本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種載布洛芬緩釋納米微球及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

內(nèi)臟痛是臨床上常見(jiàn)的癥狀，常由機(jī)械性牽拉、痙攣、缺血和炎癥等刺激所致。內(nèi)臟痛的主要特點(diǎn)為定位不準(zhǔn)確，腹痛病人一般不能說(shuō)出疼痛發(fā)生的具體位置，主要原因是由于內(nèi)臟的痛覺(jué)感受器分布要比軀體的稀疏得多，同時(shí)內(nèi)臟感覺(jué)的傳入途徑也比較分散。內(nèi)臟痛另外一個(gè)特點(diǎn)是常常伴有牽涉痛，即內(nèi)臟器官的炎癥疼痛常常有體表某一區(qū)域的疼痛。此外，內(nèi)臟痛常引起不愉快的情緒活動(dòng)，并伴有惡心、嘔吐以及呼吸活動(dòng)等改變。目前，內(nèi)臟痛的具體發(fā)病機(jī)制仍然不清，臨床上也沒(méi)有有效的治療手段。

目前，臨床上常用布洛芬、阿司匹林、保泰松、羅非昔布、塞來(lái)昔布等止痛藥來(lái)緩解內(nèi)臟痛，其中，由于布洛芬的鎮(zhèn)痛效果遠(yuǎn)比阿斯匹林、保泰松和撲熱息強(qiáng)，而倍受消費(fèi)者青睞。但布洛芬的半衰期比較短，鎮(zhèn)痛效果不持久。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種載布洛芬緩釋納米微球及其制備方法和應(yīng)用，本發(fā)明提供的載布洛芬緩釋納米微球具有良好的緩釋效果。

本發(fā)明提供了一種載布洛芬緩釋納米微球，包括載體和負(fù)載在載體上的布洛芬；

所述載體為聚乳酸-羥基乙酸共聚物。

優(yōu)選的，所述聚乳酸-羥基乙酸共聚物的重均分子量為40000～75000。

優(yōu)選的，所述乳酸-羥基乙酸共聚物中具有乳酸結(jié)構(gòu)的重復(fù)單元與具有羥基乙酸結(jié)構(gòu)的重復(fù)單元的摩爾比為(50～80)：(50～20)。

優(yōu)選的，所述布洛芬在緩釋納米微球中的含量為5～20wt％。

優(yōu)選的，所述緩釋納米微球的粒徑為50～200nm。

本發(fā)明提供了一種上述技術(shù)方案所述載布洛芬緩釋納米微球的制備方法，包括以下步驟：

a)、將布洛芬、載體和有機(jī)溶劑混合，得到混合溶液；

b)、將所述混合溶液、乳化劑和水混合，得到乳狀液；

c)、所述乳狀液除去有機(jī)溶劑，得到載布洛芬緩釋納米微球。

優(yōu)選的，所述有機(jī)溶劑包括二氯甲烷和/或氯仿；所述乳化劑包括聚乙烯醇和/或聚乙二醇。

本發(fā)明提供了一種治療內(nèi)臟痛的載布洛芬緩釋制劑，包括上述技術(shù)方案所述的緩釋納米微球和藥學(xué)上可接受的輔料。

優(yōu)選的，所述緩釋制劑為足底注射劑。

上述技術(shù)方案所述的載布洛芬緩釋納米微球在制備足底注射治療內(nèi)臟痛藥物中的應(yīng)用。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供了一種載布洛芬緩釋納米微球及其制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明提供的載布洛芬緩釋納米微球包括載體和負(fù)載在載體上的布洛芬；所述載體為聚乳酸-羥基乙酸共聚物。本發(fā)明提供的載布洛芬緩釋納米微球以聚乳酸-羥基乙酸共聚物作為載體，具有良好的緩釋效果。本發(fā)明還提供了一種治療內(nèi)臟痛的載布洛芬緩釋制劑，所述緩釋制劑包括上述緩釋納米微球和藥學(xué)上可接受的輔料。本發(fā)明提供的緩釋制劑在治療內(nèi)臟痛時(shí)具有持久的陣痛效果。在本發(fā)明提供的優(yōu)選技術(shù)方案中，所述緩釋制劑為足底注射劑，本發(fā)明通過(guò)足底注射來(lái)治療內(nèi)臟痛可以避免口服布洛芬制劑帶來(lái)的相關(guān)副作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明提供的載布洛芬緩釋納米微球可以明顯緩解大鼠的內(nèi)臟痛，并可以持續(xù)緩解疼痛達(dá)到3小時(shí)。

