本發明涉及合成生物學，基因工程技術和生物材料領域，特別是涉及一種枯草芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌產生的生物膜及其構建方法和應用。

背景技術：

生物膜是由微生物、多糖、DNA、蛋白質和脂類等組成的復合體，生物膜通常與致病菌的感染和疾病相關聯，很多菌分泌的生物膜是造成感染的罪魁禍首，引起抗藥性并且難以去除。血鏈球菌通過導尿管注射到兔子體內，在30分鐘內即可在滅過菌的導尿管表面上吸附，隨后在血栓附近有鏈球菌菌落形成，并且觀察到被纖維化膠囊包圍，可見鏈球菌生物膜對感染及阻止白細胞的作用。同樣囊性纖維化研究發現條件致病菌銅綠假單胞菌的生物膜形成與抗藥性產生是同時發生的。

從材料和納米科學的觀點出發，生物膜中的蛋白成份通常富含疏水蛋白和淀粉樣蛋白纖維等成份；淀粉樣蛋白具有很強的機械性能，突出的化學和熱穩定性，因此賦予生物膜優良的環境耐受性，而這些特性幫助微生物抵御外界惡劣的環境，獲取有限的營養進行生存。實驗證明，生物膜的這些特征如被正當加以利用，在環境修復、生物導電和生物防治等方面有廣泛的應用。

生物膜在廢水處理領域已有近百年的研究和應用，因為生物膜能有效吸附重金屬和有機微污染物，復合生物修復比單一微生物或單一物理化學方法更為有效。固定枯草芽孢桿菌生物膜的反應器，能更有效地將有害的六價鉻還原成毒性較小的三價鉻。導電細菌的生物膜對于微生物燃料電池有著重要作用。有研究表明，地桿菌生物膜的密度與導電率為直接正相關。因此新發展的一種策略是構建人工生物膜進行導電，目前已取得不少進展。文獻報道表明，通過基因工程改造提高施瓦氏菌的生物膜形成從而促進導電率提高了3.4倍。

以前報道的生物膜展示技術(比如大腸桿菌生物膜展示技術)是基于革蘭氏陰性菌。由于其自身分泌系統的限制(特別是雙層膜的限制)，利用生物膜展示融合肽段不能超過50個氨基酸，再加上大腸桿菌的生物安全隱患，大大阻礙了活體生物膜功能化材料的應用。

技術實現要素：

本發明的目的是提供一種分泌能力更強、功能化更全、生物性更安全的枯草芽孢桿菌、生物膜及其構建方法和應用。

為了達到上述目的，本發明提供了一種枯草芽孢桿菌，其特征在于，其能夠分泌TasA-R蛋白，R為功能基團。

進一步地，所述的R為肽或蛋白。

更進一步地，所述的R為短肽、粘性蛋白、熒光報告蛋白、環境降解酶、氫化酶、固氮酶或金屬或半導體綁定蛋白等。

更進一步地，R為包含300個以上氨基酸的蛋白。

更進一步地，R包括組氨酸標簽histag、spytag、snooptag、CBD、GFP、表皮生長因子(EGF，)、磁顆粒模板蛋白Mms6、貽貝足絲蛋白Mefp3和Mefp5、貽貝足絲蛋白Mgfp3和Mgfp5、紅色熒光蛋白蛋白Mcherry、熒光蛋白Maple3、重金屬結合蛋白MTs、鉛結合蛋白PbrR、放射性鈾結合蛋白SUP、有機磷水解酶OPH、塑料降解酶PETase和MHETase、鎳鐵氫化酶、鐵鐵氫化酶或固氮酶。

本發明還提供了一種枯草芽孢桿菌生物膜，其特征在于，其含有所述的TasA-R蛋白。

本發明還提供了上述的枯草芽孢桿菌的構建方法，其特征在于，包括以下步驟：將產生物膜的原始枯草芽孢桿菌的淀粉樣蛋白的編碼基因tasA或淀粉樣蛋白的編碼基因tasA以及產生胞外多糖的編碼基因簇epsA-O和生物膜抑制子編碼基因sinR中的至少一種在基因組上進行敲除，構建枯草芽孢桿菌突變株，轉入TasA-R表達質粒，得到枯草芽孢桿菌。

進一步地，所述的TasA-R表達質粒為pHT01-tasA、pHT01-tasA-Histag、pHT01-tasA-spytag、pHT01-tasA-mgfp3-Histag、pHT01-tasA-mgfp5-Histag、pHT01-tasA-mefp3-Histag、pHT01-tasA-mefp5-Histag、pHT01-tasA-mms6-Histag、pHT01-tasA-mts-Histag、pHT01-tasA-pbrR-Histag、pHT01-tasA-sup-Histag、pHT01-tasA-mcherry-Histag、pHT01-tasA-maple3-Histag、pHT01-tasA-OPH-Histag或pHT01-tasA-OPH。

進一步地，所述的TasA-R表達質粒能夠調控表達TasA-R融合蛋白。

更進一步地，所述的調控方法為異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)誘導、營養誘導、溫控、光控或群體感應調控。

本發明還提供了上述的枯草芽孢桿菌的另一種構建方法，其特征在于，包括以下步驟：構建能夠表達TasA-R蛋白的基因組替換整合質粒，將基因組替換整合質粒轉入大腸桿菌菌株，從大腸桿菌中提取整合質粒，轉入枯草桿菌菌株；或者，將產生物膜的原始枯草芽孢桿菌的淀粉樣蛋白的編碼基因tasA或淀粉樣蛋白的編碼基因tasA以及產生胞外多糖的編碼基因簇epsA-O和生物膜抑制子編碼基因sinR中的至少一種在基因組上進行敲除，構建枯草芽孢桿菌突變株，構建Sender質粒和Receiver質粒，將Sender質粒和Receiver質粒分別整合到構建枯草芽孢桿菌突變株的基因組中，得到Sender菌株及Receiver菌株，將能夠表達TasA-R蛋白的基因插入到受QS信號分子活化的P3啟動子下游進行表達，將表達質粒轉化Receiver菌株。

進一步地，所述的基因組替換整合質粒為pMAD-tasA-histag，pMAD-tasA-mefp3-histag，pMAD-tasA-mefp5-histag，pMAD-tasA-mcherry-histag，pMAD-tasA-oph或pMAD-lacI-Pgrac-tasA-histag；所述的Sender質粒和Receiver質粒為pDG-P2-agrBDCA和pDG-P2-agrCA，所述的表達質粒為pMK-P3-tasA-histag、pMK-P3-tasA-mcherry-histagp、MK-P3-tasA-mefp3-histag、pMK-P3-tasA-mefp5-histag或pMK-P3-tasA-oph。

本發明還提供了上述的枯草芽孢桿菌或其形成的生物膜在生物催化、生物標記、制備生物材料、生物修復和生物粘性材料以及生物醫藥和能源領域中的應用。

與現有技術相比，本發明的主要技術優勢和特點包括以下幾方面：

1.本發明通過基因工程手段對細菌生物膜的主要成分(淀粉樣蛋白)進行基因改性或基因融合，從而引入具有新功能的肽段或蛋白質。由于目標蛋白能夠直接以細胞外基質分泌并在生物膜上展示，因而規避了上述傳統蛋白表達和提純蛋白所帶來的各種問題。

2.本發明不僅能夠保證所展示的短肽或蛋白質具有相應的蛋白活性和功能性。而且相應蛋白的化學和熱穩定性也被證明大大增加。

3.由于生物膜直接和活體細胞相關聯，因此該技術能夠利用細胞自身對環境的感應(比如pH、溫度和化學誘導物)或者通過基因環路對細胞的調控(比如基因光控環路)，實現功能化短肽/蛋白在時間和空間上的可控表達和分泌，從而最后實現智能化材料或酶催化的概念。

4.活體細胞生產生物膜的條件只需要包含最少營養的溶液(minimum media condition)并在有氧條件下培養，具有自我繁殖和再生等特點，而且很容易實現大規模的生產。

5、工程的生物膜具有典型的凝膠材料特性(彈性模量＞損耗模量)，具有自我再生(self-regeneration)和自我修復功能(self-healing)，可以作為凝膠材料在不同的領域進行應用。

6.該活體細胞生物膜展示技術以枯草芽孢桿菌生物膜淀粉樣蛋白為基礎，和已報道的基于大腸桿菌生物膜的淀粉樣蛋白展示技術相比有以下獨特的技術優勢：

a)已報道的大腸桿菌生物膜的淀粉樣蛋白展示技術，只能融合并分泌不能超過59個氨基酸的肽段和蛋白質，大大限制了應用范圍；而枯草芽孢桿菌生物膜淀粉樣蛋白展示技術，能融合并分泌超過包含337個氨基酸的功能化蛋白。

b)和大腸桿菌相比，枯草芽孢桿菌屬于一般公認安全(Generally Recognized As Safe，GRAS)微生物范疇，其生物安全性更好，因而大大拓寬了其在醫藥、環境、能源和材料等方面的應用。

7、本發明通過對枯草芽孢桿菌生物膜的主要蛋白，即TasA淀粉樣蛋白的基因改造和調控，實現枯草芽孢桿菌生物膜的展示平臺。該平臺較以往的報道具有分泌能力更強、功能化更全、生物安全性更高等優點。枯草芽孢桿菌生物膜的展示技術在生物催化、生物修復和生物粘性材料等領域有廣泛的應用。

細菌枯草芽孢桿菌三基因突變株Bacillus subtilis ΔtasAΔsinRΔeps(002)于2016年6月6日保存在中國普通微生物菌種保藏中心(CGMCC)，編號：12600，地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號。

附圖說明

圖1為本發明的生物膜平臺觀察圖，其中a為枯草芽孢桿菌3610野生型分泌的生物膜平臺觀察圖；b為tasA基因敲除后的單突變菌株的生物膜平臺觀察圖；c為tasA和sinR敲除后的雙突變菌株的生物膜平臺觀察圖；d為tasA、sinR、eps等基因簇同時敲除后的三突變菌株的生物膜平臺觀察圖；

圖2為本發明的野生型、突變株和攜帶質粒的基因工程菌的生物膜的纖維情況對比圖，其中a為枯草芽孢桿菌野生型的生物膜的纖維顯示圖；b～d分別為敲掉基因的單突變株、雙突變株和三突變株的生物膜的纖維顯示圖，e為轉入空質粒的枯草芽孢桿菌基因工程菌的生物膜的纖維顯示圖；f～1為攜帶融合質粒并經過IPTG誘導的枯草芽孢桿菌基因工程菌的生物膜的纖維顯示圖；m～p為攜帶融合質粒未經過IPTG誘導的枯草芽孢桿菌基因工程菌的生物膜的纖維顯示圖；

圖3為本發明的枯草芽孢桿菌生物膜平臺及攜帶tasA-R融合質粒的基因工程菌生物膜平臺的掃描電鏡圖對比圖，其中a為枯草芽孢桿菌野生型的生物膜平臺電鏡圖；b～c為敲掉基因的單突變株和雙突變株的生物膜平臺電鏡圖；d為轉入空質粒的基因工程菌的生物膜平臺電鏡圖；e～1為攜帶融合質粒的基因工程菌的生物膜平臺電鏡圖；

圖4為本發明的基因工程菌表達生物膜TasA-R的免疫電鏡觀察圖；

圖5為構建的融合質粒的圖譜；

圖6為群體感性系統QS調控的TasA-Histag生物膜綁定量子點的熒光圖；

圖7為生物膜與AuNPs共培養的TEM對比圖，其中，a為攜帶質粒的基因工程菌與Ni-NTA AuNPs共培養的TEM圖，b為枯草芽孢桿菌與AuNPs共培養的TEM圖，c為綁定了AuNPs的生物膜催化對硝基苯酚還原反應的效果圖；

圖8為生物膜綁定量子點作為生物催化的測定圖，其中a為TasA-Histag綁Cd_0.8Zn_0.2S等定量子點的TEM圖，b為生物膜降解有機染料的效果圖；

圖9為攜帶pHT-tasA-mcherry質粒的基因工程菌有無IPTG誘導時，生物膜通過共聚焦熒光顯微鏡觀察圖；

圖10為攜帶pHT-tasA-spytag質粒的基因工程菌有無IPTG誘導時，生物膜與蛋白Mcherry-spycatcher結合后的熒光顯微鏡觀察圖；

圖11為攜帶pHT-tasA-oph質粒的基因工程菌有無IPTG誘導時對有機磷降解的曲線圖。

圖12為枯草芽孢桿菌中SinR抑制生物膜的編碼基因的示意圖。

圖13為本發明的原理圖。

具體實施方式

下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。此外應理解，在閱讀了本發明講授的內容之后，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。

