所公開的吡唑衍生物，該專利的公開內容以引用的方式并入本文中用于任何目的；及4)如美國專利第6,815,428號中所公開的吡唑化合物，該專利的公開內容以引用的方式并入本文中用于任何目的。以下的其他公開內容及公開案公開了可用于本發明方法的SGLT2抑制劑：K.Tsujihara等人,Chem.Pharm.Bull.,44:1174-1180(1996)；M.Hongu等人,Chem.Pharm.Bull.,46:22-33(1998)；M.Hongu等人,Chem.Pharm.Bull.,46:1545-1555(1998)；A.Oku等人,Diabetes,48:1794-1800(1999)；及JP10245391(Dainippon)。在一個優選方面，本發明提供美國專利第6,414,126號及第6,515,117號中所公開的用于本發明方法的SGLT2抑制劑，更優選的SGLT2抑制劑為化合物I或達格列凈；或其藥學上可接受的鹽、其所有立體異構體或其前藥酯。在另一個優選方面，本發明提供結晶形式的化合物I，包括美國專利申請公開案第2008/0004336號中所公開的所述結晶形式，所述專利申請的公開內容以全文引用的方式并入本文中用于任何目的。用于本發明方法的最優選結晶形式為達格列凈(S)丙二醇水合物及達格列凈(R)丙二醇水合物。可用于本發明中的另外的SGLT2抑制劑包括卡格列凈(canagliflozin)(Johnson&Johnson/MitsubishiTanabePharma)；依碳酸瑞格列凈(remogliflozinetabonate)(GlaxoSmithklinePlc、KisseiPharmaceuticalsCo.)；伊格列凈(ipragliflozin)(Astellas/Kotobuki)；依帕列凈(empagliflozin)(BoehringerIngelheim)；BI-44847(BoehringerIngelheim)；TS-071(TaishoPharmaceutical)；托格列凈(tofogliflozin)(Roche/ChugaiPharmaceutical)；LX-4211(LexiconPharmaceuticals)；DSP-3235(GlaxoSmithKline/DainipponSumitomo)；ISIS-SGLT2Rx(IsisPharmaceuticals)；及YM543(AstellasPharmaInc)。可用于本發明方法中的DPP-IV抑制劑的實例包括但不限于沙格列汀(saxagliptin)、西他列汀(sitagliptin)(Merck&Co.,Inc.、OnoPharmaceuticalsCo.,Ltd)；維格列汀(vildagliptin)(NovartisPharmaAG)；利拉利汀(linagliptin)(BoehringerIngelheim及EliLilly)；阿格列汀(alogliptin)(TakedaPharmaceuticalCompanyLtd.)，作用于β細胞的ATP依賴性通道的其他已知的DPP-IV抑制劑或其他抗高血糖藥劑，其中沙格列汀、西他列汀、利拉利汀及維格列汀為優選，其中沙格列汀為最優選。在一個實施方案中，本發明提供其中DPP-IV抑制劑為利拉利汀且SGLT2抑制劑為依帕列凈的方法。根據本發明所用的SGLT2抑制劑及DPPIV抑制劑可施用給需要治療的各種哺乳動物種類，諸如狗、貓、牛、人等。這些藥劑可全身性施用，諸如經口或胃腸外施用。在另一個實施方案中，本發明提供一種或多種另外的抗糖尿病劑的同時施用。