本發(fā)明屬于免疫學(xué)與心血管疾病藥物制備領(lǐng)域，涉及白細胞介素33在制備治療心肌炎疾病藥物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

心肌炎是一種以心肌局限性或彌漫性的炎性病變?yōu)橹饕憩F(xiàn)的疾病。Lieberman 根據(jù)心肌活檢的組織學(xué)改變與臨床表現(xiàn)，將心肌炎分為暴發(fā)性心肌炎、急性心肌炎、慢性活動性心肌炎和慢性遷延性心肌炎（參見：Lieberman EB et al., J Am Coll Cardiol, 1991, 18(7): 1671-1626）。心肌炎的病理生理機制不清。大鼠腸道病毒心肌炎模型顯示，病毒進入急性損傷的心肌細胞，通過復(fù)制導(dǎo)致心肌壞死，細胞內(nèi)抗原暴露及宿主免疫系統(tǒng)激活。該期持續(xù)數(shù)周至數(shù)月，以病毒特異性Ｔ淋巴細胞激活為特征，造成靶器官損傷。細胞因子如腫瘤壞死因子、 白細胞介素1和6、病毒抗體及心肌蛋白激活，加速心肌及其收縮功能損傷。多數(shù)心肌炎患者， 通過免疫反應(yīng)清除病毒而減輕心肌損害， 左室功能完全恢復(fù)。也有部分患者，自身免疫過程不依賴心肌病毒存在，導(dǎo)致心肌重構(gòu)形成擴張型心肌病，尸檢結(jié)果顯示，8.6～12%的年輕猝死者合并心肌炎。 對急性心肌炎患者的長期隨訪結(jié)果顯示，3年后擴張型心肌病的患病率達21%。擴張型心肌病合并慢性心力衰竭是心肌炎晚期的主要結(jié)局。所以說心肌炎是潛在的嚴重危害生命的疾病。

心肌炎的病因包括感染性與非感染性兩大類，感染性因素包括細菌、真菌、原蟲、寄生蟲、螺旋體、立克次體及病毒；非感染性因素有以下幾個方面：（1）免疫介導(dǎo)性疾病（變應(yīng)原、同種抗原、自身抗原）；（2）中毒性（藥物、重金屬、生物毒性物質(zhì)、物理損傷等）。其中最常見的病因為病毒感染，隨著聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR） 及原位雜交等分子生物學(xué)技術(shù)應(yīng)用， 分離出與心肌炎相關(guān)性病毒包括腸道病毒、 腺病毒、 細小病毒 B19及人類皰疹病毒6，其他因素少見。目前心肌炎的治療目前尚無特效藥物，由于多數(shù)心肌炎由病毒感染導(dǎo)致，主要是通過抗病毒治療和免疫治療。動物研究結(jié)果顯示，干擾素IFN能夠有效抑制腸道病毒、減少炎癥細胞浸潤，減輕心肌炎心肌損傷、改善左室功能。多項有關(guān)免疫抑制、免疫調(diào)節(jié)、抗炎藥及免疫吸附治療心肌炎研究結(jié)果顯示，免疫抑制治療尚不能作為炎癥性心肌病的標(biāo)準(zhǔn)治療。強的松聯(lián)用硫唑嘌呤或環(huán)孢霉素治療1年，并未顯著降低死亡率、改善心功能。免疫相關(guān)性心肌炎，如特發(fā)性巨細胞性心肌炎、心臟結(jié)節(jié)病、嗜酸粒細胞性心肌炎等，也可考慮免疫抑制劑治療。因此，找到一種合適的藥物，能夠有效的緩解心肌炎癥狀，延長或者存活期是迫切需要解決的一個問題。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供一種白細胞介素33的新用途，具體為在制備治療心肌炎疾病藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明在柯薩奇病毒B3誘導(dǎo)的病毒性心肌炎模型中，利用上調(diào)表達白細胞介素33的DNA質(zhì)粒，在小鼠發(fā)病時期在小鼠體內(nèi)給予白細胞介素33治療，能夠顯著地改善心肌炎癥和心臟功能，提高小鼠存活率，從而達到治療心肌炎疾病的目的。

本發(fā)明進一步公開了一種治療心肌炎疾病的藥物，其活性成分為白細胞介素33。

上述技術(shù)方案中，所述治療心肌炎疾病的藥物還包括藥物輔料。

上述技術(shù)方案中，所述治療心肌炎疾病的藥物為注射制劑。

可以將白細胞介素33克隆入載體，得到表達白細胞介素33的質(zhì)粒，用于治療心肌炎疾病；因此本發(fā)明進一步公開了表達白細胞介素33的質(zhì)粒在制備治療心肌炎疾病藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明還公開了一種治療心肌炎疾病藥物的制備方法，為將白細胞介素33與藥物輔料混合，得到治療心肌炎疾病藥物，優(yōu)選的，所述白細胞介素33以表達白細胞介素33質(zhì)粒的形式存在，即將表達白細胞介素33的質(zhì)粒與藥物輔料混合，得到治療心肌炎疾病藥物。