本發明提供的基因工程枯草芽孢桿菌生物膜展示技術主要是針對枯草芽孢桿菌的生物膜蛋白主要成分淀粉樣蛋白tasA進行基因融合或改造。組成枯草芽孢桿菌生物膜的主要成分如表1所示。

表1枯草芽孢桿菌生物膜組成相關的基因(參見Vlamakis H.，Chai Y.，Beauregard P.，et al.Sticking together：building a biofilm the Bacillus subtilis way.Nature review Microbiology.11：157-168(2013).)：

SinR是一個雙組份調控蛋白，是生物膜編碼基因的抑制子，如圖12所示。

如圖12示意圖所示，敲除了生物膜編碼基因的ΔtasA單突變或ΔtasAΔeps以及ΔtasAΔepsΔsinR等多突變株，在有誘導物存在時，能外源表達并分泌TasA-R融合蛋白。TasA為來源于枯草芽孢桿菌的淀粉樣蛋白，R為功能基團，中間用八個氨基酸的linker連接。TasA-R融合蛋白分泌表達并在生物膜上自組裝成纖維，形成具有可調控的納米生物材料生物膜。TasA-R也可以直接整合在基因組上而非通過攜帶質粒表達。R代表圖中描述的幾類功能基團，包括可結合金屬或蛋白的短肽如Histag、Spytag和Mms6等，也有粘性蛋白Mefp3和Mefp5，熒光報告子Mcherry和Maple3以及有機磷降解酶OPH等，可在生物催化、生物修復和生物粘性材料等領域有應用。

根據R的不同功能，表達和分泌的蛋白分為以下幾類：

(1)各種100個氨基酸以內的短肽：比如Histag，Spytag，CBD，EGF，Mms6以及其他細胞粘性蛋白等。Histag為組氨酸標簽，能親和結合多種金屬離子如鈷、鎳、金、銀等。Spytag為來自于釀膿鏈球菌(Streptococcus pyogenes)的一個短肽(peptide)，能特異性地與它的蛋白伙伴Spycatcher反應，當它們分別融合不同基團時也能進行體外反應。幾丁質結合域(Chitin binding domain，CBD)通常為30-43個氨基酸的短肽，含有保守的甘氨酸和半胱氨酸殘基。幾丁質為廣泛存在于自然界的一種含氮多糖類生物性高分子，TasA-CBD能結合幾丁質，用于構建生物復合材料和3D打印等。表皮生長因子(Epidermal growth factor，EGF)是最初從小鼠的下頜下腺提取的一種含有53個氨基酸殘基的單鏈多肽，對調節細胞生長、增殖和分化起著重要作用。Mms6為59個氨基酸的短肽，可以作為磁納米顆粒結合模板。

(2)粘性蛋白作為生物粘性材料：Mefp3，Mefp5，Mgfp3and Mgfp5等。如圖4中的pHT-tasA-mefp3和pHT-tasA-mefp5的圖譜。Mussel foot protein(Mefp3)和Mefp5來源于貽貝的足絲蛋白。如圖2中的i和l電鏡觀察圖所示，融合了Mefp3和Mefp5的TasA都可以分泌到細胞外基質形成纖維。融合了Mfp3/5的蛋白能夠賦予生物膜水下粘合特性。

(3)大于200個氨基酸的熒光報告蛋白：比如Mcherry，GFP和Maple3等。圖5為pHT-tasA-mcherry和pHT-tasA-maple3的圖譜。融合了Mcherry和Maple3的生物膜具有熒光特性。

(4)環境降解酶：比如重金屬結合蛋白Metallothioneins(MTs，約63個氨基酸)、鉛結合蛋白(PbrR，約144個氨基酸)、放射性鈾結合蛋白(Uranyl-binding Protein，UP，約79個氨基酸)和有機磷水解酶(OPH，約340個氨基酸)和塑料降解酶等。圖5包括pHT-tasA-oph的圖譜。融合了有機磷水解酶OPH的tasA能以對氧磷、對硫磷和甲級對硫磷等有機磷為底物降解成對硝基苯酚。

最近從細菌中新發現的能降解聚(乙烯對苯二甲酸乙二醇酯(PET))的PET酶(PETase)和中間產物單(2-羧乙基)對苯二甲酸的降解酶(MHETase)，這兩個酶能有效將PET降解成對苯二甲酸和乙二醇兩個單體。因此PETase(290個氨基酸)和MHETase(603個氨基酸)都可以與tasA融合作為環境降解生物膜應用。

此外，生物膜在生物能源上有廣泛的應用，因此一些能源相關的酶比如氫化酶和固氮酶等也可以融合在tasA纖維上。氫化酶是自然界微生物體內存在的一種金屬酶，它能夠催化氫氣的氧化或者質子的還原，包括鎳鐵氫化酶和鐵鐵(唯鐵Iron-only)氫化酶等。其中比較受關注的是唯鐵氫化酶，主要催化質子的還原生成氫氣作為清潔、高效無污染的可再生能源。大部分氫化酶在300-600個氨基酸內，可以通過tasA融合在枯草芽孢桿菌中分泌表達。固氮酶(nitrogenase)固氮酶是一種能夠將分子氮還原成氨的酶，這類蛋白(MoFeprotein、NifH、NifU、NifM和NifS)大小約300～400個氨基酸，在實驗證明可分泌的范圍內。

以下實施例中，如無特殊說明，PCR擴增采用的反應體系(50μl)包括以下成份：

PCR反應條件為：98℃預變性20s，98℃10s，53℃30s，72℃30s，35個循環，最后72℃延伸2min，以去離子水為陰性對照。

以下實施例中，如無特殊說明，各抗生素溶液的配制方法為：羧芐青霉素(macklin，C805408)，紅霉素(生工生物，A600192)，氯霉素(阿拉丁，C100331)，壯觀霉素(sigma，S4014-5G-9)分別配制成100mg/ml的水溶液，10mg/ml的乙醇溶液，10mg/mL的乙醇溶液和100mg/mL的水溶液于-20℃保存。用時在融化的LB固體培養基中加少量于稀釋至所需濃度后倒平板。

以下實施例中，如無特殊說明，帶藍白斑篩選液的平板的制備方法為：在相應平板上涂勻200μl的藍白斑篩選液，室溫靜置30min待液體完全被吸干。

以下實施例中所用到的原始枯草芽孢桿菌3610為現有菌株，從芽孢桿菌保藏中心Bacillus Genetic Stock Center(BGSC)購買，保藏號為1L26；也可利用3610的comI失活菌株DS2569，現由上海科技大學保存，來源于美國印第安納大學Daniel Keams教授課題組饋贈(Plasmid-Encoded ComI Inhibits Competence in the Ancestral 3610Strain of Bacillus subtilis.Journal of Bacteriology.2013，195(18)：4085-4093.Melissa A.Konkol，Kris M.Blair，Daniel B.Keams)，申請人保證從申請日起20年內向公眾發放該生物材料。

以下實施例中所用到的2xYT培養基配方為(1L)：

Tryptone(胰蛋白胨) 16g；

Yeast extract(酵母提取物，Thermo Fisher Scientific，LP0021) 10g；

NaCl 4g。

10xMedium A base：(100mL)

Yeast extract(酵母提取物，同上) 1g；

Casamino acids(酪蛋白氨基酸) 0.2g；

加蒸餾水至90ml，高溫蒸汽滅菌。加10ml 50％濃度的Glucose(葡萄糖)，過濾除菌，補至100mL。

10x Bacillus salts：(100ml)

加蒸餾水至100ml，高溫蒸汽滅菌。

Medium A：(100mL)

蒸餾水 81ml

10xMedium A base 10ml；

10x Bacillus salts 9ml。

Medium B：(10mL)

Medium A 10ml；

50mM CaCl₂ 0.1ml；

250mM MgCl₂ 0.1ml。

實施例1：攜帶tasA-R表達質粒的枯草芽孢桿菌突變株的構建

(一)枯草芽孢桿菌突變株的構建：

枯草芽孢桿菌的生物膜主要成分是胞外多糖和淀粉樣蛋白，主要由eps基因簇和tasA基因編碼。

將產生物膜的原始枯草芽孢桿菌3610的淀粉樣蛋白的編碼基因tasA以及生物膜抑制子編碼基因sinR在基因組上進行敲除，構建枯草芽孢桿菌突變株ΔtasAΔsinR001；將產生物膜的原始枯草芽孢桿菌的淀粉樣蛋白的編碼基因tasA以及產生胞外多糖的編碼基因簇epsA-O和生物膜抑制子編碼基因sinR在基因組上進行敲除，構建枯草芽孢桿菌突變株ΔtasAΔsinRΔeps002；該菌株于2016年6月6日保存在中國普通微生物菌種保藏中心(CGMCC)，(CGMCC編號：12600)。

將產生物膜的原始枯草芽孢桿菌的淀粉樣蛋白的編碼基因tasA以及產生胞外多糖的編碼基因簇epsA-O在基因組上進行敲除，構建枯草芽孢桿菌突變株ΔtasAΔeps 003；

將產生物膜的原始枯草芽孢桿菌的淀粉樣蛋白的編碼基因tasA在基因組上進行敲除，構建枯草芽孢桿菌突變株ΔtasA004；

將產生物膜的原始枯草芽孢桿菌的產生胞外多糖的編碼基因簇epsA-O在基因組上進行敲除，構建枯草芽孢桿菌突變株Δeps005。

構建上述5種突變株的具體方法為：

1、以完全基因組測序的枯草芽孢桿菌168基因組序列(基因組測序genebank號NC_000964)為依據，設計上游特異引物upstream-F和upstream-R和下游特異引物downstream-F和downstream-R。以野生型枯草芽孢桿菌3610基因組為模板，PCR擴出目的敲除基因在基因組上的上下游同源序列約1kb。其中上游片段的5’端和下游片段的3’端分別帶有SalI/BglII(ΔtasAsinR)或NcoI/SmaI位點(ΔtasA，Δeps)。

1)對于構建ΔtasAΔsinR(001)，刪除中間tasAsinR片段，上游片段所用引物對為D tasAsinR Upstream-F(SEQ ID NO：22)和D tasAsinR Upstream-R(SEQ ID NO：23)；下游片段所用引物對為D tasAsinR downstream-F(SEQ ID NO：24)和D tasAsinR downstream-R(SEQ ID NO：25)；

2)對于構建ΔtasAΔsinRΔeps(002)，在菌株001的基礎上，進一步敲除epsA-O基因簇。擴增eps刪除的上游片段的引物為：D eps Upstream-F(SEQ ID NO：26)和D eps Upstream-R(SEQ ID NO：27)；擴增下游片段的引物為：D eps downstream-F(SEQ ID NO：28)和D eps downstream-R(SEQ ID NO：29)；

3)對于構建ΔtasAΔeps(003)，在eps刪除的基礎上，進行tasA單基因刪除。tasA刪除的上游引物對為D tasA Upstream-F(SEQ ID NO：30)和D tasA Upstream-R(SEQ ID NO：31)，下游引物對為D tasA downstream-F(SEQ ID NO：31)和D tasA downstream-R(SEQ ID NO：32)；

4)對于構建ΔtasA(004)，使用上游引物對D tasA Upstream-F(SEQ ID NO：30)和D tasA Upstream-R(SEQ ID NO：31)，以及下游引物對為D tasA downstream-F(SEQ ID NO：31)和D tasA downstream-R(SEQ ID NO：32)；

5)對于構建Δeps(005)，擴增eps刪除的上游片段的引物為：D eps Upstream-F(SEQ ID NO：26)和D eps Upstream-R(SEQ ID NO：27)；擴增下游片段的引物為：D eps downstream-F(SEQ ID NO：28)和D eps downstream-R(SEQ ID NO：29)。

2、基因組敲除整合質粒的構建：將上述上下游同源片段、與經相同內切酶消化后性化的pMAD載體(Biovecter，3549060)進行Gibson連接。使用NEB的Gibson Assembly試劑盒(NEB，E2611L)，根據各片段的長度和濃度，按所需比例分別加至EP管中。反應體系在50℃中恒溫孵育連接1小時。Gibson assembly(NEB，E2611L)反應體系如下：