附圖說(shuō)明

為了更清楚地說(shuō)明本發(fā)明實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對(duì)實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡(jiǎn)單地介紹，顯而易見(jiàn)地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的實(shí)施例，對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來(lái)講，在不付出創(chuàng)造性勞動(dòng)的前提下，還可以根據(jù)提供的附圖獲得其他的附圖。

圖1是本發(fā)明實(shí)施例1提供的納米微球粒徑分布圖；

圖2是本發(fā)明實(shí)施例2提供的納米微球粒徑分布圖；

圖3是本發(fā)明實(shí)施例3提供的納米微球粒徑分布圖；

圖4是本發(fā)明實(shí)施例4提供的載布洛芬藥物納米微球的體外釋放曲線圖；

圖5是本發(fā)明實(shí)施例5提供的載布洛芬藥物納米微球的體外釋放曲線圖；

圖6是本發(fā)明實(shí)施例6提供的載布洛芬藥物納米微球的體外釋放曲線圖；

圖7是本發(fā)明實(shí)施例7提供的背根神經(jīng)節(jié)中熒光的分布圖；

圖8是本發(fā)明實(shí)施例8提供的足底注射不同劑量的載布洛芬納米微球的生理鹽水注射劑緩解大鼠內(nèi)臟痛的效果圖；

圖9是本發(fā)明實(shí)施例8提供的足底注射載布洛芬納米微球的生理鹽水注射劑緩解大鼠內(nèi)臟痛的時(shí)程效果圖。

具體實(shí)施方式

下面對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例僅僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例。基于本發(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒(méi)有做出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。

本發(fā)明提供了一種載布洛芬緩釋納米微球，包括載體和負(fù)載在載體上的布洛芬；

所述載體為聚乳酸-羥基乙酸共聚物。

本發(fā)明提供的載布洛芬緩釋納米微球包括載體和負(fù)載在載體上的布洛芬。其中，所述布洛芬又稱為2-(-4-異丁基苯基)丙酸，CAS號(hào)為15687-27-1。

在本發(fā)明中，所述載體為聚乳酸-羥基乙酸共聚物(簡(jiǎn)稱：PLGA)，該共聚物為無(wú)規(guī)共聚物，由乳酸單體和羥基乙酸單體共聚而成，共聚物中包括無(wú)規(guī)排列的具有乳酸結(jié)構(gòu)的重復(fù)單元和具有羥基乙酸結(jié)構(gòu)的重復(fù)單元。在本發(fā)明提供的一個(gè)實(shí)施例中，所述聚乳酸-羥基乙酸共聚物的重均分子量(Mw)為40000～75000，具體可為45000、50000、55000、60000、65000或70000。在本發(fā)明提供的一個(gè)實(shí)施例中，所述乳酸-羥基乙酸共聚物中具有乳酸結(jié)構(gòu)的重復(fù)單元與具有羥基乙酸結(jié)構(gòu)的重復(fù)單元的摩爾比為(50～80)：(50～20)，優(yōu)選為(65～70)：(35～30)。