適用于本發明同時施用的合適的另外的抗糖尿病劑的實例包括但不限于雙胍(例如，二甲雙胍或苯乙雙胍)；葡糖苷酶抑制劑(例如，阿卡波糖(acarbose)或米格列醇(miglitol))；胰島素(包括胰島素促分泌素或胰島素增敏劑)；美格替奈(meglitinide)(例如，瑞格列奈(repaglinide))；磺酰脲(例如，格列美脲(glimepiride)、格列本脲(glyburide)、格列齊特(gliclazide)、氯磺丙脲(chlorpropamide)及格列吡嗪(glipizide))；雙胍/格列本脲組合(例如，Glucovance?)；噻唑烷二酮(例如，曲格列酮(troglitazone)、羅格列酮(rosiglitazone)及吡格列酮(pioglitazone))；PPAR-α激動劑；PPAR-γ激動劑；PPARα/γ雙重激動劑；糖原磷酸化酶抑制劑；脂肪酸結合蛋白(aP2)的抑制劑；胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)及其他GLP-1受體激動劑。其他適合的噻唑烷二酮包括但不限于MCC-555(公開于美國專利第5,594,016號中，Mitsubishi)、法格列扎(faraglitazar)(GI-262570，Glaxo-Wellcome)、恩格列酮(englitazone)(CP-68722，Pfizer)、達格列酮(darglitazone)(CP-86325，Pfizer)；伊薩列酮(isaglitazone)(MIT/Johnson&Johnson)、瑞格列扎(reglitazar)(JTT-501，(JPNT/Pharmacia&Upjohn)、來格列酮(rivoglitazone)(R-119702，Sankyo/WL)、利拉魯肽(liraglutide)(NN-2344，Dr.Reddy/NN)及(Z)-1,4-雙-4-[(3,5-二氧-1,2,4-噁二唑烷-2-基-甲基)]苯氧基丁-2-烯(YM-440，Yamanouchi)。PPAR-α激動劑、PPAR-γ激動劑及PPARα/γ雙重激動劑的實例包括但不限于莫格他唑(muraglitazar)、培利格列扎(peliglitazar)、替格列扎(tesaglitazar)AR-HO39242(AstraZeneca)、GW-501516(Glaxo-Wellcome)、KRP297(KyorinMerck)以及由Murakami等人“ANovelInsulinSensitizerActsAsaColigandforPeroxisomeProliferation-ActivatedReceptorAlpha(PPARalpha)andPPARgamma.EffectonPPARalphaActivationonAbnormalLipidMetabolisminLiverofZuckerFattyRats”,Diabetes47,1841-1847(1998)；WO01/21602、美國專利第6,414,002號及美國專利第6,653,314號(其公開內容以全文引用的方式并入本文中)中所公開的那些激動劑，采用其中所述的劑量。在一個實施方案中，優選用于本文中的是所引用的參考文獻中指定的優選化合物。適合的aP2抑制劑包括但不限于1999年9月7日申請的美國申請案第09/391,053號及美國專利第6,548,529號(其公開內容以全文引用的方式并入本文中)中所公開的那些aP2抑制劑，采用其中所述的劑量。其他適合的美格替奈包括那格列奈(nateglinide)(Novartis)或KAD1229(PF/Kissei)。在另一個實施方案中，本發明進一步提供一種或多種另外的抗糖尿病劑的同時施用，其中所述另外的抗糖尿病劑為二甲雙胍。本發明中使用的SGLT2抑制劑、DPPIV抑制劑及任何另外的抗糖尿病劑以藥物組合物形式施用，所述藥物組合物包含與一種或多種藥學上可接受的載體一起調配的化合物。所述藥物組合物可經專門調配用于以固態或液態形式口服施用、用于胃腸外注射或直腸施用。