將連接產物轉化入大腸桿菌DH5α感受態細胞(康為世紀，CW08085)。挑取具有羧芐青霉素抗性的單克隆，用提質粒試劑盒(天根，DP103)按照操作說明提取質粒DNA，用SalI和BglII雙酶切(thermo scientific FD0644，FD0083)鑒定。鑒定得到的陽性質粒經測序無誤后，即得到正確的整合質粒。

3、將基因組敲除整合質粒采用化學轉化法轉入大腸桿菌TG1菌株：

3.1從LB平板上挑活化的大腸桿菌TG1(Biovecter，BioVector105812-6)，接種于5ml的LB培養基，37℃振蕩培養過夜。

3.2將菌液按1∶100的比例接種，取250μl菌液于25ml的LB培養基中，37℃振蕩培養2-3小時至OD 600＝0.5左右。

3.3將菌液轉入50ml離心管中，冰上放置10min。

3.4在4℃下，4000r/min離心10min，棄上清，將管倒置1min至液體流盡。

3.5用冰上預冷的0.1mol/L的CaCl₂溶液10ml輕輕懸浮細胞，冰上靜置30min。

3.60-4℃，4000r/min離心10min，棄上清，加入2ml預冷的0.1mol/L的CaCl₂溶液，輕輕懸浮細胞，冰上放置，得到感受態細胞。

3.7取200μl上述制備好的感受態細胞，加入步驟(2)得到的1μg整合質粒，化學轉化法轉入。

4、采用提質粒試劑盒(天根，DP103)按照操作說明從步驟(3)中得到的大腸桿菌TG1中提取整合質粒，采用Spizizen轉化法轉入枯草桿菌待敲除的菌株。Spizizen轉化法的具體步驟如下：

4.1活化待轉化的枯草桿菌3610(芽孢桿菌保藏中心Bacillus Genetic Stock Center(BGSC)，1L26)。

4.2挑新鮮單克隆接種于3ml的2xYT培養基，37℃過夜振蕩培養。

4.3按1∶100比例將菌種接種于5ml的medium A中，37℃振蕩培養3.5h。

4.4按1∶10比例接種medium A中的菌于medium B中，37℃振蕩培養1.5h，制得感受態細胞。

4.5此刻制得感受態細胞，500μl的感受態細胞中加入1μg從大腸桿菌TG1中提取的整合質粒DNA。

4.6 37℃水浴靜置感受態60min。

4.7 37℃振蕩培養感受態細胞2h，涂帶有藍白斑篩選液(中國臺灣生工，ZL001BS)和5μg/ml紅霉素的LB培養基的平板，30℃培養過夜；其中，LB培養基的配制方法為：取LB培養基(中國臺灣生工，LD001)2.5g溶于100ml蒸餾水，加1.5g瓊脂粉，高溫蒸汽滅菌，待冷卻至約50℃時，加入紅霉素溶液至終濃度。

5、篩選顯藍斑的單克隆，在含5μg/ml紅霉素抗性的LB培養基中30℃培養過夜，將OD稀釋為0.1接種到5ml含5μg/ml紅霉素抗性的LB培養基中，先30℃培養2小時再將溫度升高到42℃培養6h。稀釋菌液10²-10⁴倍涂帶有5μg/ml紅霉素抗性和藍白斑篩選液的LB平板，42℃培養過夜。

6、挑選上步平板顯白色的單克隆，接種到5ml無抗LB培養基中30℃培養6小時再將溫度升高到42℃培養3小時。稀釋菌液10²-10⁴倍涂帶有藍白斑篩選液的LB平板，42℃培養過夜。

7、挑選上步平板顯白色的單克隆，分別點在無抗LB培養基和帶有5μg/ml紅霉素抗性的LB平板上，挑選在LB培養基上生長但是在紅霉素抗性中不能生長的單克隆。

8、對上步挑選的單克隆接種并用提基因組試劑盒(全式金，EE11-11)提取基因組，經PCR鑒定是否敲除成功。經過5-8步驟依次篩選最后PCR證明的得到的成功敲除的菌株進行保菌，分別構建得到枯草芽孢桿菌生物膜突變株001、002、003、004、005菌株。

菌落PCR(全式金，AS111-11)反應如下：

綜上所述，本發明通過敲除淀粉樣蛋白編碼基因tasA和胞外多糖編碼基因簇epsA-O以及生物膜抑制因子sinR等構建了各種相應的生物膜突變菌株。

在MSGG培養基(配方如下列出)中觀察生物膜的表型，MSGG培養基配方如下：3-(嗎啉基)丙磺酸100mM，丙三醇0.5％，谷氨酸鈉一水0.5％，磷酸鉀5mM，L-色氨酸50μg/ml，L-蘇氨酸50μg/ml，鹽酸硫胺(維他命B1)2μM，MgCl₂.6H₂O 2mM，CaCl₂ 700μM，FeCl₃.6H₂O 50μM，MnCl₂ 50μM，ZnCl₂ 1μM，其中，氨基酸溶液，鹽酸硫胺和離子溶液用蒸餾水配制母液后過濾除菌，置于4℃冰箱保存，其余溶解于去離子水后高溫蒸汽滅菌。使用時各物質稀釋至上述使用濃度。如圖1中a所示，為枯草芽孢桿菌野生型能形成一層褶皺的生物膜，如圖1中b所示，敲掉了tasA基因的單突變株不能形成褶皺的生物膜，但還能形成一層較光滑的生物膜，如圖1中c所示，敲掉了tasA和sinR后的雙突變株，生物膜的產生更多，如圖1中d所示，敲掉了tasA和sinR和eps基因簇后的三突變株，幾乎不能形成生物膜(d)。

(二)構建TasA-R表達質粒，在步驟(一)中得到的枯草芽孢桿菌突變株中轉入TasA-R表達質粒，得到能夠分泌TasA-R融合蛋白的枯草芽孢桿菌，R為功能基團。

在生物膜突變株的基礎上，本發明構建了一系列表達外源tasA-R的融合質粒，融合了帶有不同功能化基團的肽段，質粒圖譜如圖5所示。在枯草芽孢桿菌的穩定表達質粒pHT01(mobitec公司)中插入tasA及其tasA-R融合基因片段，構建在IPTG誘導(Pgrac啟動子)下調控表達的tasA-R融合質粒。除構建上述一系列基本tasA-R生物膜表達質粒，也可根據需要進行調控，調控不僅限于IPTG誘導，也有營養誘導、溫控、光控以及群體感應調控等。

根據需要攜帶的目的表達質粒，構建pHT01-tasA等基本表達載體。構建上述所需的表達質粒，其涉及的主要步驟包括：

(1)根據已知的表達載體pHT01、tasA以及R片段的序列，以枯草桿菌168基因組(Biovector，枯草芽孢桿菌168)為模板，設計tasA的上下游特異引物，擴出tasA片段。根據已知的序列優化結果合成的R片段，設計R片段的上下游特異引物。其中tasA片段的5’端和R片段的3’端分別帶有BamHI(或SmaI)和SmaI酶切位點。

tasA和R中間用八個或十個氨基酸的接頭連接，tasA-R融合蛋白分泌表達并在生物膜上自組裝成纖維，形成具有可調控的納米生物材料生物膜，八個或十個氨基酸的接頭可以為(GGGSGGGS或GGGGSGGGGS)，在基因合成或PCR得到R編碼基因的時候將接頭的序列加進去。

構建各質粒分別擴增tasA、R片段所用的引物如下：

1)對于構建質粒pHT01-tasA，tasA片段的正向引物Bam-tasA-F和反向引物Sma-tasA-R分別為：Bam-tasA-F(SEQ ID NO：33)和Sma-tasA-R(SEQ ID NO：34)。表達載體pHT01的序列見序列列表SEQ ID NO：19，插入的tasA片段對應DNA和氨基酸序列分別見SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2，質粒圖譜見圖5。

2)對于構建質粒pHT01-tasA-Histag：引物為Bam-tasA-F(SEQ ID NO：33)和Sma-tasA-histag-R(SEQ ID NO：35)。質粒圖譜見圖5。Histag的氨基酸序列見序列列表SEQ ID NO：3。

3)對于構建pHT01-tasA-spytag：引物為Bam-tasA-F(SEQ ID NO：33)和Sma-tasA-spytag-R(SEQ ID NO：36)。質粒圖譜見圖5。Spytag的氨基酸序列見序列列表SEQ ID NO：4。

4)對于構建pHT01-tasA-mgfp3-Histag：引物為Bam-tasA-F(SEQ ID NO：33)和Sma-tasA-mgfp3-R(SEQ ID NO：37)。Mgfp3的氨基酸序列見序列列表SEQ ID NO：7。

5)對于構建pHT01-tasA-mgfp5-Histag：

引物為Sma-mgfp5-tasA-F(SEQ ID NO：38)和Sma-mgfp5-tasA-R(SEQ ID NO：39)。Mgfp5的氨基酸序列見序列列表SEQ ID NO：9。

6)對于構建pHT01-tasA-mefp3-Histag：分別使用引物對tasA-F(SEQ ID NO：40)/tasA-R(SEQ ID NO：41)和tasA-mefp3-F(SEQ ID NO：42)/tasA-mefp3-R(SEQ ID NO：43)。質粒圖譜見圖5。Mefp3的氨基酸序列見序列列表SEQ ID NO：6。

7)對于構建pHT01-tasA-mefp5-Histag：

分別使用引物對tasA-F(ID40)/tasA-R(SEQ ID NO：41)和tasA-mefp5-F(SEQ ID NO：44)/tasA-mefp5-R(SEQ ID NO：45)。質粒圖譜見圖5。Mefp5的氨基酸序列見序列列表SEQ ID NO：8。

8)對于構建pHT01-tasA-mms6-Histag：分別使用引物對tasA-F(SEQ ID NO：40)/tasA-R(SEQ ID NO：41)和tasA-mms6-F(SEQ ID NO：46)/tasA-mms6-R(SEQ ID NO：47)。質粒圖譜見圖5。Mms6的氨基酸序列見序列列表SEQ ID NO：5。

9)對于構建pHT01-tasA-mts-Histag：

在pHT01-tasA-mefp3-histag的基礎上，PCR擴增出mrs基因，利用BamHI-SpeI酶切位點插入即將mefp3替換為mts片段得到pHT01-tasA-mts-Histag。PCR的引物為：mts-F(SEQ ID NO：48)/mts-R(SEQ ID NO：49)。質粒圖譜見圖5。mts的氨基酸序列見序列列表SEQ ID NO：13。

10)對于構建pHT01-tasA-pbrR-Histag：

同上，在pHT01-tasA-mefp3-histag的基礎上，PCR擴增出pbrR基因，利用BamHI-SpeI酶切位點插入。

PCR的引物為：pbrR-F(SEQ ID NO：50)/pbrR-R(SEQ ID NO：51)。質粒圖譜見圖5。PbrR的氨基酸序列見序列列表SEQ ID NO：14。

11)對于構建pHT01-tasA-sup-Histag：

同上，在pHT01-tasA-mefp3-histag的基礎上，蘇州金唯智公司直接合成sup基因，兩端帶有BamHI-SpeI酶切位點，直接插入亞克隆得到質粒pHT01-tasA-sup-Histag。質粒圖譜見圖5。sup的氨基酸序列見序列列表SEQ ID NO：15。

12)對于構建pHT01-tasA-mcherry-Histag：

分別使用引物對tasA-F(SEQ ID NO：40)/tasA-R(SEQ ID NO：41)和tasA-mcherry-F(SEQ ID NO：52)/tasA-mcherry-R(SEQ ID NO：53)。

質粒圖譜見圖5。Mcherry的氨基酸序列見序列列表SEQ ID NO：10。

13)對于構建pHT01-tasA-maple3-Histag：

分別使用引物對tasA-F(SEQ ID NO：40)/tasA-R(SEQ ID NO：41)和tasA-maple3-F(SEQ ID NO：54)/tasA-maple3-R(SEQ ID NO：55)。

質粒圖譜見圖5。Maple3的氨基酸序列見序列列表SEQ ID NO：11。

14)對于構建pHT01-tasA-OPH-Histag：

分別使用引物對tasA-F(SEQ ID NO：40)/tasA-R(SEQ ID NO：41)和tasA-oph-F(SEQ ID NO：56)/tasA-oph-R(SEQ ID NO：57)。