在本發(fā)明提供的一個(gè)實(shí)施例中，所述布洛芬在載布洛芬緩釋納米微球中的含量為5～20wt％，具體可為6wt％、7wt％、8wt％、9wt％、10wt％、11wt％、12wt％、13wt％、14wt％、15wt％、16wt％、17wt％、18wt％或19wt％。在本發(fā)明提供的一個(gè)實(shí)施例中，所述布洛芬在載布洛芬緩釋納米微球的粒徑為50～200nm，具體可為90～130nm。

本發(fā)明提供的載布洛芬緩釋納米微球以聚乳酸-羥基乙酸共聚物作為載體，具有良好的緩釋效果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明提供的載布洛芬緩釋納米微球可以明顯緩解大鼠的內(nèi)臟痛，并可以持續(xù)緩解疼痛達(dá)到3小時(shí)。

本發(fā)明提供了一種上述技術(shù)方案所述載布洛芬緩釋納米微球的制備方法，包括以下步驟：

a)、將布洛芬、載體和有機(jī)溶劑混合，得到混合溶液；

b)、將所述混合溶液、乳化劑和水混合，得到乳狀液；

c)、所述乳狀液除去有機(jī)溶劑，得到載布洛芬緩釋納米微球。

在本發(fā)明提供的制備方法中，首先將布洛芬、載體和有機(jī)溶劑混合。其中，所述有機(jī)溶劑包括但不限于二氯甲烷和/或氯仿。在本發(fā)明中，所述布洛芬與載體的質(zhì)量比優(yōu)選為1：(5～20)，更優(yōu)選為1：(5～10)，具體可選擇為1：8；所述載體和有機(jī)溶劑的質(zhì)量體積比優(yōu)選為(50～100)mg：(1～10)mL。在本發(fā)明中，所述布洛芬、載體和有機(jī)溶劑混合的溫度優(yōu)選為室溫；本發(fā)明對(duì)混合的時(shí)間沒(méi)有特別限定，可是布洛芬和載體完全溶解在有機(jī)溶劑中即可；本發(fā)明對(duì)混合所用的設(shè)備沒(méi)有特別限定，優(yōu)選本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的搖床。混合完畢后，得到混合溶液。

得到混合溶液后，將所述混合溶液、乳化劑和水混合。其中，所述乳化劑包括但不限于聚乙烯醇(簡(jiǎn)稱：PVA)和/或聚乙二醇。在本發(fā)明中所述聚乙烯醇的重均分子量?jī)?yōu)選為9000～2000000，聚乙二醇的重均分子量?jī)?yōu)選為5000～2000000。在本發(fā)明中，所述乳化劑與所述混合溶液中載體的質(zhì)量比優(yōu)選為(500～1000):(50～100)，具體可選擇為600:100、700:100、710:100、800:100或900:100；所述水與所述混合溶液中載體的體積質(zhì)量比優(yōu)選為(30～100)mL：(50～100)mg，具體可選擇為40mL：100mg、50mL：100mg、53mL：100mg、60mL：100mg、70mL：100mg、80mL：100mg或90mL：100mg。在本發(fā)明中，所述混合溶液、乳化劑和水的混合優(yōu)選在超聲條件下進(jìn)行；所述超聲的功率優(yōu)選為200～500W，具體可為300W或400W；所述超聲的時(shí)間優(yōu)選為1～10min，具體可為3min、4min、5min、6min、7min或8min。

在本發(fā)明提供的一個(gè)實(shí)施例中，所述混合溶液、乳化劑和水優(yōu)選按照以下方式進(jìn)行混合：先將乳化劑和水混合，得到乳化液；再將所述乳化液與所述混合溶液混合。其中，所述乳化液優(yōu)選包括第一乳化液和第二乳化液；所述第一乳化液中乳化劑與水的質(zhì)量體積比優(yōu)選為(0.1～0.5)g：(1～10)mL，具體可為0.21g：3mL；所述第二乳化液中乳化劑與水的質(zhì)量體積比優(yōu)選為(0.1～1)g：(10～100)mL，具體可為0.5g：50mL。在本發(fā)明提供的一個(gè)包括第一乳化液和第二乳化液的實(shí)施例中，先將所述第二乳化液與混合溶液在超聲條件下混合，之后再將混合物與第一乳化液在超聲條件下混合。其中，第一次混合的時(shí)間優(yōu)選為0.5～2min，具體可選擇為1min；第二次混合的時(shí)間優(yōu)選為2～5min，具體可選擇為3min。