本發(fā)明中，心肌炎疾病包括感染性與非感染性兩大類，比如病毒引起的心肌炎疾病、自身免疫性心肌炎疾病。

本發(fā)明中，白細胞介素33具體應(yīng)用步驟可以為：

1.建立CVB3誘導(dǎo)的病毒性心肌炎模型

(1) 在Hela細胞中，擴增CVB3（Nancy strain）病毒并且計算病毒滴度；

(2) 在6-8周齡的Balb/c雄性小鼠中，腹腔注射10³TCID₅₀劑量的CVB3病毒；

(3) 在病毒感染的第一天，第三天分別用眼眶靜脈注射的方式，給予每只小鼠 50ug的 白細胞介素33上調(diào)表達的質(zhì)粒， 不表達白細胞介素33的質(zhì)粒載體pDisplay為對照。

2. 治療效果的觀察與統(tǒng)計分析

7天后，檢測小鼠心肌病理損傷指標(biāo)血清肌酸激酶CK的酶活性、心肌組織切片、心臟小動物超聲成像、小鼠存活率，通過T檢測統(tǒng)計分析，來判斷白細胞介素33是否對于病毒性心肌炎有顯著的改善作用。

3.有益效果

本發(fā)明以白細胞介素33為有效成分，公開了一種治療心肌炎的藥物；本發(fā)明在健康Balb/c雄性小鼠中，通過建立心肌炎模型，當(dāng)給予心肌炎小鼠表達白細胞介素33的質(zhì)粒2次，就能明顯的減少炎癥反應(yīng)，改善心臟功能，提高小鼠存活率；本發(fā)明建立的健康Balb/c雄性小鼠模型是廣泛接受并應(yīng)用的心肌炎動物模型，適合臨床應(yīng)用研究；所以本發(fā)明對于心肌炎的藥物研發(fā)具有重要的應(yīng)用推廣價值。

附圖說明

圖1 是攜帶白細胞介素33基因的DNA表達質(zhì)粒pDisplay-IL-33示意圖；

圖2是CVB3感染小鼠心肌損傷血清指標(biāo)肌酸激酶CK的酶活檢測結(jié)果圖；

圖3是CVB3感染小鼠心臟組織切片免疫組化染色和病理評分圖；

圖4是CVB3感染小鼠心臟小動物超聲圖；

圖5是CVB3誘導(dǎo)的小鼠病毒性心肌炎模型生存率圖；

圖6是給予白細胞介素33治療后心肌組織中白細胞介素33的檢測結(jié)果圖；

圖7是CVB3感染小鼠給予白細胞介素33治療后心肌損傷血清指標(biāo)肌酸激酶CK的酶活檢測結(jié)果圖；

圖8是CVB3感染小鼠通過白細胞介素33治療后心臟組織切片免疫組化染色和病理評分圖；

圖9是CVB3感染小鼠通過IL-33治療后心臟二維超聲圖；

圖10是白細胞介素33治療后CVB3感染病毒性心肌炎小鼠的生存率圖。

具體實施方式

實施例一 攜帶白細胞介素33基因的表達質(zhì)粒的構(gòu)建

利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）技術(shù)，設(shè)計引物，以IL-33-pMD-18T質(zhì)粒（義翹神州生物有限公司，貨號： MG50118-M）為模板，擴增白細胞介素33片段， 并克隆至pDisplay (Invitrogen) 的Bgl II(Takara) 和PstI(Takara)位點，獲得表達白細胞介素33的真核表達質(zhì)粒pDisplay-IL-33。

圖1 是攜帶白細胞介素33基因的DNA表達質(zhì)粒pDisplay-IL-33示意圖；白細胞介素33基因通過PCR擴增的方法，從IL-33-pMD-18T質(zhì)粒擴增得到， 然后通過酶切位點Bgl II 和 Pst I，連接到載體pDisplay中，在pDiplay載體中有蛋白分泌的信號肽signal peptide 與白細胞介素33 N端連接，保證細胞表達的白細胞介素33能夠分泌到胞外。

實施例二 CVB3誘導(dǎo)的病毒性心肌炎模型的構(gòu)建

(1) 取6-8周齡的雄性Balb/c小鼠，每組8只， 分別以腹腔注射的方式給每只老鼠10³TCID₅₀劑量的CVB3病毒， PBS組為對照；

(2) 在病毒感染后7天，觀測CVB3小鼠心肌炎指標(biāo)和對照組相比，CK的酶活性明顯增加, 從395IU/L增加到 894IU/L，見圖2，為CVB3感染小鼠心肌損傷血清指標(biāo)肌酸激酶CK的酶活檢測結(jié)果圖；在病毒感染的0, 3, 5, 7天取感染小鼠心臟組織，用蘇木素(Hematoxylin)-伊紅(Eosin)染色浸潤的炎性細胞（圖3A），根據(jù)圖3A，計算免疫組化切片的病理評分（圖3B）；心肌組織切片免疫組化顯示，第3天小鼠心肌組織開始出現(xiàn)少量的炎性細胞浸潤，并且在第5天和第7天逐漸加重，心肌評分也逐漸升高；在病毒感染的0、3、5、7天使用二維超聲M-mode心動圖檢測心臟功能(圖4A)，左心室射血分數(shù)和收縮分數(shù)顯示(圖4B)；心臟小動物超聲成像表明, 檢測結(jié)果表明，從CVB3感染第1天開始，小鼠的心臟功能就開始改變，并持續(xù)到第7天。小鼠心臟射血分數(shù)（EF%）從第0天的86%持續(xù)下降到第7天的55%，而心臟短軸縮短率（FS%）從第0天的50%下降到第7天的30%左右；這說明小鼠心臟的舒張和收縮力減弱，心功能紊亂。

