本發明涉及醫學材料領域，尤其涉及靜電紡絲膜及其制備方法與在制備生物補片中的應用。
背景技術：
羊膜作為一種異體來源的生物敷料目前已被廣泛的應用于眼科、皮膚科修復、抗瘢痕化等外科常見的疾病。其中，羊膜眼科的應用主要包括：一、眼表疾病的化學燒傷、熱燒傷引起的眼表疾??；二、感染性及非感染性角膜潰瘍的治療；三、原發性或復發性翼狀胬肉；四、其他結膜疾病某些眼部或全身系統性疾病所致的結膜囊狹窄；五、青光眼手術聯合羊膜植入鞏膜瓣下有效的抑制鞏膜增生。羊膜在皮膚修復中的應用主要包括：組織工程皮膚在修復皮膚燒傷、潰瘍等疾病中具有其不可取代的地位。還可以減少瘢痕形成，減輕疼痛，使創面滲出液減少。羊膜作為生物輔料廣泛的應用，但是羊膜的來源有限并且羊膜處理、保存程序繁瑣，同時羊膜可能引起人體免疫排斥反應。所以目前迫切需要開發新產品用于替代羊膜于臨床上的應用。
靜電紡絲技術(electrostaticspinning，es)是一種簡單易行的新型組織工程多孔支架制備方法，靜電紡絲材料具有獨特的微觀結構和適當的力學性能，為生物組織工程支架、緩釋材料等的研發提供理想的平臺。靜電紡絲技術創建的時間較早，但直到20世紀90年代，靜電紡絲才被廣泛的研究，利用靜電將聚合物拉成的細絲“紡織成布”。目前人們利靜電紡絲技術成功的合成了人造皮膚、人造血管等生物材料，利用plla，殼聚糖，膠原，plga等生物材料制備外傷輔料止血、皮膚再生、定向藥物緩釋等功能的醫用產品。以靜電紡絲技術制備生物補片，可以克服羊膜來源有限、保存不易的困難。但目前的靜電紡絲膜的對組織修復的效果不能夠令人滿意。
技術實現要素：
有鑒于此，本發明要解決的技術問題在于提供靜電紡絲膜及其制備方法與在制備生物補片中的應用，本發明提供的靜電紡絲膜具有良好的抗炎、抑 菌作用，將其作為生物補片能夠為細胞生長的提供支架，從而促進組織的修復。
本發明提供的靜電紡絲膜，由以下原料制得；所述原料包括：殼聚糖、明膠和細胞外基質。
通過調節靜紡絲膜中殼聚糖與明膠的比例可以調節殼聚糖靜電紡膜與體內的降解時間，根據應用的不同要求制備具有不同降解時間點的可聚糖靜電紡絲溶液。在本發明中，殼聚糖與明膠的質量比為(3～5)：(1～5)。
細胞外基質(extracellularmatrixc,ecm)，是由動物細胞合成并分泌到胞外、分布在細胞表面或細胞之間的大分子，主要是一些多糖和蛋白，或蛋白聚糖。創面愈合過程中，由遷移增生的平滑肌細胞和成纖維細胞分泌的細胞外基質起到重要作用，它可以為細胞提供移動的網絡和向導，把細胞粘附在一起，對組織的愈合起到骨架作用，并且影響各種生長因子生物活性及其調節作用。本發明將細胞外基質添加入靜電紡絲膜中，使其存在于靜電紡絲膜的立體結構中，所得靜電紡絲膜作為敷料能夠具有保濕抑菌，促進傷口愈合的作用。
本發明添加的細胞外基質選自纖維粘連蛋白、層粘連蛋白、膠原蛋白或硫酸乙酰肝素蛋白。
在本發明中，細胞外基質的質量分數為0.5％～1％。
為了避免靜電紡絲膜使用時發生免疫排斥反應，在其中添加抗排斥藥物。
添加的抗排斥藥物選自硫唑嘌呤、強的松或環磷酰胺。
在本發明中，抗排斥藥物的質量分數為0.2‰～2‰。
在本發明中，抗排斥藥物的質量分數為1‰。
在一些實施例中，靜電紡絲膜由殼聚糖、明膠、細胞外基質制得。
其中，殼聚糖、明膠、細胞外基質的質量比為10:2:1。
其中，細胞外基質為纖維粘連蛋白。
在一些實施例中，靜電紡絲膜由殼聚糖、明膠、細胞外基質和抗排斥藥物制得。
其中，殼聚糖、明膠、細胞外基質、抗排斥藥物的質量比為10:2:1:0.01。
其中，細胞外基質為纖維粘連蛋白和層黏連蛋白；抗排斥藥物為強的松。