藥物組合物可經口、經直腸、胃腸外、腦池內、陰道內、腹膜內、經頰或以經口或鼻的噴霧形式施用給人及其他哺乳動物。如本文所用的術語“胃腸外（的）”是指包括靜脈內、肌肉內、腹膜內、胸骨內、皮下及關節內的注射及輸注的施用模式。將SGLT2抑制劑、DPPIV抑制劑及任何另外的抗糖尿病劑摻入常規的全身劑型，諸如片劑、膠囊、酏劑或可注射制劑。以上劑型還包括必要的生理學上可接受的載體物質、賦形劑、潤滑劑、緩沖劑、抗菌劑、膨化劑(諸如甘露糖醇)、抗氧化劑(抗壞血酸或亞硫酸氫鈉)等。但優選口服劑型，盡管胃腸外劑型形式同樣非常令人滿意。用于胃腸外注射的藥物組合物包含藥學上可接受的無菌水溶液或非水溶液、分散液、懸浮液或乳液以及臨用前復原成無菌可注射溶液或分散液的無菌粉劑。適合的水性及非水性載體、稀釋劑、溶劑或介質的實例包括水；乙醇；多元醇(諸如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)；植物油(諸如橄欖油)；可注射有機酯(諸如油酸乙酯)；及其合適的混合物。可例如通過使用包衣物質(諸如卵磷脂)，在分散液的情況下通過維持所需粒度以及通過使用表面活性劑來維持適當流動性。所述組合物也可含有佐劑，諸如防腐劑、濕潤劑、乳化劑及分散劑。可通過包括各種抗菌劑及抗真菌劑，例如對羥基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚山梨酸等來確保防止微生物作用。可能還需要包括等張劑，諸如糖、氯化鈉等。可通過包括諸如單硬脂酸鋁及明膠的延遲吸收的試劑來實現可注射藥物形式的延長吸收。在一些情況下，為延長藥物作用，需要減緩自皮下或肌肉內注射的藥物吸收。這可通過使用水溶性較差的結晶或非晶形物質的液體懸浮液來實現。藥物的吸收速率則視其溶解速率而定，溶解速率又可視晶體大小及結晶形式而定。或者，通過在油介質中溶解或懸浮藥物來實現胃腸外施用的藥物形式的延遲吸收。通過在可生物降解聚合物(諸如聚丙交酯-聚乙交酯)中形成藥物的微膠囊基質來制得可注射積存形式（injectabledepotform）。視藥物與聚合物的比率及所用具體聚合物的性質而定，可控制藥物釋放速率。其他可生物降解聚合物的實例包括聚(原酸酯)及聚(酸酐)。還可通過將藥物覆埋于與身體組織兼容的脂質體或微乳液中來制備可注射積存制劑。可例如通過細菌截留過濾器過濾或通過在無菌固體組合物形式中摻入滅菌劑來將可注射制劑滅菌，所述無菌固體組合物可在臨使用前溶解或分散于無菌水或其他無菌可注射介質中。用于口服施用的固體劑型包括膠囊、片劑、丸劑、粉劑及粒劑。在這類固體劑型中，活性化合物與以下各物混合：至少一種藥學上可接受的惰性賦形劑或載體，諸如檸檬酸鈉或磷酸二鈣和/或a)填充劑或增量劑，諸如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露糖醇及硅酸；b)粘合劑，諸如羧甲基纖維素、藻酸鹽、明膠、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖及阿拉伯膠；c)保濕劑，諸如甘油；d)崩解劑，諸如瓊脂、碳酸鈣、馬鈴薯或木薯淀粉、藻酸、某些硅酸鹽及碳酸鈉；e)溶液遲延劑，諸如石蠟；f)吸收促進劑，諸如季銨化合物；g)濕潤劑，諸如十六醇及單硬脂酸甘油酯；h)吸附劑，諸如高嶺土及膨潤土及i)潤滑劑，諸如滑石、硬脂酸鈣、硬脂酸鎂、固體聚乙二醇、月桂基硫酸鈉及其混合物。在膠囊、片劑及丸劑的情況下，劑型也可包含緩沖劑。也可使用相似類型的固體組合物作為軟填充及硬填充的明膠膠囊中的填充劑，所述膠囊使用賦形劑，諸如乳糖(lactose/milksugar)以及高分子量聚乙二醇等。片劑、糖衣藥丸、膠囊、丸劑及粒劑的固體劑型可制備有包衣及外殼，諸如腸溶包衣及藥物制劑技術中熟知的其他包衣。