所述混合溶液、乳化劑和水混合完畢后，得到乳狀液。得到乳狀液后，將所述乳狀液中的有機(jī)溶劑除去。在本發(fā)明中，除有機(jī)溶劑的方式優(yōu)選為對(duì)所述乳狀液進(jìn)行攪拌，從而使乳狀液中的有機(jī)溶劑揮發(fā)。乳狀液中的有機(jī)溶劑除凈后，得到載布洛芬緩釋納米微球。在本發(fā)明中，優(yōu)選對(duì)得到的載布洛芬緩釋納米微球進(jìn)行水洗，從而提高緩釋納米微球的純凈度。

本發(fā)明提供的方法能夠制得粒徑均一、分散性好的載布洛芬緩釋納米微球，該緩釋納米微球具有良好的緩釋效果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明提供的載布洛芬緩釋納米微球可以明顯緩解大鼠的內(nèi)臟痛，并可以持續(xù)緩解疼痛達(dá)到3小時(shí)。

本發(fā)明提供了一種治療內(nèi)臟痛的載布洛芬緩釋制劑，包括上述技術(shù)方案所述的緩釋納米微球和藥學(xué)上可接受的輔料。

本發(fā)明提供的緩釋制劑包括所述緩釋納米微球和藥學(xué)上可接受的輔料。在本發(fā)明提供的一個(gè)實(shí)施例中，所述緩釋制劑為足底注射劑，所述足底注射劑包括所述緩釋納米微球和溶劑。在本發(fā)明提供的足底注射劑中，所述溶劑包括但不限于生理鹽水或可用于生物體注射的緩沖液，所述緩沖液可選擇磷酸鹽緩沖液；所述緩釋納米微球在足底注射劑中的濃度優(yōu)選為1～100mg/mL，具體可選擇為1mg/mL、2mg/mL、3mg/mL、4mg/mL、5mg/mL、6mg/mL、7mg/mL、8mg/mL、9mg/mL、10mg/mL、11mg/mL、12mg/mL、13mg/mL、14mg/mL、15mg/mL、20mg/mL、25mg/mL、30mg/mL、35mg/mL、40mg/mL、45mg/mL、50mg/mL、55mg/mL、60mg/mL、65mg/mL、70mg/mL、75mg/mL、80mg/mL、85mg/mL、90mg/mL或95mg/mL。

本發(fā)明提供的緩釋制劑在治療內(nèi)臟痛時(shí)具有持久的陣痛效果。在本發(fā)明提供的優(yōu)選技術(shù)方案中，所述緩釋制劑為足底注射劑，本發(fā)明通過(guò)足底注射來(lái)治療內(nèi)臟痛可以避免口服布洛芬制劑帶來(lái)的相關(guān)副作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明提供的載布洛芬緩釋制劑可以明顯緩解大鼠的內(nèi)臟痛，并可以持續(xù)緩解疼痛達(dá)到3小時(shí)。

本發(fā)明提供的上述技術(shù)方案具有如下優(yōu)勢(shì)之一：

1)、本發(fā)明使用PLGA為制備納米粒子載體，PLGA是一種可降解的功能高分子有機(jī)化合物，無(wú)毒、具有良好的生物相容性、良好的成囊和成膜的性能，被廣泛應(yīng)用于制藥、醫(yī)用工程材料和現(xiàn)代化工業(yè)領(lǐng)域。在美國(guó)PLGA通過(guò)FDA認(rèn)證，被正式作為藥用輔料收錄進(jìn)美國(guó)藥典。