最后統(tǒng)計了小鼠的生存情況，見圖5，相對于正常組，發(fā)病組小鼠從第四天開始死亡，到第七天生存率為37.5%（3/8），這表明我們的小鼠模型建立成功，符合預(yù)期。

實施例三 白細胞介素33對于CVB3誘導(dǎo)的病毒性心肌炎的治療作用

(1) 取6-8周齡的雄性Balb/c小鼠，分2組， 每組8只，以腹腔注射的方式給每只老鼠10³TCID₅₀劑量的CVB3病毒，誘導(dǎo)病毒性心肌炎。在病毒感染的第一天和第三天分別以眼眶靜脈注射的方式給予小鼠pDisplay-IL-33質(zhì)粒50ug/只，注射pDisplay的質(zhì)粒為對照組。在感染的1至7天中，利用白細胞介素33酶聯(lián)免疫吸附反應(yīng)（ELISA）檢測各個時間點心肌研磨組織中白細胞介素33的含量，見圖6。和對照組相比，注射了pDisplay-IL-33質(zhì)粒的小鼠，其心肌組織中白細胞介素33的含量在感染后第三天有了顯著增加，達到650pg/100mg, 并一直延續(xù)到第七天，說明本發(fā)明以注射的方式給予小鼠白細胞介素33的表達質(zhì)粒，能夠在心肌炎發(fā)病過程中提高心肌組織的白細胞介素33的含量。

(2) 取6-8周齡的雄性Balb/c小鼠，分2組， 每組8只，以腹腔注射的方式給每只老鼠10³TCID₅₀劑量的CVB3病毒，誘導(dǎo)病毒性心肌炎。在病毒感染的第一天和第三天分別以眼眶靜脈注射的方式給予小鼠pDisplay-IL-33質(zhì)粒50ug/只，注射pDisplay的質(zhì)粒為對照組。在感染的第7天，觀測小鼠心肌炎指標(biāo)和對照組相比，給予小鼠白細胞介素33治療之后，血清心肌損傷指標(biāo)CK酶活性為517IU/L, 而對照組的CK酶活為928IU/L，見圖7。

在感染后第7天取感染小鼠心臟組織，用蘇木素(Hematoxylin)-伊紅(Eosin)染色浸潤的炎性細胞（圖8A），根據(jù)圖8A，計算免疫組化切片的病理評分（圖8B），Sdudents T test, **P<0.01；小鼠心臟病理切片同樣表明，白細胞介素33治療組小鼠心臟在第7天未見明顯炎癥,對照組相對于對照組小鼠心臟炎癥加重，有大量淋巴細胞浸潤，心臟呈彌漫性壞死，同樣小鼠心臟心肌壞死評分與心臟病理切片一致。

在感染第7天使用二維超聲M-mode心動圖檢測心臟功能(圖9A)，左心室射血分數(shù)(Ejection Fraction)和收縮分數(shù)(Fractional shortening) 顯示(圖9B)；對各組小鼠做小動物心臟超聲實驗，檢測結(jié)果表明，給予白細胞介素33上調(diào)質(zhì)粒組，小鼠心臟舒張收縮正常，M modle下，心臟泵血正常，并且沒有看到心臟體積膨大，而下調(diào)組小鼠，心臟收縮舒張能力減弱，心臟造影明顯，心律不齊，并且心臟體積有膨大趨勢，心臟左心室射血分數(shù)和短軸縮短率變低和心超生理功能吻合。

觀察各組小鼠每天的生存情況，參見圖10；結(jié)果顯示，白細胞介素33上調(diào)組能有效提高小鼠的生存率達到75%，而下調(diào)組小鼠的生存率只有50%。

實施例四 白細胞介素33對于自身免疫性心肌炎的治療作用

取6-8周齡的雄性Balb/c小鼠，分2組， 每組8只，直接給小鼠皮下注射心肌肌球蛋白和完全弗氏佐劑乳化的制劑，誘導(dǎo)小鼠心肌炎發(fā)病。分別在第一天、第十天以眼眶靜脈注射的方式給予小鼠pDisplay-IL-33質(zhì)粒50ug/只，注射pDisplay的質(zhì)粒為對照組。觀察各組小鼠每天的生存情況，結(jié)果顯示，第21天，白細胞介素33注射組能有效提高小鼠的生存率達到78%，而對照組小鼠的生存率只有39%。