其任選含有乳濁劑，且也可為僅在腸道的某一部分或優選在腸道的某一部分任選以延遲方式釋放活性成分的組合物。可使用的包埋組合物的實例包括聚合物質及蠟。SGLT2抑制劑、DPPIV抑制劑及任何另外的抗糖尿病劑也可(若適宜)與一種或多種上述賦形劑呈微囊封形式。用于口服施用的液體劑型包括藥學上可接受的乳液、溶液、懸浮液、糖漿及酏劑。除活性化合物之外，液體劑型可含有本領域常用的惰性稀釋劑，諸如水或其他溶劑、助溶劑及乳化劑，諸如乙醇、異丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、芐醇、苯甲酸芐酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺、油類(尤其是棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄欖油、蓖麻油及芝麻油)、甘油、四氫糠醇、聚乙二醇及脫水山梨糖醇的脂肪酸酯及其混合物。除惰性稀釋劑之外，口服組合物也可包括佐劑，諸如濕潤劑、乳化劑及懸浮劑、甜味劑、調味劑及芳香劑。除活性化合物之外，懸浮液可含有懸浮劑，例如乙氧基化異硬脂醇、聚氧化乙烯山梨糖醇及脫水山梨糖醇酯、微晶纖維素、偏氫氧化鋁（aluminummetahydroxide）、膨潤土、瓊脂、黃芪膠及其混合物。所施用的劑量根據患者的年齡、重量及病狀以及施用途徑、劑型及療法及所需結果來調整。一般而言，上述劑型可施用的SGLT2抑制劑的含量為每天約1mg至約1000mg，優選每天約2mg至約400mg，更優選每天2.5mg至約75mg，且甚至更優選每天2.5mg至約50mg。所述劑型可以每天單次劑量或以1-4次的分次劑量施用。除非另外指明，否則本文所述方法中所用的SGLT2抑制劑、DPPIV抑制劑及任何另外的抗糖尿病劑的劑量及制劑公開于本申請通篇論述的各種專利及申請中，所述文獻以全文引用的方式并入本文中。本領域技術人員將認識到，藥物治療效果所需的施用量當然隨所選試劑、病狀的性質及嚴重程度及受治療的哺乳動物而變化，且最終由醫師酌情處理。此外，藥物的最優選數量及個別劑量的間隔由所需治療效果的性質及程度、施用形式、施用途徑及施用部位、受治療的特定患者來確定，且所述最優選值可通過常規技術確定。還應該認識到的是，最佳治療過程，例如給定的劑量數量可由本領域技術人員使用常規的治療測定測試過程來確定。適用于本發明的化合物的SGLT2抑制劑活性可通過使用如下所述的分析系統來確定。SGLT2活性分析通過使用標準分子生物學技術，從人腎mRNA反轉錄及擴增來克隆人SGLT2的mRNA序列。將cDNA序列穩定轉染入CHO細胞中，且基本上如Ryan等人,1994,“HK-2:animmortalizedproximaltubuleepithelialcelllinefromnormaladulthumankidney,”KidneyInternational45:48-57中所述，針對SGLT2活性分析克隆。評估克隆性選定的細胞系中的SGLT2活性的抑制，評估方法基本上如Ryan等人所述進行，但是進行以下修改。在F-12營養混合物(Ham'sF-12；GIBCO,LongIsland,NY)、10%胎牛血清、300μg/ml遺傳霉素及青霉素-鏈霉素中，使細胞在96孔培養盤中生長2-4天達到75,000細胞/孔或30,000細胞/孔。在細胞匯合時，用10mMHepes/Tris(pH7.4)、137mMN-甲基-D-葡糖胺、5.4mMKCl、2.8mMCaCl2、1.2mMMgSO4洗滌細胞兩次。隨后用10μM[14C]AMG及10μM抑制劑(最終DMSO=0.5%)在10mMHepes/Tris(pH7.4)、137mMNaCl、5.4mMKCl、2.8mMCaCl2、1.2mMMgSO4中在37℃下溫育細胞1.5h。