2)、本發(fā)明載布洛芬藥物納米微球以PLGA作為載體，可以將藥物布洛芬以緩釋的方式釋放。PLGA作為載體，能夠有效延長(zhǎng)藥物布洛芬的半衰期。我們的研究顯示載布洛芬藥物納米微球可以明顯緩解大鼠的內(nèi)臟痛，并可以持續(xù)緩解疼痛達(dá)到3小時(shí)；

3)、本發(fā)明載布洛芬藥物納米微球可避免藥物布洛芬本身的高劑量，毒性導(dǎo)致的副作用；

4)、本發(fā)明載布洛芬藥物納米微球具有很好的生物相容性，無(wú)毒性，生物化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定；

5)、本發(fā)明制備方法制得的納米粒子粒徑較均一，分散性好。

6)、本發(fā)明獨(dú)特的給藥途徑—足底注射藥物，其方法簡(jiǎn)單，易操作；

7)、本發(fā)明通過(guò)將載布洛芬藥物納米微球作為止痛藥劑注射足底來(lái)治療內(nèi)臟痛，可避免長(zhǎng)期口服布洛芬?guī)?lái)的腎功能衰竭，消化不良等副作用。

為更清楚起見(jiàn)，下面通過(guò)以下實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。

實(shí)施例1

載布洛芬緩釋納米微球的制備

步驟1)

稱取100mg PLGA(lactide:glycolide＝65:35(n:n)，Mw＝40000～75000)和15mg布洛芬，然后分別加入到1mL的二氯甲烷中，室溫于搖床上溶解混合，得到含PLGA和布洛芬的混合溶液；稱取0.5g，0.21gPVA(Mw＝9000～2000000)分別加到50mL和3mL的雙蒸水中，制備1g/100mL和7g/100mL的PVA水溶液。

步驟2)

將步驟1)制取的PLGA和布洛芬的混合溶液與7g/100mL的PVA水溶液混合并用超聲破碎儀超聲1分鐘(功率300W)產(chǎn)生乳狀液，然后將乳狀液加入步驟1)制取的1g/100mL的PVA水溶液中繼續(xù)超聲3分鐘(功率300W)，然后在攪拌器上持續(xù)攪拌24小時(shí)充分去除二氯甲烷，最后用雙蒸水洗滌兩次(13000rpm離心)，最后重懸到2mL雙蒸水中，得到負(fù)載布洛芬的納米微球。

通過(guò)動(dòng)態(tài)光散射測(cè)定上述納米微球的粒徑分布，結(jié)果如圖1所示，圖1是本發(fā)明實(shí)施例1提供的納米微球粒徑分布圖，通過(guò)圖1可以看出，納米微球的粒徑分布在92～185nm。

通過(guò)高效液相色譜測(cè)定上述納米微球的載藥量，結(jié)果為11wt％。

實(shí)施例2

載布洛芬緩釋納米微球的制備

步驟1)

稱取100mg PLGA(lactide:glycolide＝65:35(n:n)，Mw＝40000～75000)和10mg布洛芬，然后分別加入到1mL的二氯甲烷中，室溫于搖床上溶解混合，得到含PLGA和布洛芬的混合溶液；稱取0.5g，0.21g PVA(Mw＝9000～2000000)分別加到50mL和3mL的雙蒸水中，制備1g/100mL和7g/100mL的PVA水溶液。

步驟2)

將步驟1)制取的PLGA和布洛芬的混合溶液與7g/100mL的PVA水溶液混合并用超聲破碎儀超聲1分鐘(功率300W)產(chǎn)生乳狀液，然后將乳狀液加入步驟1)制取的1g/100mL的PVA水溶液中繼續(xù)超聲3分鐘(功率300W)，然后在攪拌器上持續(xù)攪拌24小時(shí)充分去除二氯甲烷，最后用雙蒸水洗滌兩次(13000rpm離心)，最后重懸到2mL雙蒸水中，得到負(fù)載布洛芬的納米微球。