質粒圖譜見圖5。OPH的氨基酸序列見序列列表SEQ ID NO：12。

15)對于構建pHT01-tasA-OPH：

在前述14)中表達質粒pHT-tasA-OPH-Histag的基礎上，利用BamHI(Thermo Scientific^TM，FD0055)/XbaI(Thermo Scientific^TM，FD0684)雙酶切去除histag，擴增OPH片段，所用引物對為Bam-OPH no his F(SEQ ID NO：58)/Xba-OPH no his R(SEQ ID NO：59)，然后插入到載體中。

(2)表達載體的構建：將上述得到的tasA片段、R片段或tasA-R片段，和經雙酶切后的pHT01載體，用Gibson Assembly(NEB，E2611L)連接。Gibson連接方法同步驟(一)中的2所述。

(3)表達載體轉化DH5α(康為世紀CW08085)后，采用提質粒試劑盒(天根DP103)提取質粒，由蘇州金唯智公司測序后，鑒定重組質粒正確。

(4)將重組質粒采用Spizizen轉化法轉入(同步驟(一)中的4所述。)枯草芽孢桿菌突變株(001或002或003或004)中，涂帶有5μg/ml氯霉素抗性的LB平板，37℃培養過夜。

(5)挑選得到的單克隆，接種到含5μg/ml氯霉素抗性的LB培養基中，提取基因組，經菌落PCR鑒定是否含有目的基因片段(tasA片段或R片段)，如擴出條帶則證明質粒轉化成功。

除了上述IPTG誘導表達的質粒系統，本發明同時設計了群體感應系統活化的生物膜表達菌株，以非致病性的金黃色葡萄球菌RN4220基因組的序列為參考，設計構建了QS信號發送型質粒pDG-P2-agrBDCA和信號接收質粒pDG-P2-agrCA然后整合到枯草芽孢桿菌的基因組上，詳見實施例2。

利用透射電子顯微鏡(TEM)和場發射掃描電子顯微鏡(FE-SEM)來觀察細菌生物膜上分泌的淀粉樣蛋白纖維。如圖2所示，通過TEM觀察，可以看到敲除tasA的突變株都沒有纖維，而攜帶了表達質粒的突變株經過IPTG誘導后能恢復形成纖維的能力；沒有IPTG誘導時不形成纖維。

IPTG誘導的步驟：將攜帶tasA-R融合質粒的工程菌接種于含5μg/ml氯霉素的LB液體培養基過夜(37℃，220rpm)，次日按1∶100比例接種于含1mmol/L IPTG和5μg/ml氯霉素的MSGG液體培養基中。

同樣如圖3的FE-SEM觀察到，攜帶空質粒pHT01的突變株不產生物膜，而攜帶tasA-R融合質粒的基因工程菌經IPTG誘導后能恢復產生生物膜纖維。

取液體MSGG培養基中培養2天的生物膜溶液10μl，滴于銅網(中鏡科儀，BZ10024a)上靜置2-5min，用濾紙吸干。取10μl的blocking buffer于銅網上，靜置30min，吸干。blocking buffer配方為：200ml PBS(life technology，00051)中加上40μl Tween 20(生工，A600560-0500)和0.4g脫脂奶粉(BD Difco，232100)。取10μl的一抗溶液(一抗稀釋150倍于blocking buffer后使用)滴于銅網上，靜置2h，吸干。取10μl的PBST洗一次，吸干。PBST的配方為：PBS+0.1％Tween 20。取10μl的二抗溶液(二抗稀釋50倍于PBST后使用)滴于銅網上1h，吸干。取10μl的PBST洗一次，吸干。再用10μl的去離子水洗一次，吸干。取10μl的(2.5mg/ml)醋酸鈾溶液滴于銅網，染色30s，吸干。

結果如圖4所示，利用anti-TasA的一抗體(艾比瑪特Abmart-艾比瑪特生物醫藥(上海)有限公司定制合成抗體)孵育，然后用帶有納米金標的二抗(BBI solutions，Goat anti Rabbit IgG 20nm Gold)進行反應，通過免疫金標TEM證明生物膜分泌的纖維都為TasA-R融合纖維。

實施例2：攜帶tasA-R表達質粒的枯草芽孢桿菌突變株的構建

除了實施例1中所述的質粒表達方法，也可以進行枯草芽孢桿菌基因組直接替換方案。不敲除生物膜編碼基因，而是直接在基因組水平將tasA替換為tasA-R基因。

基因組水平直接整合表達融合的tasA-R生物膜，有組成型表達以及啟動子誘導型兩種表達方式。

1.組成型tasA-R生物膜表達基因組整合菌株構建：

以tasA-histag，tasA-mefp3-histag，tasA-mefp5-histag，tasA-mcherry-histag和tasA-oph等片段整合到基因組上為例，包含以下步驟：

(1)以實施例1中的表達載體為模板，設計特異性上下游引物，擴出擬替換的tasA-histag、tasA-mefp3-histag、tasA-mefp5-histag、tasA-mcherry-histag和tasA-oph片段。以枯草桿菌168基因組序列為參考，設計tasA上游特異引物upstream-F和upstream-R和tasA下游特異引物downstream-F和downstream-R，擴出目的替換在基因組上的上下游同源序列約1kb。

涉及到的PCR引物如下：

對于構建pMAD-tasA-histag，pMAD-tasA-mefp3-histag，

pMAD-tasA-mefp5-histag，pMAD-tasA-mcherry-histag，pMAD-tasA-oph。

擴增tasA位點上游同源片段：引物對upstream-F(SEQ ID NO：60)/upstream-R(SEQ ID NO：61)；

擴增tasA位點下游同源片段：引物對downstream-F(SEQ ID NO：62) /downstream-R(SEQ ID NO：63)；

擴增要替換用的目標片段tasA-histag：引物對th-tasA-F(SEQ ID NO：64)/histag-R(SEQ ID NO：65)；

擴增要替換用的目標片段tasA-mefp3-5-H：引物對th-tasA-F(SEQ ID NO：64)/mefp3-5-R(SEQ ID NO：66)；

擴增要替換用的目標片段tasA-mcherry-His：引物對th-tasA-F(SEQ ID NO：64)/mecherry-R(SEQ ID NO：67)；

對于構建整合型質粒pMAD-tasA-oph：引物對tasAoph-mad F(SEQ ID NO：68)/oph-R(SEQ ID NO：69)用來擴增tasA-oph片段，再引物對sinI-F(SEQ ID NO：70)/sinI-mad R(SEQ ID NO：71)擴增下游同源片段，然后與pMAD進行Gibson連接即得到整合質粒。

(2)能夠表達TasA-R蛋白的基因組替換整合質粒的構建：將上述目的替換片段、上下游同源片段與經NcoI(Themo Scientific^TM，FD0573)/SmaI(Thermo Scientific^TM，FD0663)或SalI(Thermo Scientific^TM，FD0644)/SmaI(tasA-oph)位點雙酶切后的pMAD載體進行Gibson連接。Gibson連接方法同實施例1中步驟(一)中的2所述。

(3)將Gibson連接產物采用化學轉化法轉入大腸桿菌TG1菌株，涂于含50μg/ml羧芐青霉素抗性的LB平板。

(4)從大腸桿菌TG1中提取整合質粒，采用Spizizen轉化法轉入枯草桿菌待敲除的菌株(枯草芽孢桿菌3610或DS2569)，涂帶有5μg/ml紅霉素抗性且藍白斑篩選液的LB平板，30℃培養過夜。

(5)篩選上步平板顯藍斑的單克隆，在含5μg/ml紅霉素抗性的LB培養基中30℃培養過夜，將OD稀釋為0.1接種到5ml含5μg/ml紅霉素抗性的LB培養基中，先30℃培養2小時再將溫度升高到42℃培養6hs。稀釋菌液10²-10⁴倍涂帶有5μg/ml紅霉素抗性且藍白斑篩選液的LB平板，42℃培養過夜。挑選上步平板顯白色的單克隆，接種到5ml無抗LB培養基中30℃培養6小時再將溫度升高到42℃培養3小時。稀釋菌液10²-10⁴倍涂帶有藍白斑篩選液的LB平板，42℃培養過夜。

(6)挑選上步平板顯白色的單克隆，分別點在無抗LB和帶有5μg/ml紅霉素的LB平板上，挑選在LB上生長但是在紅霉素抗性中不能生長的單克隆。

(7)對上步挑選的單克隆接種并提取基因組，經PCR鑒定是否替換成功。以此方法得到基因組tasA分別被替換成tasA-histag、tasA-mefp3-histag、tasA-mefp5-histag、tasA-mcherry-histag、tasA-oph的菌株。

2.誘導型tasA-R生物膜表達基因組整合菌株構建。

可誘導或調控的基因組水平表達，不僅是IPTG誘導，也有營養誘導、溫控、光控以及群體感應調控。

2.1以IPTG誘導為例，具體步驟為：

(1)以實施例1中構建的pHT01-tasA-R系列表達質粒為模板，擴增帶有啟動子在內的lacI-Pgrac-tasA-R片段；再以枯草桿菌168基因組序列為參考，設計上游特異引物upstream-F和upstream-R和下游特異引物downstream-F和downstream-R，擴出目的替換在基因組上的上下游同源序列約1kb。

涉及到的引物序列如下：

以pMAD-lacI-Pgrac-tasA-histag為例，

擴增上游片段：Sal-dA upstream-F(SEQ ID NO：72)/dA upstream-R(SEQ ID NO：73)；

擴增下游片段：dC downstream-F(SEQ ID NO：74)/bgl-dC downstream-R(SEQ ID NO：75)；

擴增替換的tasA-histag片段：tasA-histagF(SEQ ID NO：76)/tasA-histag-R(SEQ ID NO：77)。

(2)基因組替換整合質粒的構建：將上述目的替換片段、上下游同源片段與經SalI/BglII位點雙酶切后的pMAD載體進行Gibson連接。Gibson連接方法同實施例1中步驟(一)中的2所述。

(3)將Gibson連接產物采用化學轉化法轉入大腸桿菌TG1菌株。

(4)從大腸桿菌TG1中提取整合質粒，采用Spizizen轉化法轉入枯草桿菌待敲除的菌株(枯草芽孢桿菌3610或DS2569)，涂帶有5μg/ml紅霉素抗性且藍白斑篩選液的平板，30℃培養過夜。

(5)篩選上步平板顯藍斑的單克隆，在含5μg/ml紅霉素抗性的LB培養基中30℃培養過夜，將OD稀釋為0.1接種到5ml含5μg/ml紅霉素抗性的LB中，先30℃培養2小時再將溫度升高到42℃培養6h。稀釋菌液10²-10⁴倍涂帶有紅霉素抗性且藍白斑篩選液的平板，42℃培養過夜。

(6)挑選上步平板顯白色的單克隆，接種到5ml無抗LB中30℃培養6小時再將溫度升高到42℃培養3小時。稀釋菌液10²-10⁴倍涂帶有藍白斑篩選液的平板，42℃培養過夜。

(7)挑選上步平板顯白色的單克隆，分別點在無抗LB和帶有5μg/ml紅霉素的LB平板上，挑選在LB上生長但是在LB+5μg/ml紅霉素抗性中不能生長的單克隆。

(8)對挑選的單克隆接種并提取基因組，經PCR鑒定是否替換成功。以此方法得到基因組上具有IPTG調控表達的tasA-histag整合菌株。

實驗證明，基因組水平上組成型tasA-R或IPTG誘導型tasA-R生物膜都能表達，并且成功分泌有活性的TasA-R纖維。

2.2以群體感應系統(QS)為例：

(1)Sender質粒構建。對照金黃色葡萄球菌NCTC 8325(美國菌種保藏中心ATCC 35556)的群體感性系統的序列P2-agrBDCA，讓蘇州金唯智公司直接合成一段分泌信號的序列P2-agrBD，末尾帶有轉錄終止子ter，得到的序列為P2-agrBD-ter，見序列SEQ ID NO：17。該片段前后帶有BamHI-EcoRI位點，中間設計了HindIII、BglII、SalI等酶切位點，插入到整合質粒pDG1730(Biovector，pDG1730)的BamHI-EcoRI中，得到pDG-BamHI-P2-HindIII-agrBD-BglII-SalI-ter-EcoRI(pDG-P2-agrBD-ter)，該質粒可用于后面的agrCA的亞克隆構建。