用含有0.5mM根皮苷的冰冷1XPBS猝滅攝取分析，且隨后用0.1%NaOH溶解細胞。在添加MicroScint閃爍流體之后，使細胞振蕩1小時，且隨后在TopCount閃爍計數器上定量[14C]AMG。在有NaCl和無NaCl的情況下進行對照。為測定EC50值，在適當反應范圍內在2個對數間隔內使用10種抑制劑濃度，且在整個培養盤上針對三個培養盤求平均值。Ryan等人，同上。實施例以下為本發明的說明。使在篩檢時已進行至少8周穩定二甲雙胍療法的患有2型糖尿病(T2DM)且糖化血紅蛋白(HbA1c)水平大于或等于8%且小于或等于12%的成人患者以1:1:1隨機接受沙格列汀(5mg/天)及達格列凈(10mg/天)加二甲雙胍XR(1500-2000mg/天)劑量，沙格列汀(5mg/天)及安慰劑加二甲雙胍XR(1500-2000mg/天)劑量，或達格列凈(10mg/天)及安慰劑加二甲雙胍XR(1500-2000mg/天)劑量持續24周。在4周引入期初期，將所有患者切換成在引入期及24周治療期間最接近的二甲雙胍XR劑量(1,500-2,000mg/天)。隨后使患者隨機接受沙格列汀5mg/天及達格列凈10mg/天加二甲雙胍(SAXA+DAPA+MET)，沙格列汀5mg/天及安慰劑加二甲雙胍(SAXA+MET)，或達格列凈10mg/天及安慰劑加二甲雙胍(DAPA+MET)持續24周。在篩檢及治療期間禁止患者接受其他抗糖尿病藥物(除了開放標記的急救藥物以外)。在基線（baseline）及施以液體膳食耐受性測試(MTT，360-375kcal；蛋白質14-28.2g；脂肪10.5-14g；碳水化合物42-45g；作為碳水化合物組分的糖16.8-22g，隨研究部位變化)之后第24周評估餐后葡萄糖(PPG)。在藥物施用之前的基線和24周在藥物施用之后1小時進行MTT。抽取血液樣品以測定在0分鐘、30分鐘、60分鐘、120分鐘及180分鐘時間處的胰高血糖素。計算在MTT期間獲得的胰高血糖素從0分鐘至180分鐘的曲線下面積(AUC0-180min)相對于基線的平均變化。通過放射免疫分析(LINCOResearch,St.Charles,MO)測量血漿胰高血糖素。依據梯形規則，在每個時間點的基于模型的平均值估計值(包括營救（rescue）之前的觀測結果)，計算AUC0-180min。使用縱向重復測量分析，針對基線值、治療組、時間、治療組與時間的相互作用、及基線值與時間的相互作用分析在MTT期間所獲得的胰高血糖素的AUC0-180min在24周相對于基線的平均變化。計算各治療組內經調整的平均變化以及治療組之間經調整的平均變化的差異的點估計值及95%置信區間(CI，confidenceinterval)。為了評價HbA1c變化與在24周胰高血糖素的AUC0-180min變化的相關性、HbA1c變化與空腹胰高血糖素濃度變化的相關性、和基線空腹胰高血糖素濃度或胰高血糖素AUC0-180min與基線HbA1C的相關性，進行事后回歸分析。回歸模型包括固定的治療效果及24周胰高血糖素的AUC0-180min變化、空腹胰高血糖素濃度、基線空腹胰高血糖素濃度或胰高血糖素AUC0-180min。未施加多重性控制（multiplicitycontrol）。數據參見下表1。表1中所列舉的數據表明在添加達格列凈時胰高血糖素水平與對照組相比增加，且此效果通過添加沙格列汀而抵消且出乎意料地完全消除。鑒于所述發現，申請人認為，同時施用SGLT2抑制劑及DPPIV抑制劑以及任選另外的抗糖尿病劑(如二甲雙胍)將有效地控制哺乳動物的血糖水平和治療糖尿病(尤其是2型糖尿病)以及高血糖癥、高胰島素血癥、肥胖癥、高三酸甘油酯血癥、X綜合征、糖尿病并發癥、動脈粥樣硬化及相關疾病。當前第1頁1 2 3 當前第1頁1 2 3