在另一些實施例中，殼聚糖、明膠、細胞外基質、抗排斥藥物的質量比 為10:4:1:0.01。
其中，細胞外基質為iv型膠原蛋白；抗排斥藥物為硫唑嘌呤。
在另一些實施例中，殼聚糖、明膠、細胞外基質、抗排斥藥物的質量比為10:5:1:0.01。
其中，細胞外基質為硫酸乙酰肝素蛋白；抗排斥藥物為環磷酰胺。
本發明利用靜電紡絲技術將殼聚糖和明膠制成靜電紡絲膜，并且加入細胞外基質和抗排斥的藥物，增加了所得靜電紡絲膜的生物學功能。本發明利用的為天然生物多糖為原料不僅來源廣泛，避免了應用倫理性問題，同時降低生物污染、病毒傳播、免疫排斥反應等。
本發明提供的靜電紡絲膜可以僅經過紡絲工藝制得(本發明稱為靜電紡絲膜)，也可于紡絲工藝后經過交聯步驟(本發明稱為交聯靜電紡絲膜)，形成網格狀空間結構，該結構與羊膜的結構相似。
本發明提供的靜電紡絲膜的制備方法，以三氟乙酸和二氯甲烷的混合物為溶液，將殼聚糖、明膠、細胞外基質溶解，制得靜電紡絲溶液后經紡絲制得靜電紡絲膜。
在一些實施例中，三氟乙酸和二氯甲烷的體積比為7:3～9:1。
作為優選，氟乙酸和二氯甲烷的體積比為9:1。
在一些實施例中，靜電紡絲溶液中：殼聚糖的濃度為50g/l；明膠的濃度為10g/l～25g/l；細胞外基質的濃度為5g/l。
在本發明的實施例中，溶液中還溶解抗排斥藥物。
所述靜電紡絲液中抗排斥藥物的濃度為0.05g/l。
在本發明的實施例中，所述紡絲的針頭直徑為0.7mm；正負電極之間距離為7～12cm；正負電壓差為20～35kv。
作為優選，所述紡絲的針頭直徑為0.7mm；正負電極之間距離為7cm；正負電壓差為30kv。
在本發明的實施例中，紡絲設備接收器的轉速設定為100～120轉/min。
作為優選，紡絲設備接收器的轉速設定為120轉/min。
殼聚糖靜電紡絲針頭的平移速度為0.2～0.5mm/s。
作為優選，殼聚糖靜電紡絲針頭的平移速度為0.2mm/s。
紡絲空間溫度為70～90℃，濕度為40rh。
作為優選，紡絲空間溫度為80℃。
連續紡絲120～180min。作為優選，連續紡絲150min。
以本發明提供的制備方法制得的靜電紡絲膜。
以本發明提供的制備方法制得的靜電紡絲膜在制備敷料中的應用。
殼聚糖、明膠和細胞外基質的混合物以三氟乙酸和二氯甲烷溶解后，經過紡絲形成了膜狀結構，將其用貼附傷口表面，能夠形成一層粘稠的殼聚糖薄膜，具有保濕抑菌的作用。與經過交聯的靜電紡絲膜相比，不經交聯的靜電紡絲膜遇水能夠溶解，空間結構消失，但是能夠更好的附著于傷口表面。
本發明提供的靜電紡絲膜的另一種制備方法需要經過交聯。具體為：
交聯靜電紡絲膜的制備方法，以三氟乙酸和二氯甲烷的混合物為溶液，將殼聚糖、明膠、細胞外基質，制得靜電紡絲溶液后，經紡絲、交聯制得交聯靜電紡絲膜。
在一些實施例中，三氟乙酸和二氯甲烷的體積比為7:3～9:1。
作為優選，氟乙酸和二氯甲烷的體積比為9:1。
在一些實施例中，靜電紡絲溶液中：殼聚糖的濃度為50g/l；明膠的濃度為10g/l～25g/l；細胞外基質的濃度為5g/l。
在本發明的實施例中，溶液中還溶解抗排斥藥物。
所述靜電紡絲液中抗排斥藥物的濃度為0.05g/l。
在本發明的實施例中，所述紡絲的針頭直徑為0.7mm；正負電極之間距離為7～12cm；正負電壓差為20～35kv。
作為優選，所述紡絲的針頭直徑為0.7mm；正負電極之間距離為7cm；正負電壓差為30kv。
在本發明的實施例中，紡絲設備接收器的轉速設定為100～120轉/min。
作為優選，紡絲設備接收器的轉速設定為120轉/min。
殼聚糖靜電紡絲針頭的平移速度為0.2～0.5mm/s。
作為優選，殼聚糖靜電紡絲針頭的平移速度為0.2mm/s。