(2)完整Sender質粒帶自誘導構建。設計引物對hindbgl-agrCAF(SEQ ID NO：78)/sal-agrCA R(SEQ ID NO：79)，以金黃色葡萄球菌NCTC 8325(美國菌種保藏中心ATCC 35556)為模板，PCR擴增QS信號分子接收系統agrCA的基因片段，前后帶有BglII(Thermo Scientific^TM，FD0083)/SalI(Thermo Scientific^TM，FD0644)位點，插入到pDG-P2-agrBD-ter的相應位點，得到包含整個操縱子的Sender質粒pDG-P2-agrBDCA-ter。

(3)Receiver質粒構建。如上引物，擴增的agrCA片段，用HindIII-SalI位點，插入到pDG-P2-agrBD-ter的相應位點，即得到僅有接收系統的Receiver質粒pDG-P2-agrCA-ter。

質粒圖譜見圖5。agrCA的PCR片段的序列見序列列表SEQ ID NO：18。

整合質粒pDG1730的序列見列表SEQ ID NO：21。

(4)將Sender質粒和Receiver質粒分別采用Spizizen轉化法轉到(001)突變菌株，涂于攜帶100μg/ml壯觀霉素(Spe100)抗性的LB平板上，挑選在Spe100平板上長出的菌株，提取基因組作為模板做菌落PCR，得到目的條帶，則得到amyE成功整合的Sender菌株P2-agrBDCA-ter以及Receiver菌株P2-agrCA-ter。

(5)將tasA-R融合基因插入到受QS信號分子活化的P3啟動子(基因合成約158bp，具體序列見序列表SEQ ID NO：16)下游進行表達，將表達質粒轉化Receiver菌株，即得到QS系統調控的TasA-R表達的系列菌株，比如P3-tasA-histag、P3-tasA-mcherry-histag、P3-tasA-mefp3-histag、P3-tasA-mefp5-histag和P3-tasA-oph等。

18)對于構建pMK-P3-tasA-histag：

先分別擴增P3、tasA-histag片段，然后Gibson連接經SalI-BamHI酶切的pMK4載體(Biovecter，3538208)，得到pMK-P3-tasA-histag。

擴增P3片段：引物對P3-pMK F(SEQ ID NO：81)/P3-tas R(SEQ ID NO：82)；

擴增tasA-histag片段：以pHT-tasA-histag為模板；

引物對Tas-P3F(SEQ ID NO：83)/TH-pMK R(SEQ ID NO：84)。

19)對于構建pMK-P3-tasA-meherry-histag：

與上述pMK-P3-tasA-histag的方法相同，擴增P3的引物一樣，引物對P3-pMKF(SEQ ID NO：81)/P3-tas R(SEQ ID NO：82)；tasA-mcherry-histag片段的擴增是以pHT-tasA-mcherry-histag為模板，引物對Tas-P3F(SEQ ID NO：83)/TMCH-pMK R(SEQ ID NO：85)。

因為tasA與mcherry以及histag之間都設計了酶切位點，所以構建后續的pMK-P3-tasA-mefp3-histag、pMK-P3-tasA-mefp5-histag和pMK-P3-tasA-oph等表達質粒時可以利用酶切連接直接構建。

先用BamHI-SmaI酶切pMK-P3-tasA-mcherry-H，去掉700bp，回收6.6kb的pMK-P3-tasA片段。然后PCR擴增出目的片段，經BamHI-SmaI插入到酶切的pMK-P3-tasA載體中即可。

20)對于構建pMK-P3-tasA-mefp3-histag：以pHT-tasA-mefp3-histag為模板擴增mefp3-histag片段，引物對Bam-me3 F(SEQ ID NO：86)/Sma-me35 R(SEQ ID NO：87)。

PCR產物mefp3-histag片段經BamHI-SmaI插入酶切的載體中，連接得到pMK-P3-tasA-mefp3-histag。

21)對于構建pMK-P3-tasA-mefp5-histag：以pHT-tasA-mefp5-histag為模板擴增mefp5-histag片段，引物對Bam-me5F(SEQ ID NO：88)/Sma-me35R(SEQ ID NO：87)。

PCR產物mefp5-histag片段經BamHI-SmaI插入酶切的載體中，連接得到pMK-P3-tasA-mefp5-histag。

22)對于構建pMK-P3-tasA-oph：

以pHT-tasA-oph為模板擴增oph片段，引物對Bam-oph F(SEQ ID NO：89)/Sma-oph R(SEQ ID NO：90)。PCR產物oph片段經BamHI-SmaI插入酶切的載體中，連接得pMK-P3-tasA-oph。表達質粒pMK4的序列見列表SEQ ID NO：20，P3啟動子序列見序列列表SEQ ID NO：16，TasA、Mcherry、Mefp3、Mefp5和OPH等氨基酸序列見序列列表。

實驗證明，QS sender菌液的加入或共培養，能有效活化Receiver菌株的TasA-R生物膜的表達和分泌，并且具有相應的功能。

如圖6所示，為加入Sender菌株的上清(含信號分子)后，Receiver菌分泌TasA-Histag生物膜能綁定量子點CdSe@ZnS。具體步驟為：將Sender菌株和帶有tasA-histag的Receiver菌株，分別搖菌于5ml含LB+Spe100或LB+Spe100+C15培養基中，37℃、220rpm振蕩培養過夜。次日5000g離心10min。收集Receiver/tasA-histag的菌體，用MSGG+Spe100(100μg/ml壯觀霉素)+C15(5ug/ml氯霉素)培養基懸浮到OD600＝1。取離心后的Sender上清1∶1加入到懸浮的Receiver/tasA-histag MSGG菌體中，即相當于懸浮稀釋至OD＝0.5。對照不加上清則完全用MSGG+Spe100+Cl5培養基懸浮到OD600＝0.5。然后分別取2ml菌液于24孔板中，加入1％Ni-NTA修飾的量子點CdSeS@ZnS(本實驗室合成)。紫外照射可見熒光(圖b)，而對照沒有加Sender上清的生物膜幾乎不能綁定量子點沒有熒光。

實施例3：包含tasA-Histag融合蛋白的生物膜平臺用于生物催化

表達tasA-histag生物膜的菌株，可以為基因組整合的組成型表達，也可以為IPTG誘導型表達或者攜帶IPTG誘導表達質粒的菌株，這里以實施例1中的ΔtasAΔsinRΔeps三突變的(002)突變株攜帶pHT01-tasA-histag表達質粒，IPTG誘導TasA-Histag為例，具體步驟為：

1.轉化：將表達質粒轉化生物膜突變株(002)，轉化方法如下：

(1)活化待轉化的實施例1中的ΔtasAΔsinRΔeps三突變的(002)突變株。

(2)挑新鮮單克隆接種于3ml的2xYT培養基，37℃過夜振蕩培養。

(3)按1∶100接種過液菌于5ml的medium A中，37℃振蕩培養3.5h。

(4)按1∶10接種medium A中的菌與medium B中，37℃振蕩培養1.5h。

(5)此刻制得感受態細胞，500μl的感受態中加入pHT01-tasA-histag表達質粒或pHT01-tasA表達質粒至1μg。

(6)37℃靜置60min。

(7)37℃振蕩培養感受態細胞2h，涂于帶5μg/ml氯霉素抗性的LB平板。

2.培養：分別接突變株002/pHT01-tasA-Histag和002/pHT01-tasA于5ml含5μg/ml氯霉素的LB培養基中37℃，220rpm振蕩培養過夜。次日取出菌液，測定600nm處吸光值。菌液5000g離心10min，用適量帶5μg/ml氯霉素抗性的MSGG培養基將菌體懸浮稀釋至OD＝0.5，然后分別取2ml菌液于24孔板中，加入IPTG(0.5mM)，再加1％Ni-NTA修飾的AuNPs(后文中用AuNPs表示)(nanoprobes，2082-3ml)或者Ni-NTA修飾的量子點CdSeS@ZnS或者Cd_0.8Zn_0.2S量子點(本實驗室合成)。將24孔板放置于30℃培養箱中靜置培養。

Ni-NTA修飾的CdSeS@ZnS量子點的制備：CdO(282.5mg，2.2mmol)和OA(油胺，10mL)的混合液脫氣并在氮氣保護條件下加熱至150℃，然后加入40mL的ODE(1-18烯)并且加熱至305℃。將Se(42.6mg，0.54mmol)和S(1.9mg，0.06mmol)溶于0.6mL的TOP(三辛基膦)中，然后迅速注入反應混合液。反應混合液維持在305℃反應90s以促進CdSeS殼的生長，然后逐滴加入十二硫醇(0.59mL，3.4mmol)，反應混合液降至270℃。Zn(OAc)₂(1.049g，5.72mmol)溶于OA(8mL)和ODE(2mL)的混合液中，注入反應混合液，然后S(0.432g，13.5mmol)溶于TOP(7mL)中，快速注入反應混合液中，反應在270℃保持10min以促進完全成殼。得到的量子點溶于正己烷中并用無水乙醇洗三遍，得到CdSeS@ZnS量子點，重懸于20mL正己烷中保存。1mL的乙醇加入1mL(10μmol/mL)的CdSeS@ZnS量子點溶液中，離心，棄上清，并重懸于15mL的二氯甲烷。然后加入20mg/mL HS-NTA(本實驗室合成)甲醇溶液(1mL，pH＝13)，緩慢攪拌2min，加入9mL的PBS溶液，分出水相并用0.2μm的濾膜過濾，所得溶液為具有NTA配體的CdSeS@ZnS量子點。在(500nmmol/mL)的具有NTA配體的CdSeS@ZnS量子點的水溶液(1mL)中加入(20μL)的50mM的NiCl₂溶液，得到具有Ni-NTA配體的6nm或8nm的金納米顆粒(Ni-NTA修飾的AuNPs)。

Ni-NTA修飾的量子點Cd_0.8Zn_0.2S的制備：將0.0064g氧化鎘，0.0081g氧化鋅，0.5ml油酸和4ml 1-18烯混合然后加熱到80℃，然后用真空泵抽氣20分鐘。往反應瓶中充入氮氣，將反應溫度升到310℃直至氧化鎘與氧化鋅的完全溶解，并形成澄清透明的溶液后，將溫度降至300℃。把硫溶液(將0.0032g硫溶解到4mL1-18烯中，邊攪拌邊抽氣)快速注入到熱的反應液中。反應體系保持300℃三個小時以使得納米晶體生長。反應液用25℃氯仿淬滅。加入甲醇使得納米晶體析出，得到Cd_0.8Zn_0.2S納米顆粒，將沉淀溶于二氯甲烷放于4℃冰箱保存。1mL的乙醇加入1mL(10μmol/mL)的上述合成的(6mmol/L)Cd_0.8Zn_0.2S納米顆粒溶液中，離心，棄上清，并重懸于15mL的二氯甲烷。然后加入20mg/mLHS-NTA甲醇溶液(1mL，pH＝13)，緩慢攪拌2min，加入9mL的PBS溶液，分出水相并用0.2μm的濾膜過濾，所得溶液為具有NTA配體的Cd_0.8Zn_0.2S納米顆粒。在(500nmmol/mL)的具有NTA配體的Cd_0.8Zn_0.2S納米顆粒的水溶液(1mL)中加入(20μL)的50mM的NiCl₂溶液，得到具有Ni-NTA配體的Cd_0.8Zn_0.2S納米顆粒。

HS-NTA的合成：

溴乙酸(8.34g，60mmol)溶于30mL的2M的氫氧化鈉溶液得到溴乙酸溶液，N⁶-Cbz-L-賴氨酸(Cbz-lys)(8.4g，30mmol)溶于45mL的2M的氫氧化鈉溶液得到Cbz-lys溶液。在冰浴條件下將Cbz-lys溶液逐滴加到溴乙酸溶液中，室溫攪拌過夜。加熱到70℃，反應2h后冷至室溫。加入1M的HCl溶液使其沉淀完全，并將沉淀重新溶解在100mL的1M氫氧化鈉溶液中。最后重新加入1M的HCl溶液使其沉淀完全，抽濾并干燥，得到9.55g的Cbz-NTA。