通過(guò)動(dòng)態(tài)光散射測(cè)定上述納米微球的粒徑分布，結(jié)果如圖2所示，圖2是本發(fā)明實(shí)施例2提供的納米微球粒徑分布圖，通過(guò)圖2可以看出，納米微球的粒徑分布在85～180nm。

通過(guò)高效液相色譜測(cè)定上述納米微球的載藥量，結(jié)果為8wt％。

實(shí)施例3

載布洛芬緩釋納米微球的制備

步驟1)

稱取100mg PLGA(lactide:glycolide＝65:35(n:n)，Mw＝40000～75000)和20mg布洛芬，然后分別加入到1mL的二氯甲烷中，室溫于搖床上溶解混合，得到含PLGA和布洛芬的混合溶液；稱取0.5g，0.21gPVA(Mw＝9000～2000000)分別加到50mL和3mL的雙蒸水中，制備1g/100mL和7g/100mL的PVA水溶液。

步驟2)

將步驟1)制取的PLGA和布洛芬的混合溶液與7g/100mL的PVA水溶液混合并用超聲破碎儀超聲1分鐘(功率300W)產(chǎn)生乳狀液，然后將乳狀液加入步驟1)制取的1g/100mL的PVA水溶液中繼續(xù)超聲3分鐘(功率300W)，然后在攪拌器上持續(xù)攪拌24小時(shí)充分去除二氯甲烷，最后用雙蒸水洗滌兩次(13000rpm離心)，最后重懸到2mL雙蒸水中，得到負(fù)載布洛芬的納米微球。

通過(guò)動(dòng)態(tài)光散射測(cè)定上述納米微球的粒徑分布，結(jié)果如圖3所示，圖3是本發(fā)明實(shí)施例3提供的納米微球粒徑分布圖，通過(guò)圖3可以看出，納米微球的粒徑分布在90～185nm。

通過(guò)高效液相色譜測(cè)定上述納米微球的載藥量，結(jié)果為13wt％。

實(shí)施例4

緩釋納米微球的體外釋放曲線的檢測(cè)試驗(yàn)

在37℃下，分別將100mg實(shí)施例1制備的載布洛芬緩釋納米微球和10mg布洛芬加入到10mL的磷酸鹽緩沖液中(0.01M，PH＝7.4)透析，每隔2小時(shí)進(jìn)行取樣，利用高效液相色譜(HPLC，C-18柱，流動(dòng)相為甲醇：乙腈：磷酸二氫鈉溶液(0.02mol/L)＝50：25：25，流動(dòng)相用磷酸調(diào)節(jié)pH值至3.0±0.05，檢測(cè)波長(zhǎng)為263nm，流速為1.0mL/min)測(cè)定布洛芬的濃度，并繪制布洛芬釋放曲線，如圖4所示，圖4是本發(fā)明實(shí)施例4提供的載布洛芬藥物納米微球的體外釋放曲線圖。通過(guò)圖4可以看出，相比于布洛芬，實(shí)施例1提供的載布洛芬納米微球具有良好的緩釋效果。

實(shí)施例5

緩釋納米微球的體外釋放曲線的檢測(cè)試驗(yàn)

在37℃下，分別將100mg實(shí)施例2制備的載布洛芬緩釋納米微球和10mg布洛芬加入到10mL的磷酸鹽緩沖液中(0.01M，PH＝7.4)透析，每隔2小時(shí)進(jìn)行取樣，利用高效液相色譜(HPLC，C-18柱，流動(dòng)相為甲醇：乙腈：磷酸二氫鈉溶液(0.02mol/L)＝50：25：25，流動(dòng)相用磷酸調(diào)節(jié)pH值至3.0±0.05，檢測(cè)波長(zhǎng)為263nm，流速為1.0mL/min)測(cè)定布洛芬的濃度，并繪制布洛芬釋放曲線，如圖5所示，圖5是本發(fā)明實(shí)施例5提供的載布洛芬藥物納米微球的體外釋放曲線圖。通過(guò)圖5可以看出，相比于布洛芬，實(shí)施例2提供的載布洛芬納米微球具有良好的緩釋效果。