紡絲空間溫度為70～90℃，濕度為40rh。
作為優選，紡絲空間溫度為80℃。
連續紡絲120～180min。作為優選，連續紡絲150min。
在本發明的實施例中，交聯的交聯劑為戊二醛；交聯時間為1～3h。
交聯具體為，將經紡絲的靜電紡絲膜與交聯體系置于密閉的干燥器皿中，利用戊二醛水溶液自然揮發蒸汽進行交聯。在一些實施例中，交聯體系中包括水和交聯劑，其中交聯劑的體積分數為10～25％。
經交聯的，還經過干燥的步驟，干燥的條件為真空干燥，溫度為70～90℃，時間為2～3h。
在經過干燥的步驟后，還經過堿處理，以進一步的穩定靜電紡絲膜的空間結構。具體為，以氫氧化鈉的乙醇溶液浸泡經交聯和干燥的交聯靜電紡絲膜。所述氫氧化鈉的乙醇溶液中，氫氧化鈉的濃度為0.5mol/l，浸泡的時間為1～3h。
在經過堿處理后，將交聯靜電紡絲膜以蒸餾水清洗后，干燥。所述干燥的溫度為70～100℃，干燥的條件為真空干燥。
以本發明提供的制備方法制得的交聯靜電紡絲膜。
以本發明提供的制備方法制得的交聯靜電紡絲膜在制備生物補片中的應用。
殼聚糖、明膠和細胞外基質的混合物以三氟乙酸和二氯甲烷溶解后，經過紡絲形成了網格狀的立體結構，經過交聯和堿處理后，該結構更加的穩固，紡絲粗細均勻，空間結構完整與羊膜的結構類似。經檢測，經交聯的靜電紡絲膜厚度為0.1mm～0.5mm，應力值為1.07n～2.2n。該靜電紡絲膜的空間結構有利于細胞附著在靜電紡絲膜上，從而為細胞的生長提供了與體內更加相似的環境，將其制成生物補片，能夠促進傷口的愈合，并且能夠起到良好的抗菌作用。因而，本發明提供了一種生物補片，由經交聯的靜電紡絲膜和生長因子制得。
本發明提供的生物補片由以下原料制得，所述原料包括殼聚糖、明膠、細胞外基質和生長因子。
在一些實施例中，所述細胞外基質的質量分數為2.5％；所述生長因子的質量分數為0.1‰。
生長因子是指具有刺激細胞生長活性的細胞因子。是一類通過與特異的、高親和的細胞膜受體結合，調節細胞生長與其他細胞功能等多效應的多肽類物質。本發明利用靜電紡絲膜表面的氨基與蛋白因子中的羧基進行縮合反應，將生長因子修飾在靜電紡絲膜的表面。本發明制得的生物補丁具有網格狀的 空間結構，紡絲粗細均勻。其內部含有細胞外基質成分，表面修飾有生長因子，因此，其能夠促進細胞的生長。根據不同患者的需求，可將不同的生長因子修飾在靜電紡絲膜的表面。也可以根據不同患者的需求，在生物補片表面接種不同種類的干細胞，然后將其用于受損組織的修復；或者直接利用靜電紡膜對受損組織進行修復。因此，本發明提供的生物補片可用于眼科、皮膚科、隔膜修復。能夠用于治療胬肉、眼表損傷、抗增殖、皮膚損傷、臟器損傷，或進行牙齒修復。
本發明提供的生物補片中還包括抗排斥藥物，所述抗排斥藥物的質量分數為0.2‰。
在本發明的實施例中，生長因子選自成纖維細胞生長因子、表皮生長因子、重組人角質細胞生長因子、胰島素樣生長因子、人肝細胞生長因子、轉化生長因子或血管內皮生長因子。
在一些實施例中，生物補片由殼聚糖、明膠、細胞外基質和生長因子制得。
其中，殼聚糖、明膠、細胞外基質、生長因子的質量比為10:2:1:0.01。
其中，細胞外基質為纖維粘連蛋白。
其中，生長因子為成纖維細胞生長因子和表皮生長因子。
其中，成纖維細胞生長因子和表皮細胞生長因子的質量比為1：1。
實驗表明，此實施例制得靜電紡絲膜的降解時間為25天。
在一些實施例中，靜電紡絲膜由殼聚糖、明膠、細胞外基質、生長因子和抗排斥藥物制得。
其中，殼聚糖、明膠、細胞外基質、生長因子和抗排斥藥物的質量比為10:4:1:0.01。
其中，細胞外基質為纖維粘連蛋白和層黏連蛋白；抗排斥藥物為強的松。生長因子為成纖維細胞生長因子和血管內皮生長因子。