在三口燒瓶中加入Cbz-NTA(6g，15mmol)和Pd/C(鈀碳)催化劑(10％，0.6g)，然后加入100mL的甲醇。在H₂氛圍下室溫攪拌過夜。過濾得到甲醇溶液，沉淀用40mL的去離子水溶解并抽濾得到水溶液。將甲醇溶液和水溶液旋干，然后將產物重新溶解于20mL去離子水中，加入乙醇直到溶液變渾濁，然后將其置于-20℃冷卻析出，過濾并干燥得到3.4g的NH₂-NTA。

將NaHCO₃(1g，11.9mmol)和硫代丁內酯(0.6g，5.9mmol)溶于10mL的去離子水中，然后加入NH₂-NTA(1g，3.8mmol)。反應混合液72℃攪拌過夜，然后冷至室溫。加入大約1mL的乙酸將pH調到3左右，旋蒸并使其在乙醇中重新結晶，抽濾并用乙醇和戊烷分別洗三次，干燥產物得到1.26g的HS-NTA。

3.制樣觀察與表征。2天后，取出孔板。取20μl菌液于銅網上，2min后用濾紙吸干培養基，滴加20μl ddH₂O洗滌樣品，再用濾紙吸干。加入10μl(2.5mg/ml)醋酸鈾染色2min，用濾紙吸干，再65℃烘干15min使樣品干燥。最后將樣品放于恒溫箱中，透射電子顯微鏡觀察。如圖7a所示，分泌了TasA-Histag的生物膜能特異性地結合納米金顆粒，如圖7b所示，僅分泌TasA的生物膜不能結合納米金顆粒或量子點QDs。

試劑：硼氫化鈉(NaBH₄)，國藥，80115865

Ches buffer：sigma，C2885-100G

對氧磷(Paraoxon)：sigma，36186-100mg

實驗步驟：接002/pHT01-tasA-OPH和002/pHT01-tasA-Histag于含5μg/ml氯霉素抗性的液體LB培養基中過夜搖菌，5000g、10min收菌，重懸菌體于MSGG(0.5mM IPTG，5μg/ml氯霉素)中，調OD＝1。002/pHT01-tasA-OPH菌液置于平板中，002/pHT01-tasA-Histag菌液取等量三份，每份4ml于12孔板中，分別加入0，10μl，50μl AuNPs(500nm/l)，30℃靜置培養2d。

002/pHT01-tasA-OPH：5000g、10min收菌，重懸菌體于pH＝10的ches buffer 中，調OD＝4。15ml菌液+1.67ml 10mM paraoxon，35℃反應2h。離心，取上清測A405。

002/pHT01-tasA-Histag：5000g、10min收菌，分別在菌體中加入002/pHT01-tasA-OPH反應上清液4ml，最后一份4ml上清液加入10μl AuNPs(500nm/l)。渦旋震蕩，再在每個樣品中加入100μl 2M NaBH₄。室溫反應2h后，離心，取上清測A405。

結果如圖7c所示，002/pHT01-tasA-Histag綁定納米金顆粒，催化NaBH4還原對硝基苯酚成對氨基酚。

4.功能檢測。綁定了量子點QDs的生物膜在光激發條件下，可以降解有機染料甲基橙，分時間間隔取樣測定甲基橙的濃度(464nm吸收值)。

試劑：甲基橙(Methyl orange)，賽默飛世爾，151421000。甲基橙用PBS緩沖液(pH＝7)配成濃度為250mg/L母液。

實驗步驟：將培養了2天的002/pHT01-tasA-Histag的菌液10000g離心10min收菌，用PBS重懸。取兩份各23ml，一份加入200μl PBS，一份加入200μlQDs(500nm/ml)。在旋轉搖床上結合30min。另取兩份23ml PBS溶液，一份加入200μl PBS，一份加入200μlQDs(500nm/ml)。再在4份溶液中加入2ml甲基橙母液。將四份溶液分別倒入反應罐中反應。在0h，2h，4h，6h，8h，9h取樣品500μl，離心測上清在464nm處的吸光值。

圖8a顯示生物膜結合量子點的TEM圖，以及光照條件下降解有機染料甲基橙，b為降解速率曲線圖。

Histag能特異性地結合Ni-NTAAuNPs以及量子點等，量子點在光激發下進行電子傳遞可降解有機染料，由于量子點被生物膜綁定，可以回收和循環利用，可用于導電、半導體和催化，屬于生物催化領域。

實施例4包含tasA-mcherry融合蛋白的生物膜平臺

表達tasA-mcherry生物膜的菌株，可以為基因組整合的組成型表達，也可以為IPTG誘導型表達或者攜帶IPTG誘導表達質粒的菌株，這里以實施例1中ΔtasAΔsinRΔeps三突變的(002)突變株攜帶pHT01-tasA-mcherry表達質粒，IPTG誘導TasA-Mcherry為例，具體步驟為：

1.轉化：將表達質粒轉化生物膜突變株(002)，轉化方法如下：

(1)活化待轉化的實施例1中的ΔtasAΔsinRΔeps三突變的(002)突變株。

(2)挑新鮮單克隆接種于3ml的2xYT培養基，37℃過夜振蕩培養。

(3)按1∶100接種過液菌于5ml的medium A中，37℃振蕩培養3.5h。

(4)按1∶10接種medium A中的菌與medium B中，37℃振蕩培養1.5h。制得感受態細胞，500μl的感受態中加入pHT01-tasA-mcherry表達質粒至1μg。

(5)37℃靜置60min。

(6)37℃振蕩培養感受態細胞2h，涂于帶5μg/ml氯霉素抗性的LB平板。

2.生物膜培養。接突變株002/pHT-tasA-mcherry于10ml含5μg/ml氯霉素的LB培養基中37℃，220rpm振蕩培養過夜。次日取出菌液，測定600nm處吸光值。菌液5000g離心10min，用適量含5μ/ml氯霉素的MSGG培養基將菌體懸浮稀釋至OD＝0.5，取兩份10ml菌液于培養皿中，一份加入IPTG(0.5mM)，一份不加IPTG。將培養皿置于30℃培養箱靜置培養。

3.生物膜觀察。2天后，5000g離心10min收集菌體，用100μl無菌PBS重懸細菌。取10μl菌液滴于載玻片上，蓋上蓋玻片，在共聚焦熒光顯微鏡下觀察Mcherry的紅色熒光。結果發現，有IPTG誘導的細菌有紅色熒光，而不加IPTG則沒有紅色熒光。如圖9所示。

Mcherry熒光蛋白可用于生物標記，活體細胞的實時監測，屬于生物材料領域。本實施例的生物膜平臺中，枯草芽孢桿菌淀粉樣蛋白融合一個熒光報告基因，有誘導物的情況下能分泌出來結合在生物膜上，本例中攜帶了TasA-Mcherry表達質粒基因工程菌能在熒光顯微鏡下看到紅色的生物膜，因此該例證明TasA-Mcherry融合蛋白能成功表達，可用于一些活體細胞的實時監測。

實施例5包含TasA-Spytag融合蛋白的生物膜平臺

表達tasA-spytag生物膜的菌株，可以為基因組整合的組成型表達，也可以為IPTG誘導型表達或者攜帶IPTG誘導表達質粒的菌株，這里以實施例1中ΔtasAΔsinRΔeps三突變的(002)突變株攜帶pHT01-tasA-spytag表達質粒，IPTG誘導TasA-Spytag為例，具體步驟為：

1.轉化。將表達質粒轉化生物膜突變株002，轉化方法如下：

(1)活化待轉化的枯草桿菌002。

(2)挑新鮮單克隆接種于3ml的2xYT培養基，37℃過夜振蕩培養。

(3)按1∶100接種過液菌于5ml的medium A中，37℃振蕩培養3.5h。

(4)按1∶10接種medium A中的菌與medium B中，37℃振蕩培養1.5h。

(5)此刻制得感受態細胞，500μμl的感受態中加入pHT-tasA-spytag質粒至1μg。

(6)37℃靜置60min。

(7)37℃振蕩培養感受態細胞2h，涂于帶氯霉素抗性的平板。

2.生物膜培養。接突變株002/pHT-tasA-spytag于20ml含5μg/ml氯霉素的LB培養基中37℃，220rpm振蕩培養過夜。次日取出菌液，測定600nm處吸光值。菌液5000g離心10min，用適量含5μg/ml氯霉素的MSGG培養基將菌體懸浮稀釋至OD＝0.5，取兩份20ml菌液于培養皿中，一份加入IPTG(0.5mM)，一份不加IPTG。將培養皿置于30℃培養箱靜置培養。

3.功能表征。2天后，5000g離心10min收集菌體，用PBS(life technology，00051)洗3次，最后重懸于1ml PBS中，等分成兩份(每份500μl)，一份加入500μl Spycatcher-Mcherry蛋白，另一份加入500μl PBS，室溫孵育1h。再用PBS洗三次，然后重懸菌體于100μl PBS中。取10μl滴于載玻片上，蓋上蓋玻片，于熒光顯微鏡下觀察Mcherry的紅色熒光。結果發現，有IPTG誘導的細菌有紅色熒光，而不加IPTG則沒有紅色熒光。如圖10所示。Spytag能特異性地與Spycatcher反應，當它們分別融合不同基團時也能進行體外反應。

Spycatcher-Mcherry蛋白制備步驟：

1.構建：基因片段spycatcher-mcherry由蘇州金唯智公司合成并通過NdeI(Thermo Fisher Scientific，ER0581)和XhoI(Thermo Fisher Scientific，ER0691)位點插入到質粒pET22b(優寶生物公司，貨號VT1200)中。

Spycatcher-Mcherry的氨基酸序列見ID91。

2.將構建好的PET22b-spycatcher-mcherry轉化入大腸桿菌BL21(DE3)(全式金，CD601-02)，得到蛋白表達菌株。

3.接上述菌株至5ml含50μg/ml羧芐青霉素(Carb50)的LB液體培養基過夜培養，次日將5ml菌液接500ml大瓶的LB+Carb50液體培養基，于37℃，220rpm條件下培養約3h至OD600為1。再加入IPTG至終濃度為1mM，于16℃，220rpm條件下繼續培養12h。

4.收集菌液500ml，等分2份，于4000g，4℃條件下離心15min，棄上清。

5.在沉淀中加入30ml的PBS緩沖液使菌體重懸，置于50ml燒杯中。

6.將重懸后的菌液用超聲破碎儀(Fisher scientific，FB120)進行超聲破碎，超聲條件為：400W，工作5s，間隔5秒，共40min，重復3次。

7.取超聲破碎后的菌液，于10000g，4℃條件下離心40min，將上清倒入鈷柱(含鈷離子的NiNTA樹脂)(clontech，635503)中，待上清液自然流干。

8.加入過量約50ml的20mM濃度的咪唑(安耐吉，E020263-1kg)溶液沖洗鈷柱，以去除雜蛋白，再加入5ml的150mM濃度的咪唑溶液沖洗鈷柱，得到目的蛋白溶液。

經發現，攜帶pHT-tasA-spytag的枯草芽胞桿菌在有IPTG誘導的情況下，分泌TasA-Spytag纖維，加入Spycatcher-Mcherry蛋白進行反應，在熒光顯微鏡下觀察到綁定了蛋白的紅色生物膜；而沒有IPTG誘導的對照組同樣加入Spycatcher-Mcherry蛋白，但看不到特異性結合的紅色生物膜。說明分泌的TasA-Spytag生物膜3具有特異性結合Spycatcher的活性。

實施例6包含TasA-OPH融合蛋白的生物膜平臺

表達tasA-oph生物膜的菌株，可以為基因組整合的組成型表達，也可以為IPTG誘導型表達或者攜帶IPTG誘導表達質粒的菌株，這里以實施例1中ΔtasAΔsinRΔeps三突變的002突變株攜帶pHT01-tasA-oph表達質粒，IPTG誘導TasA-OPH為例，具體步驟為：

1.轉化。將表達質粒轉化生物膜突變株002，轉化方法如下：

(1)活化待轉化的枯草桿菌002。

(2)挑新鮮單克隆接種于3ml的2xYT培養基，37℃過夜振蕩培養。

(3)按1∶100的比例接種過液菌于5ml的medium A中，37℃振蕩培養3.5h。

(4)按1∶10的比例接種medium A中的菌與medium B中，37℃振蕩培養1.5h。

(5)此刻制得感受態細胞，500μl的感受態細胞中加入pHT01-tasA-oph表達質粒至1μg。

(6)37℃靜置60min。

(7)37℃振蕩培養感受態細胞2h，涂于帶氯霉素抗性的平板。

2.生物膜培養。分別接空質粒002/pHT01和突變株002/pHT-tasA-oph于10ml含5μg/ml氯霉素的LB培養基中，37℃，220rpm振蕩培養過夜。次日取出菌液，測定600nm處吸光值。菌液5000g離心10min，用適量含5μg/ml氯霉素的MSGG培養基將菌體懸浮稀釋至OD＝1，然后分別取10ml菌液于培養皿中，加入IPTG(0.5mM)，將培養皿置于30℃培養箱靜置培養。