實(shí)施例6

緩釋納米微球的體外釋放曲線的檢測(cè)試驗(yàn)

在37℃下，分別將100mg實(shí)施例3制備的載布洛芬緩釋納米微球和10mg布洛芬加入到10mL的磷酸鹽緩沖液中(0.01M，PH＝7.4)透析，每隔2小時(shí)進(jìn)行取樣，利用高效液相色譜(HPLC，C-18柱，流動(dòng)相為甲醇：乙腈：磷酸二氫鈉溶液(0.02mol/L)＝50：25：25，流動(dòng)相用磷酸調(diào)節(jié)pH值至3.0±0.05，檢測(cè)波長(zhǎng)為263nm，流速為1.0mL/min)測(cè)定布洛芬的濃度，并繪制布洛芬釋放曲線，如圖6所示，圖6是本發(fā)明實(shí)施例6提供的載布洛芬藥物納米微球的體外釋放曲線圖。通過(guò)圖6可以看出，相比于布洛芬，實(shí)施例3提供的載布洛芬納米微球具有良好的緩釋效果。

實(shí)施例7

雙熒光示蹤劑標(biāo)記特異性支配足底和結(jié)腸的背根神經(jīng)節(jié)(DRG)神經(jīng)元

以正常的雄性大鼠(體重180g左右)作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，首先用水合氯醛(360mg/kg)將大鼠麻醉，接著在無(wú)菌條件下將10μL熒光示蹤劑DiI(1,19-dioleyl-3,3,39,3-tetramethylindocarbocyanine methanesulfonate；Invitrogen,Carlsbad,CA)分5個(gè)點(diǎn)注射到結(jié)腸腸壁上(每個(gè)點(diǎn)2μL)，同時(shí)將10μL的熒光金(FG)分5個(gè)點(diǎn)注射大鼠后足底(每個(gè)點(diǎn)2μL)，注射完畢待大鼠蘇醒后于正常條件下(室溫24℃，濕度50-60％，通風(fēng)良好，人工晝夜(12h/12h)，自由攝食攝水)喂養(yǎng)一周，然后麻醉大鼠，灌流取DRGs，由于支配足底的背根神經(jīng)節(jié)主要分布在腰段L2-6,而支配結(jié)腸的背根神經(jīng)節(jié)主要分布在胸段T13,腰段L1和L2，所以取材主要取T13-L6DRGs。然后，行冰凍切片觀察熒光在背根神經(jīng)節(jié)中的分布情況。觀察結(jié)果如圖7所示，圖7是本發(fā)明實(shí)施例7提供的背根神經(jīng)節(jié)中熒光的分布圖，圖7中，T13、L1、L2、L6表示不同背根神經(jīng)節(jié)的編號(hào)，左欄為FG熒光的分布情況，中間欄為DiI熒光的分布情況，右欄為FG熒光和DiI熒光的疊加圖。通過(guò)圖7可知，在T13、L1、L2、L6均存在雙色熒光標(biāo)記的神經(jīng)元，說(shuō)明同時(shí)支配足底和結(jié)腸的神經(jīng)元主要分布在T13、L1、L2、L6的背根神經(jīng)節(jié)中。也就是說(shuō)，支配內(nèi)臟的神經(jīng)纖維與支配足底的神經(jīng)纖維可由背根神經(jīng)節(jié)中同一個(gè)神經(jīng)元發(fā)出，即在背根神經(jīng)節(jié)中有些神經(jīng)元可以同時(shí)支配內(nèi)臟和足底。所以，可通過(guò)將藥物注射足底，來(lái)降低同時(shí)支配內(nèi)臟和足底的神經(jīng)元興奮性，達(dá)到治療內(nèi)臟痛的目的。