其中，成纖維細胞生長因子和血管內皮生長因子的質量比為1：1。
實驗表明，此實施例制得靜電紡絲膜的降解時間為23天。
在另一些實施例中，殼聚糖、明膠、細胞外基質、生長因子和抗排斥藥物的質量比為10:5:1：0.01：0.01。
其中，細胞外基質為iv型膠原蛋白；抗排斥藥物為硫唑嘌呤；生長因子 為表皮生長因子和胰島素樣生長因子。
其中，表皮生長因子和胰島素樣生長因子的質量比為1：1。
實驗表明，此實施例制得靜電紡絲膜的降解時間為21天。
在另一些實施例中，殼聚糖、明膠、細胞外基質、生長因子和抗排斥藥物的質量比為10:5:1：0.01：0.01。
其中，細胞外基質為硫酸乙酰肝素蛋白；抗排斥藥物為環磷酰胺；生長因子為表皮生長因子和血管內皮生長因子。
其中，表皮生長因子和血管內皮生長因子的質量比為1：1。
實驗表明，此實施例制得靜電紡絲膜的降解時間為21天。
本發明提供的生物補片是在靜電紡絲膜上修飾生長因子制得，所述靜電紡絲膜可參照本發明提供的方法制備，也可于市場購得本發明制備的靜電紡絲膜。
本發明提供的生物補片的制備方法，包括：
步驟1：以三氟乙酸和二氯甲烷的混合物為溶液，將殼聚糖、明膠和細胞外基質溶解，制得靜電紡絲溶液后，經紡絲、交聯制得交聯靜電紡絲膜；
步驟2：在所述交聯靜電紡絲膜表面修飾生長因子反應，制得生物補片。
步驟2具體為，將靜電紡絲膜活化后，在dmap和nhs存在條件下，與生長因子反應，制得生物補片。
在一些實施例中，三氟乙酸和二氯甲烷的體積比為7:3～9:1。
作為優選，氟乙酸和二氯甲烷的體積比為9:1。
在一些實施例中，靜電紡絲溶液中：殼聚糖的質量分數為5％；明膠的質量分數為2.5％；細胞外基質的質量分數為1％。
在本發明的實施例中，溶液中還溶解抗排斥藥物。
所述靜電紡絲液中抗排斥藥物的質量分數為0.2‰。
在本發明的實施例中，所述紡絲的針頭直徑為0.7mm；正負電極之間距離為7～12cm；正負電壓差為20～35kv。
作為優選，所述紡絲的針頭直徑為0.7mm；正負電極之間距離為7cm；正負電壓差為30kv。
在本發明的實施例中，紡絲設備接收器的轉速設定為100～120轉/min。
作為優選，紡絲設備接收器的轉速設定為120轉/min。
殼聚糖靜電紡絲針頭的平移速度為0.2～0.5mm/s。
作為優選，殼聚糖靜電紡絲針頭的平移速度為0.2mm/s。
紡絲空間溫度為70～90℃，濕度為40rh。
作為優選，紡絲空間溫度為80℃。
連續紡絲120～180min。作為優選，連續紡絲150min。
在一些實施例中，活化的時間為12～24h；與生長因子反應的溫度為0～4℃，反應時間為20～30h。
在一些實施例中，活化為將靜電紡絲膜以pbs緩沖液浸泡。
作為優選，活化的時間為24h；與生長因子反應的溫度為4℃，反應時間為24h。
作為優選，dmap與nhs的質量比1:1。
在一些實施例中，靜電紡絲膜與生長因子的質量比為(3～4)：0.01。
作為優選，靜電紡絲膜與生長因子的質量比為3：0.01。
與生長因子反應后，生物補片還經過凍干和滅菌。
作為優選，滅菌采用環氧乙烷熏蒸。
實驗表明，本發明提供的生物補片能夠具有良好的抑菌效果，且可以作為細胞支架用于傷口的修復，或作為生物海綿吸附干細胞懸液進行傷口的修復。
因此，本發明提供的生物補片在傷口的修復中的應用。
本發明提供了靜電紡絲膜及其制備的生物補片。本發明提供的靜電紡絲膜由殼聚糖、明膠、細胞外基質制得，其中還可包括抗排斥藥物。其可直接由紡絲制得，或經紡絲、交聯后制得。在靜電紡絲膜表面修飾生長因子，制得生物補丁。本發明提供的靜電紡絲膜具有網格狀的空間結構，紡絲粗細均勻，與羊膜結構相似。且其表面修飾生長因子后，其能夠促進細胞的生長，有利于細胞的吸附且能夠為細胞生長提供更加適宜的環境，從而達到更好的修復作用，能夠用于皮膚、眼表等部位，具有良好的抗菌、消炎效果。