3.功能鑒定。生物膜培養2天后，5000g離心10min收集菌體。用2ml無菌Ches buffer(pH8-10)重懸菌體，底物對氧磷濃度0.5mM，35℃反應，間隔10-30min取樣測定。反應液離心取上清測定405nm吸光值。由于產物對硝基苯酚(PNP)在405nm有特異性吸收峰，因此可以對照標準曲線用A405計算產物PNP的量。結果表明TasA-OPH生物膜有顯著降解有機磷生成對硝基苯酚的活性。OPH可降解有機磷，屬于生物催化和生物修復領域。

如圖11所示，在IPTG誘導情況下，不加IPTG誘導的以及攜帶空質粒pHT01或只表達TasA-Histag的菌株對照。有IPTG誘導情況下表達TasA-OPH的生物膜能顯著降解有機磷生成對硝基苯酚，405m吸收曲線顯著，而只表達TasA-Histag生物膜或不加IPTG誘導的工程菌或空質粒對照菌則幾乎不降解有機磷。

SEQUENCE LISTING

<110> 上海科技大學

<120> 生物膜平臺及其構建方法和應用

<130> 2016

<160> 91

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 786

<212> DNA

<213> 枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) tasA

<400> 1

atgggtatga aaaagaaatt gagtttagga gttgcttctg cagcactagg attagcttta 60

gttggaggag gaacatgggc agcatttaac gacattaaat caaaggatgc tacttttgca 120

tcaggtacgc ttgatttatc tgctaaagag aattcagcga gtgtgaactt atcaaatcta 180

aagccgggag ataagttgac aaaggatttc caatttgaaa ataacggatc acttgcgatc 240

aaagaagttc taatggcgct taattatgga gattttaaag caaacggcgg cagcaataca 300

tctccagaag atttcctcag ccagtttgaa gtgacattgt tgacagttgg aaaagagggc 360

ggcaatggct acccgaaaaa cattatttta gatgatgcga accttaaaga cttgtatttg 420

atgtctgcta aaaatgatgc agcggctgct gaaaaaatca aaaaacaaat tgaccctaaa 480

ttcttaaatg caagcggtaa agtcaatgta gcaacaattg atggtaaaac cgctcctgaa 540

tatgatggtg ttccaaaaac accaactgac ttcgatcagg ttcaaatgga aatccaattc 600

aaggatgata aaacaaaaga tgaaaaaggg cttatggttc aaaataaata tcaaggcaac 660

tccattaagc ttcaattctc attcgaagct acacagtgga acggcttgac aatcaaaaag 720

gaccatactg ataaagatgg ttacgtgaaa gaaaatgaaa aagcgcatag cgaggataaa 780

aattaa 786

<210> 2

<211> 261

<212> PRT

<213> 枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)TasA

<400> 2

Met Gly Met Lys Lys Lys Leu Ser Leu Gly Val Ala Ser Ala Ala Leu

1 5 10 15

Gly Leu Ala Leu Val Gly Gly Gly Thr Trp Ala Ala Phe Asn Asp Ile

20 25 30

Lys Ser Lys Asp Ala Thr Phe Ala Ser Gly Thr Leu Asp Leu Ser Ala

35 40 45

Lys Glu Asn Ser Ala Ser Val Asn Leu Ser Asn Leu Lys Pro Gly Asp

50 55 60

Lys Leu Thr Lys Asp Phe Gln Phe Glu Asn Asn Gly Ser Leu Ala Ile

65 70 75 80

Lys Glu Val Leu Met Ala Leu Asn Tyr Gly Asp Phe Lys Ala Asn Gly

85 90 95

Gly Ser Asn Thr Ser Pro Glu Asp Phe Leu Ser Gln Phe Glu Val Thr

100 105 110

Leu Leu Thr Val Gly Lys Glu Gly Gly Asn Gly Tyr Pro Lys Asn Ile

115 120 125

Ile Leu Asp Asp Ala Asn Leu Lys Asp Leu Tyr Leu Met Ser Ala Lys

130 135 140

Asn Asp Ala Ala Ala Ala Glu Lys Ile Lys Lys Gln Ile Asp Pro Lys

145 150 155 160

Phe Leu Asn Ala Ser Gly Lys Val Asn Val Ala Thr Ile Asp Gly Lys

165 170 175

Thr Ala Pro Glu Tyr Asp Gly Val Pro Lys Thr Pro Thr Asp Phe Asp

180 185 190

Gln Val Gln Met Glu Ile Gln Phe Lys Asp Asp Lys Thr Lys Asp Glu

195 200 205

Lys Gly Leu Met Val Gln Asn Lys Tyr Gln Gly Asn Ser Ile Lys Leu

210 215 220

Gln Phe Ser Phe Glu Ala Thr Gln Trp Asn Gly Leu Thr Ile Lys Lys

225 230 235 240

Asp His Thr Asp Lys Asp Gly Tyr Val Lys Glu Asn Glu Lys Ala His

245 250 255

Ser Glu Asp Lys Asn

260

<210> 3

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列Histag

<400> 3

His His His His His His

1 5

<210> 4

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列Spytag

<400> 4

Ala His Ile Val Met Val Asp Ala Tyr Lys Pro Thr Lys

1 5 10

<210> 5

<211> 59

<212> PRT

<213> 人工序列Mms6

<400> 5

Gly Gly Thr Ile Trp Thr Gly Lys Gly Leu Gly Leu Gly Leu Gly Leu

1 5 10 15

Gly Leu Gly Ala Trp Gly Pro Ile Ile Leu Gly Val Val Gly Ala Gly

20 25 30

Ala Val Tyr Ala Tyr Met Lys Ser Arg Asp Ile Glu Ser Ala His Ser

35 40 45

Asp Glu Glu Val Glu Leu Arg Asp Ala Leu Ala

50 55

<210> 6

<211> 48

<212> PRT

<213> 人工序列（貽貝足絲蛋白Mefp3）

<400> 6

Ala Asp Tyr Tyr Gly Pro Asn Tyr Gly Pro Pro Arg Arg Tyr Gly Gly

1 5 10 15

Gly Asn Tyr Asn Arg Tyr Asn Arg Tyr Gly Arg Arg Tyr Gly Gly Tyr

20 25 30

Lys Gly Trp Asn Asn Gly Trp Asn Arg Gly Arg Arg Gly Lys Tyr Trp

35 40 45

<210> 7

<211> 47

<212> PRT

<213> 人工序列（貽貝足絲蛋白Mgfp3）

<400> 7

Ala Asp Tyr Tyr Gly Pro Lys Tyr Gly Pro Pro Arg Arg Tyr Gly Gly

1 5 10 15

Gly Asn Tyr Asn Arg Tyr Gly Arg Arg Tyr Gly Gly Tyr Lys Gly Trp

20 25 30

Asn Asn Gly Trp Lys Arg Gly Arg Trp Gly Arg Lys Tyr Tyr His

35 40 45

<210> 8

<211> 74

<212> PRT

<213> 人工序列（貽貝足絲蛋白Mefp5）

<400> 8

Ser Ser Glu Glu Tyr Lys Gly Gly Tyr Tyr Pro Gly Asn Ala Tyr His

1 5 10 15

Tyr His Ser Gly Gly Ser Tyr His Gly Ser Gly Tyr His Gly Gly Tyr

20 25 30

Lys Gly Lys Tyr Tyr Gly Lys Ala Lys Lys Tyr Tyr Tyr Lys Tyr Lys

35 40 45

Asn Ser Gly Lys Tyr Lys Tyr Leu Lys Lys Ala Arg Lys Tyr His Arg

50 55 60

Lys Gly Tyr Lys Tyr Tyr Gly Gly Ser Ser

65 70

<210> 9

<211> 76

<212> PRT

<213> 人工序列（貽貝足絲蛋白Mgfp5）

<400> 9

Ser Ser Glu Glu Tyr Lys Gly Gly Tyr Tyr Pro Gly Asn Thr Tyr His

1 5 10 15

Tyr His Ser Gly Gly Ser Tyr His Gly Ser Gly Tyr His Gly Gly Tyr

20 25 30

Lys Gly Lys Tyr Tyr Gly Lys Ala Lys Lys Tyr Tyr Tyr Lys Tyr Lys

35 40 45

Asn Ser Gly Lys Tyr Lys Tyr Leu Lys Lys Ala Arg Lys Tyr His Arg

50 55 60

Lys Gly Tyr Lys Lys Tyr Tyr Gly Gly Gly Ser Ser

65 70 75

<210> 10

<211> 237

<212> PRT

<213> 人工序列（紅色熒光蛋白Mcherry）

<400> 10

Val Ser Lys Gly Glu Glu Asp Asn Met Ala Ile Ile Lys Glu Phe Met

1 5 10 15

Arg Phe Lys Val His Met Glu Gly Ser Val Asn Gly His Glu Phe Glu

20 25 30

Ile Glu Gly Glu Gly Glu Gly Arg Pro Tyr Glu Gly Thr Gln Thr Ala

35 40 45

Lys Leu Lys Val Thr Lys Gly Gly Pro Leu Pro Phe Ala Trp Asp Ile

50 55 60

Leu Ser Pro Gln Phe Met Tyr Gly Ser Lys Ala Tyr Val Lys His Pro

65 70 75 80

Ala Asp Ile Pro Asp Tyr Leu Lys Leu Ser Phe Pro Glu Gly Phe Lys

85 90 95

Trp Glu Arg Val Met Asn Phe Glu Asp Gly Gly Val Val Thr Val Thr

100 105 110

Gln Asp Ser Ser Leu Gln Asp Gly Glu Phe Ile Tyr Lys Val Lys Leu

115 120 125

Arg Gly Thr Asn Phe Pro Ser Asp Gly Pro Val Met Gln Lys Lys Thr

130 135 140

Met Gly Trp Glu Ala Ser Ser Glu Arg Met Tyr Pro Glu Asp Gly Ala

145 150 155 160

Leu Lys Gly Glu Ile Lys Gln Arg Leu Lys Leu Lys Asp Gly Gly His

165 170 175

Tyr Asp Ala Glu Val Lys Thr Thr Tyr Lys Ala Lys Lys Pro Val Gln

180 185 190

Leu Pro Gly Ala Tyr Asn Val Asn Ile Lys Leu Asp Ile Thr Ser His

195 200 205

Asn Glu Asp Tyr Thr Ile Val Glu Gln Tyr Glu Arg Ala Glu Gly Arg

210 215 220

His Ser Thr Gly Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys Ala Gly

225 230 235

<210> 11

<211> 236

<212> PRT

<213> 人工序列（光活化熒光蛋白Maple3）

<400> 11

Val Ser Lys Gly Glu Glu Thr Ile Met Ser Val Ile Lys Pro Asp Met

1 5 10 15

Lys Ile Lys Leu Arg Met Glu Gly Asn Val Asn Gly His Ala Phe Val

20 25 30

Ile Glu Gly Glu Gly Ser Gly Lys Pro Phe Glu Gly Ile Gln Thr Ile

35 40 45

Asp Leu Glu Val Lys Glu Gly Ala Pro Leu Pro Phe Ala Tyr Asp Ile

50 55 60

Leu Thr Thr Ala Phe His Tyr Gly Asn Arg Val Phe Thr Lys Tyr Pro

65 70 75 80

Arg Lys Ile Pro Asp Tyr Phe Lys Gln Ser Phe Pro Glu Gly Tyr Ser

85 90 95

Trp Glu Arg Ser Met Thr Tyr Glu Asp Gly Gly Ile Cys Asn Ala Thr

100 105 110

Asn Asp Ile Thr Met Glu Glu Asp Ser Phe Ile Asn Lys Ile His Phe

115 120 125

Lys Gly Thr Asn Phe Pro Pro Asn Gly Pro Val Met Gln Lys Arg Thr

130 135 140

Val Gly Trp Glu Val Ser Thr Glu Lys Met Tyr Val Arg Asp Gly Val

145 150 155 160

Leu Lys Gly Asp Val Lys Met Lys Leu Leu Leu Lys Gly Gly Ser His

165 170 175

Tyr Arg Cys Asp Phe Arg Thr Thr Tyr Lys Val Lys Gln Lys Ala Val

180 185 190

Lys Leu Pro Lys Ala His Phe Val Asp His Arg Ile Glu Ile Leu Ser

195 200 205

His Asp Lys Asp Tyr Asn Lys Val Lys Leu Tyr Glu His Ala Val Ala

210 215 220

Arg Asn Ser Thr Asp Ser Met Asp Glu Leu Tyr Lys

225 230 235

<210> 12

<211> 336

<212> PRT