實(shí)施例8

鞘內(nèi)注射載布洛芬緩釋納米微球的生理鹽水注射劑緩解大鼠內(nèi)臟痛試驗(yàn)

給予出生第10天SD大鼠足底注射完全弗氏佐劑CFA，可以誘發(fā)成年大鼠的AWR(腹壁撤回反射)評(píng)分顯著升高，即表現(xiàn)為內(nèi)臟痛覺(jué)過(guò)敏，且這種作用可以從第6周持續(xù)到第12周。

選取模型成功大鼠，后爪足底注射不同劑量的載布洛芬緩釋納米微球的生理鹽水注射劑，檢測(cè)其緩解內(nèi)臟痛敏效果。檢測(cè)成年大鼠內(nèi)臟痛反應(yīng)主要通過(guò)腹壁撤回反射(Abdominalwithdrawalreflex,AWR)評(píng)分來(lái)測(cè)量痛閾。首先將大鼠用乙醚適度麻醉，迅速將涂有石蠟油的乳膠擴(kuò)張氣囊小心地插入大鼠的結(jié)直腸，插入長(zhǎng)度約8cm。用膠帶把大鼠尾巴固定在木板上，固定好后讓大鼠清醒并適應(yīng)30分鐘，以待測(cè)試。用水銀檢壓計(jì)分別給以不同壓力充氣。結(jié)直腸擴(kuò)張(CRD)可引起大鼠腹部肌肉的收縮，這稱為內(nèi)臟收縮反應(yīng)(Visceral Motor Responses,VMR)。通過(guò)CRD擴(kuò)張結(jié)直腸進(jìn)行腹部撤回反射AWR評(píng)分方法檢測(cè)內(nèi)臟痛覺(jué)的反應(yīng)性，CRD：用臺(tái)式血壓計(jì)將氣球快速加壓至恒壓：20、40、60、80mmHg，2min一次，一次停留20s。

用AWR評(píng)分方法檢測(cè)大鼠結(jié)腸痛閾：0，沒(méi)有可察覺(jué)的異常表現(xiàn)；1，頭部輕微僵直而身體沒(méi)有明顯異常；2，側(cè)腹部收縮；3，下腹壁抬離桌面；4，下腹部拱起。根據(jù)大鼠在不同壓力擴(kuò)張情況下的反應(yīng)給予相應(yīng)的分?jǐn)?shù)，相同壓力下分值越高說(shuō)明大鼠對(duì)疼痛越敏感。

將不同計(jì)量的實(shí)施例1制備的載布洛芬緩釋納米微球加入到生理鹽水中，分別獲得布洛芬含量為0.14mg/0.1mL、0.4mg/0.1mL、1.2mg/0.1mL的載布洛芬緩釋納米微球的生理鹽水注射劑。分別足底注射1.2mg布洛芬，以及0.1mL上述載布洛芬緩釋納米微球的生理鹽水注射劑，注射后進(jìn)行結(jié)直腸擴(kuò)張(20、40、60、80mmHg)刺激，用AWR評(píng)分方法觀察大鼠的內(nèi)臟痛反應(yīng)變化和時(shí)程效應(yīng)。結(jié)果如圖8和圖9所示，圖8是本發(fā)明實(shí)施例8提供的足底注射不同劑量的載布洛芬納米微球的生理鹽水注射劑緩解大鼠內(nèi)臟痛的效果圖，圖9是本發(fā)明實(shí)施例8提供的足底注射載布洛芬納米微球的生理鹽水注射劑緩解大鼠內(nèi)臟痛的時(shí)程效果圖。可見(jiàn)，注射0.1mL布洛芬含量1.2mg/0.1mL的載布洛芬緩釋納米微球的生理鹽水注射劑可以明顯翻轉(zhuǎn)大鼠的內(nèi)臟痛，并可以持續(xù)緩解疼痛達(dá)到3小時(shí)。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。