附圖說明
圖1-a示實施例5制得的靜電紡絲膜的電鏡圖；
圖1-b示生物羊膜的靜電紡絲膜的電鏡圖；
圖2示紅外圖譜；其中，線1示殼聚糖的紅外光譜；線2示明膠的紅外光譜；線3示實施例5制得靜電紡絲膜的紅外光譜；線4示實施例9制得的生物補片的紅外光譜；
圖3-a示光鏡下實施例9制得的生物補片，25×；
圖3-b示市售殼聚糖靜電紡絲膜與間充質干細胞共同培養的效果，25×；
圖3-c示生物羊膜與間充質干細胞共同培養的效果，25×；
圖3-d示實施例5制得的靜電紡絲膜與間充質干細胞共同培養的效果，25×；
圖3-e示實施例9制得的生物補片與間充質干細胞共同培養的效果，25×；
圖4-a示a組實驗動物4天后球結膜病理檢測，40×；
圖4-b示a組實驗動物8天后球結膜組織病理檢測，40×；
圖4-c示a組實驗動物14天后球結膜組織病理檢測，40×；
圖4-d示a組實驗動物28天后球結膜組織病理檢測，40×；
圖4-e示b組實驗動物4天后球結膜病理檢測，40×；
圖4-f示b組實驗動物8天后球結膜組織病理檢測，40×；
圖4-g示b組實驗動物14天后球結膜組織病理檢測，40×；
圖4-h示b組實驗動物28天后球結膜組織病理檢測，40×；
圖4-i示c組實驗動物4天后球結膜病理檢測，40×；
圖4-j示c組實驗動物8天后球結膜組織病理檢測，40×；
圖4-k示c組實驗動物14天后球結膜組織病理檢測，40×；
圖4-l示c組實驗動物28天后球結膜組織病理檢測，40×。
具體實施方式
本發明提供了靜電紡絲膜及其制備方法與在制備生物補片中的應用，本領域技術人員可以借鑒本文內容，適當改進工藝參數實現。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領域技術人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發明。本發明的方法及應用已經通過較佳實施例進行了描述，相關人員明顯能在不脫離本發明內容、精神和范圍內對本文的方法和應用進行改動或適當變更與組合，來實現和應用本發明技術。
本發明采用的試劑、試材、儀器皆為普通市售品，皆可于市場購得。
下面結合實施例，進一步闡述本發明：
實施例1
殼聚糖10g、明膠2g、纖維粘連蛋白1g，溶解于0.2l三氟乙酸與二氯甲烷(體積比為9:1)溶液中；充分攪拌混合溶解，待完全溶解后加入0.01g的硫唑嘌呤溶解待用。
采用kh-1103型靜電紡絲設備對殼聚糖靜電紡絲溶液進行紡絲。殼聚糖靜電紡絲溶液裝填于注射器中，注射器前端的針頭直徑為0.7mm，將殼聚糖注射器的針頭連接靜電紡絲機正電極，滾筒狀接收器靜電紡絲機負電極，調節靜電紡絲機正負電極之間的距離為7cm，正負電壓差子在30kv，接收器的轉速設定為120轉/min，殼聚糖靜電紡絲針頭的平移速度為0.2mm/s，紡絲空間溫度為80℃，濕度為40rh。連續紡絲150min，制得靜電紡絲膜5g。
實施例2
殼聚糖10g、明膠4g、纖維粘連蛋白0.5g、層黏連蛋白0.5g、溶解于0.2l三氟乙酸與二氯甲烷(體積比為7:3)溶液中；充分攪拌混合溶解，待完全溶解后加入強的松0.01g，溶解待用。
采用kh-1103型靜電紡絲設備對殼聚糖靜電紡絲溶液進行紡絲。殼聚糖靜電紡絲溶液裝填于注射器中，注射器前端的針頭直徑為0.7mm，將殼聚糖注射器的針頭連接靜電紡絲機正電極，滾筒狀接收器靜電紡絲機負電極，調節靜電紡絲機正負電極之間的距離為10cm，正負電壓差子在20kv，接收器的轉速設定為100轉/min，殼聚糖靜電紡絲針頭的平移速度為0.3mm/s，紡絲空間溫度為70℃，濕度為40rh。連續紡絲120min，制得靜電紡絲膜5.5g。
實施例3
殼聚糖10g、明膠5g、iv型膠原蛋白1g溶解于0.2l三氟乙酸與二氯甲烷(體積比為4:1)溶液中；充分攪拌混合溶解，待完全溶解后加入硫唑嘌呤0.01g，溶解待用。
采用kh-1103型靜電紡絲設備對殼聚糖靜電紡絲溶液進行紡絲。殼聚糖 靜電紡絲溶液裝填于注射器中，注射器前端的針頭直徑為0.7mm，將殼聚糖注射器的針頭連接靜電紡絲機正電極，滾筒狀接收器靜電紡絲機負電極，調節靜電紡絲機正負電極之間的距離為12cm，正負電壓差子在35kv，接收器的轉速設定為110轉/min，殼聚糖靜電紡絲針頭的平移速度為0.5mm/s，紡絲空間溫度為90℃，濕度為40rh。連續紡絲180min，制得靜電紡絲膜5.4g。
實施例4
殼聚糖10g、明膠5g、乙酰肝素蛋白1g溶解于0.2l三氟乙酸與二氯甲烷(體積比為9:1)溶液中；充分攪拌混合溶解，待完全溶解后加入環磷酰胺0.01g，溶解待用。
采用kh-1103型靜電紡絲設備對殼聚糖靜電紡絲溶液進行紡絲。殼聚糖靜電紡絲溶液裝填于注射器中，注射器前端的針頭直徑為0.7mm，將殼聚糖注射器的針頭連接靜電紡絲機正電極，滾筒狀接收器靜電紡絲機負電極，調節靜電紡絲機正負電極之間的距離為8cm，正負電壓差子在25kv，接收器的轉速設定為120轉/min，殼聚糖靜電紡絲針頭的平移速度為0.4mm/s，紡絲空間溫度為85℃，濕度為40rh。連續紡絲160min，制得靜電紡絲膜5.2g。
實施例5
將實施例1制得的靜電紡絲膜2g與0.025l戊二醛水溶液(體積分數25％)置于密閉的干燥器皿中，利用戊二醛水溶液自然揮發蒸汽進行殼聚糖靜電紡絲膜的交聯1h。
90℃真空條件下干燥2h。
0.5mol/l的氫氧化鈉乙醇溶液浸泡殼聚糖靜電紡絲膜1h，進一步保持靜電紡絲膜的空間結構。
蒸餾水反復清洗去掉多余的氫氧化鈉等物質，100℃真空干燥，制得交聯靜電紡絲膜。
實施例6
將實施例2制得的靜電紡絲膜2g與0.025l戊二醛水溶液(體積分數10％)置于密閉的干燥器皿中，利用戊二醛水溶液自然揮發蒸汽進行殼聚糖靜 電紡絲膜的交聯3h。
70℃真空條件下干燥3h。
0.5mol/l的氫氧化鈉乙醇溶液浸泡殼聚糖靜電紡絲膜3h，進一步保持靜電紡絲膜的空間結構。
蒸餾水反復清洗去掉多余的氫氧化鈉等物質，70℃真空干燥，制得交聯靜電紡絲膜。
實施例7
將實施例3制得的靜電紡絲膜2g與0.025l戊二醛水溶液(體積分數15％)置于密閉的干燥器皿中，利用戊二醛水溶液自然揮發蒸汽進行殼聚糖靜電紡絲膜的交聯2h。
80℃真空條件下干燥2.5h。
0.5mol/l的氫氧化鈉乙醇溶液浸泡殼聚糖靜電紡絲膜2h，進一步保持靜電紡絲膜的空間結構。
蒸餾水反復清洗去掉多余的氫氧化鈉等物質，80℃真空干燥，制得交聯靜電紡絲膜。
實施例8
將實施例4制得的靜電紡絲膜2g與0.025l戊二醛水溶液(體積分數20％)置于密閉的干燥器皿中，利用戊二醛水溶液自然揮發蒸汽進行殼聚糖靜電紡絲膜的交聯3h。
80℃真空條件下干燥3h。
0.5mol/l的氫氧化鈉乙醇溶液浸泡殼聚糖靜電紡絲膜2h，進一步保持靜電紡絲膜的空間結構。
蒸餾水反復清洗去掉多余的氫氧化鈉等物質，100℃真空干燥，制得交聯靜電紡絲膜。
實施例9
將實施例5制得的交聯靜電紡絲膜1.5g，浸泡于pbs溶液中(ph值7.4)24h，使其表面的氨基充分活化。加入4-二甲氨基吡啶(dmap)0.12g與 n-羥基丁二酰亞胺(nhs)0.12g。充分溶解后加入成纖維細胞生長因子0.005g、表皮生長因子0.005g。利用殼聚糖靜電紡絲膜表面的氨基與蛋白因子中的羧基進行縮合反應，4℃反應24h，將生長因子修飾在靜電紡絲膜表面后，冷凍干燥、進行環氧乙烷熏蒸滅菌，制得生物補片。
實施例10
將實施例6制得的交聯靜電紡絲膜2g，浸泡于pbs溶液中(ph值7.4)12h，使其表面的氨基充分活化。同時加入4-二甲氨基吡啶(dmap)0.15g與n-羥基丁二酰亞胺(nhs)0.15g。充分溶解后加入成纖維細胞生長因子0.007g、血管內皮生長因子0.007g。利用殼聚糖靜電紡絲膜表面的氨基與蛋白因子中的羧基進行縮合反應，2℃反應20h，將生長因子修飾在靜電紡絲膜表面后，冷凍干燥、進行環氧乙烷熏蒸滅菌，制得生物補片。
實施例11
將實施例7制得的交聯靜電紡絲膜1g，浸泡于pbs溶液中(ph值7.4)20h，使其表面的氨基充分活化。同時加入4-二甲氨基吡啶(dmap)0.1g與n-羥基丁二酰亞胺(nhs)0.1g。充分溶解后加入表皮生長因子0.003g、胰島素樣生長因子0.003g。利用殼聚糖靜電紡絲膜表面的氨基與蛋白因子中的羧基進行縮合反應，0℃反應30h，將生長因子修飾在靜電紡絲膜表面后，冷凍干燥、進行環氧乙烷熏蒸滅菌，制得生物補片。
實施例12
將實施例8制得的交聯靜電紡絲膜1g，浸泡于pbs溶液中(ph值7.4)18h，使其表面的氨基充分活化。同時加入4-二甲氨基吡啶(dmap)0.1g與n-羥基丁二酰亞胺(nhs)0.1g。充分溶解后加入表皮生長因子0.003g、血管內皮生長因子0.003g。利用殼聚糖靜電紡絲膜表面的氨基與蛋白因子中的羧基進行縮合反應4℃反應24h，將生長因子修飾在靜電紡絲膜表面后，冷凍干燥、進行環氧乙烷熏蒸滅菌，制得生物補片。
實施例13
掃描電鏡的檢測：
取實施例1～12制得的靜電紡絲膜樣品，表面噴金、固定，以鎢燈絲掃描電子顯微鏡(s-3800，日立公司)觀察靜電紡絲膜纖維表面形貌。其中，對實施例5制得的靜電紡絲膜的電鏡圖如圖1-a所示，其他實施例制得的靜電紡絲膜的空間結構與此相似?？梢姡景l明實施例制得的靜電紡絲膜具有空間立體網狀結構，與生物羊膜空間結構(圖1-b)相似，紡絲直徑均勻(0.1～0.5μm)納米纖維。
實施例14
紅外圖譜檢測：
對實施例5～8制得的交聯靜電紡絲膜和實施例9～12制得的生物補片進行紅外圖譜檢測。其中，對實施例5制得靜電紡絲膜和實施例9制得的生物補片的紅外圖譜如圖2紅外圖譜所示，其中，線1示殼聚糖的紅外光譜，線2示明膠的紅外光譜，線3示實施例5制得靜電紡絲膜的紅外光譜(實施例6～8制得的靜電紡絲膜的紅外光譜與此相似)；線4示實施例9制得的生物補片的紅外光譜(實施例10～12制得的靜電紡絲膜的紅外光譜與此相似)。如線4，細胞因子與殼聚糖上的氨基進行縮合反應形成酰胺鍵。
檢測結果表明，殼聚糖在3413cm-1、2875cm-1、1655cm-1、1376cm-1、1049cm-1等處具有明顯的吸收峰。3400cm-1、2862cm-1為殼聚糖環上的碳氫鍵、羥基的吸收峰，本研究用的殼聚糖的脫乙酰度為95％左右，在紅外圖譜上可以觀察到酰胺鍵的吸收峰在1646cm-1、1382cm-1處,1049cm-1處的吸收峰為糖環上的碳氧鍵吸收峰。
本發明制得的生物補片在3413cm-1、2875cm-1、1648cm-1、1378cm-1、1070cm-1處具有明顯的吸收峰。保持與殼聚糖明膠的基礎吸收峰，并且酰胺鍵的吸收峰變得扁平，峰面積較大，可以斷定生物因子與殼聚糖進行的縮合反應形成酰胺鍵。
實施例15
瓊脂擴散抑菌實驗，以實施例5制得的靜電紡絲膜與生物羊膜(直徑5mm)探討生物膜膜片對大腸桿菌與金黃色葡萄球菌的抑制作用。結果如表1 所示：
注：--示未見抑菌效果
結果顯示，本發明實施例制得的生物補片或靜電紡絲膜皆具有良好的抑菌效果。
實施例16
靜電紡絲膜干細胞培養：
實施例5～12制得的靜電紡絲膜，實驗以市售殼聚糖靜電紡絲膜為對照。分別將膜平鋪于6cm培養皿底部，加入2ml無血清dmed培養，細胞培養箱孵育48h，接種間充質干細胞前2h去掉浸泡培養基。間充質干細胞制備成4×108l-1的細胞懸液，2ml的細胞懸液緩慢滴加于培養皿靜電紡絲膜的表面，孵育2h的后添加3ml10％小牛血清的dmem培養基繼續培養，每天更換10％小牛血清的dmem培養基連續培養10天，每天對靜電紡絲陪細胞培養進行觀察。結果如圖3所示：光鏡下，實施例9制得的生物補片具有網格狀的空間結構，紡絲粗細均勻(圖3-a)，市售殼聚糖靜電紡絲膜上生長的干細胞數量較少(圖3-b)，經統計為7×105個/cm2，生物羊膜上細胞附著數量豐富，生長狀態良好(圖3-c)，經統計為8.3×105個/cm2；實施例5制得的靜電紡絲膜上細胞數量較豐富，生長狀態良好(圖3-d)，經統計為9.8×105個/cm2；實 施例9制得的生物補片上細胞數量豐富(圖3-e)，經統計為9×105個/cm2，且生長狀態良好，與生物羊膜效果相當。
實施例17
選擇健康無眼病新西蘭白兔作為實驗對象，體重2.5～3kg，30只，雌雄不限，由中國北方眼科疾病動物平臺(遼寧何氏醫學院)提供，右眼選為實驗眼，以0.2ml/kg的劑量肌肉注射速眠新ⅱ進行麻醉，鹽酸奧布卡因滴眼液表面麻醉，碘伏沖洗結膜囊，手術切除外直肌與上直肌間約1/4項限4mm×5mm鞏膜緣組織，其前界達到角膜透明區內0.5-1mm，后界達到角鞏膜溝后1.0～1.5mm，深0.2～0.4mm，棉簽蘸取0.5mol/l的氫氧化鈉溶液(1ml)處理角膜緣透明區域，制備球結膜損傷實驗動物模型。
a組模型動物空白組；常規手術方法切除4mm×5mm鞏膜緣組織，縫合四角結膜與淺鞏膜固定球結膜損傷處，作為傷口的標記；
b組凍干羊膜治療組；實驗方法與a組相同，術中凍干羊膜5mm×6mm平鋪于傷口處，膜四周墊付于結膜下，縫合四角結膜、生物羊膜與淺層鞏膜固定凍干羊膜(生物羊膜由上善醫療器械有限公司提供)；
c組本發明生物補片治療組。實驗方法與a組相同，術中采用實施例9制備的生物補片5mm×6mm平鋪于手術傷口處，膜的四周墊付于結膜下，四角縫合結膜、靜電紡絲膜與淺層鞏膜固定靜電紡絲膜。
如圖4所示，術后4、8、14、28天分別取材進行常規病理檢測：a組實驗動物可以觀察到球結膜術后，球結膜于眼球后部緩慢向角膜方向生長，28天后角膜緣附近生有大量的瘢痕組織(he，×40)(圖4-a～圖4-b)；b組實驗動物可以觀察到球結膜術后，球結膜修復快速，球結膜上皮生長不完整，修復速度較單純手術恢復的快，同時瘢痕化較輕(he，×40)(圖4-e～圖4-h)；c組實驗動物可以觀察到球結膜術后，球結膜修復迅速，大量的組織沿著生物補片生長，28天后球結表面較為光潔，很大程度上促進球結膜的修復，抗瘢痕化作用強(he，×40)(圖4-i～圖4-l)。
說明：本發明制備的生物補片具有支撐組織生長的能力，促進球結膜術后快速修復，為修復提供良好的細胞支架，修復組織較平整，瘢痕化增殖較少，為球結膜的修復提供一種良好的組織敷料。
以上僅是本發明的優選實施方式，應當指出，對于本技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發明的保護范圍。