<213> 人工序列（有機磷水解酶OPH）

<400> 12

Ser Ile Gly Thr Gly Asp Arg Ile Asn Thr Val Arg Gly Pro Ile Thr

1 5 10 15

Ile Ser Glu Ala Gly Phe Thr Leu Thr His Glu His Ile Cys Gly Ser

20 25 30

Ser Ala Gly Phe Leu Arg Ala Trp Pro Glu Phe Phe Gly Ser Arg Lys

35 40 45

Ala Leu Ala Glu Lys Ala Val Arg Gly Leu Arg Arg Ala Arg Ala Ala

50 55 60

Gly Val Arg Thr Ile Val Asp Val Ser Thr Phe Asp Ile Gly Arg Asp

65 70 75 80

Val Ser Leu Leu Ala Glu Val Ser Arg Ala Ala Asp Val His Ile Val

85 90 95

Ala Ala Thr Gly Leu Trp Phe Asp Pro Pro Leu Ser Met Arg Leu Arg

100 105 110

Ser Val Glu Glu Leu Thr Gln Phe Phe Leu Arg Glu Ile Gln Tyr Gly

115 120 125

Ile Glu Asp Thr Gly Ile Arg Ala Gly Ile Ile Lys Val Ala Thr Thr

130 135 140

Gly Lys Ala Thr Pro Phe Gln Glu Leu Val Leu Lys Ala Ala Ala Arg

145 150 155 160

Ala Ser Leu Ala Thr Gly Val Pro Val Thr Thr His Thr Ala Ala Ser

165 170 175

Gln Arg Asp Gly Glu Gln Gln Ala Ala Ile Phe Glu Ser Glu Gly Leu

180 185 190

Ser Pro Ser Arg Val Cys Ile Gly His Ser Asp Asp Thr Asp Asp Leu

195 200 205

Ser Tyr Leu Thr Ala Leu Ala Ala Arg Gly Tyr Leu Ile Gly Leu Asp

210 215 220

His Ile Pro His Ser Ala Ile Gly Leu Glu Asp Asn Ala Ser Ala Ser

225 230 235 240

Ala Leu Leu Gly Ile Arg Ser Trp Gln Thr Arg Ala Leu Leu Ile Lys

245 250 255

Ala Leu Ile Asp Gln Gly Tyr Met Lys Gln Ile Leu Val Ser Asn Asp

260 265 270

Trp Leu Phe Gly Phe Ser Ser Tyr Val Thr Asn Ile Met Asp Val Met

275 280 285

Asp Arg Val Asn Pro Asp Gly Met Ala Phe Ile Pro Leu Arg Val Ile

290 295 300

Pro Phe Leu Arg Glu Lys Gly Val Pro Gln Glu Thr Leu Ala Gly Ile

305 310 315 320

Thr Val Thr Asn Pro Ala Arg Phe Leu Ser Pro Thr Leu Arg Ala Ser

325 330 335

<210> 13

<211> 60

<212> PRT

<213> 人工序列Metallothionein（重金屬結合蛋白）

<400> 13

Asp Pro Asn Cys Ser Cys Ala Ala Gly Asp Ser Cys Thr Cys Ala Gly

1 5 10 15

Ser Cys Lys Cys Lys Glu Cys Lys Cys Thr Ser Cys Lys Lys Ser Cys

20 25 30

Cys Ser Cys Cys Pro Val Gly Cys Ala Lys Cys Ala Gln Gly Cys Ile

35 40 45

Cys Lys Gly Ala Ser Asp Lys Cys Ser Cys Cys Ala

50 55 60

<210> 14

<211> 144

<212> PRT

<213> 人工序列PbrR（鉛離子結合蛋白）

<400> 14

Asn Ile Gln Ile Gly Glu Leu Ala Lys Arg Thr Ala Cys Pro Val Val

1 5 10 15

Thr Ile Arg Phe Tyr Glu Gln Glu Gly Leu Leu Pro Pro Pro Gly Arg

20 25 30

Ser Arg Gly Asn Phe Arg Leu Tyr Gly Glu Glu His Val Glu Arg Leu

35 40 45

Gln Phe Ile Arg His Cys Arg Ser Leu Asp Met Pro Leu Ser Asp Val

50 55 60

Arg Thr Leu Leu Ser Tyr Arg Lys Arg Pro Asp Gln Asp Cys Gly Glu

65 70 75 80

Val Asn Met Leu Leu Asp Glu His Ile Arg Gln Val Glu Ser Arg Ile

85 90 95

Gly Ala Leu Leu Glu Leu Lys His His Leu Val Glu Leu Arg Glu Ala

100 105 110

Cys Ser Gly Ala Arg Pro Ala Gln Ser Cys Gly Ile Leu Gln Gly Leu

115 120 125

Ser Asp Cys Val Cys Asp Thr Arg Gly Thr Thr Ala His Pro Ser Asp

130 135 140

<210> 15

<211> 158

<212> DNA

<213> 人工序列P3啟動子（QS活化的啟動子）

<400> 15

aaatacttaa ctgttaaatg taatttgtat ttaatatttt aacataaaaa aatttacagt 60

taagaataaa aaacgactag ttaagaaaaa ttggaaaata aatgctttta gcatgtttta 120

atataactag atcacagaga tgtgatggaa aatagttg 158

<210> 16

<211> 7956

<212> DNA

<213> 表達質粒pHT01序列

<400> 16

ttaagttatt ggtatgactg gttttaagcg caaaaaaagt tgctttttcg tacctattaa 60

tgtatcgttt tagaaaaccg actgtaaaaa gtacagtcgg cattatctca tattataaaa 120

gccagtcatt aggcctatct gacaattcct gaatagagtt cataaacaat cctgcatgat 180

aaccatcaca aacagaatga tgtacctgta aagatagcgg taaatatatt gaattacctt 240

tattaatgaa ttttcctgct gtaataatgg gtagaaggta attactatta ttattgatat 300

ttaagttaaa cccagtaaat gaagtccatg gaataataga aagagaaaaa gcattttcag 360

gtataggtgt tttgggaaac aatttccccg aaccattata tttctctaca tcagaaaggt 420

ataaatcata aaactctttg aagtcattct ttacaggagt ccaaatacca gagaatgttt 480

tagatacacc atcaaaaatt gtataaagtg gctctaactt atcccaataa cctaactctc 540

cgtcgctatt gtaaccagtt ctaaaagctg tatttgagtt tatcaccctt gtcactaaga 600

aaataaatgc agggtaaaat ttatatcctt cttgttttat gtttcggtat aaaacactaa 660

tatcaatttc tgtggttata ctaaaagtcg tttgttggtt caaataatga ttaaatatct 720

cttttctctt ccaattgtct aaatcaattt tattaaagtt catttgatat gcctcctaaa 780

tttttatcta aagtgaattt aggaggctta cttgtctgct ttcttcatta gaatcaatcc 840

ttttttaaaa gtcaatatta ctgtaacata aatatatatt ttaaaaatat cccactttat 900

ccaattttcg tttgttgaac taatgggtgc tttagttgaa gaataaaaga ccacattaaa 960

aaatgtggtc ttttgtgttt ttttaaagga tttgagcgta gcgaaaaatc cttttctttc 1020

ttatcttgat aataagggta actattgccg atcgtccatt ccgacagcat cgccagtcac 1080

tatggcgtgc tgctagcgcc attcgccatt caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc 1140

ggtgcgggcc tcttcgctat tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt 1200

aagttgggta acgccagggt tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgaatt 1260

cgagctcagg ccttaactca cattaattgc gttgcgctca ctgcccgctt tccagtcggg 1320

aaacctgtcg tgccagctgc attaatgaat cggccaacgc gcggggagag gcggtttgcg 1380

tattgggcgc cagggtggtt tttcttttca ccagtgagac gggcaacagc tgattgccct 1440

tcaccgcctg gccctgagag agttgcagca agcggtccac gctggtttgc cccagcaggc 1500

gaaaatcctg tttgatggtg gttaacggcg ggatataaca tgagctgtct tcggtatcgt 1560

cgtatcccac taccgagata tccgcaccaa cgcgcagccc ggactcggta atggcgcgca 1620

ttgcgcccag cgccatctga tcgttggcaa ccagcatcgc agtgggaacg atgccctcat 1680

tcagcatttg catggtttgt tgaaaaccgg acatggcact ccagtcgcct tcccgttccg 1740

ctatcggctg aatttgattg cgagtgagat atttatgcca gccagccaga cgcagacgcg 1800

ccgagacaga acttaatggg cccgctaaca gcgcgatttg ctggtgaccc aatgcgacca 1860

gatgctccac gcccagtcgc gtaccgtctt catgggagaa aataatactg ttgatgggtg 1920

tctggtcaga gacatcaaga aataacgccg gaacattagt gcaggcagct tccacagcaa 1980

tggcatcctg gtcatccagc ggatagttaa tgatcagccc actgacgcgt tgcgcgagaa 2040

gattgtgcac cgccgtttta caggcttcga cgccgcttcg ttctaccatc gacaccacca 2100

cgctggcacc cagttgatcg gcgcgagatt taatcgccgc gacaatttgc gacggcgcgt 2160

gcagggccag actggaggtg gcaacgccaa tcagcaacga ctgtttgccc gccagttgtt 2220

gtgccacgcg gttgggaatg taattcagct ccgccatcgc cgcttccact ttttcccgcg 2280

ttttcgcaga aacgtggctg gcctggttca ccacgcggga aacggtctga taagagacac 2340

cggcatactc tgcgacatcg tataacgtta ctggtttcat caaaatcgtc tccctccgtt 2400

tgaatatttg attgatcgta accagatgaa gcactctttc cactatccct acagtgttat 2460

ggcttgaaca atcacgaaac aataattggt acgtacgatc tttcagccga ctcaaacatc 2520

aaatcttaca aatgtagtct ttgaaagtat tacatatgta agatttaaat gcaaccgttt 2580

tttcggaagg aaatgatgac ctcgtttcca ccggaattag cttggtacca gctattgtaa 2640

cataatcggt acgggggtga aaaagctaac ggaaaaggga gcggaaaaga atgatgtaag 2700

cgtgaaaaat tttttatctt atcacttgaa attggaaggg agattcttta ttataagaat 2760

tgtggaattg tgagcggata acaattccca attaaaggag gaaggatcct ctagagtcga 2820

cgtccccggg gcagcccgcc taatgagcgg gcttttttca cgtcacgcgt ccatggagat 2880

ctttgtctgc aactgaaaag tttatacctt acctggaaca aatggttgaa acatacgagg 2940

ctaatatcgg cttattagga atagtccctg tactaataaa atcaggtgga tcagttgatc 3000

agtatatttt ggacgaagct cggaaagaat ttggagatga cttgcttaat tccacaatta 3060

aattaaggga aagaataaag cgatttgatg ttcaaggaat cacggaagaa gatactcatg 3120

ataaagaagc tctaaaacta ttcaataacc ttacaatgga attgatcgaa agggtggaag 3180

gttaatggta cgaaaattag gggatctacc tagaaagcca caaggcgata ggtcaagctt 3240

aaagaaccct tacatggatc ttacagattc tgaaagtaaa gaaacaacag aggttaaaca 3300

aacagaacca aaaagaaaaa aagcattgtt gaaaacaatg aaagttgatg tttcaatcca 3360

taataagatt aaatcgctgc acgaaattct ggcagcatcc gaagggaatt catattactt 3420

agaggatact attgagagag ctattgataa gatggttgag acattacctg agagccaaaa 3480

aactttttat gaatatgaat taaaaaaaag aaccaacaaa ggctgagaca gactccaaac 3540

gagtctgttt ttttaaaaaa aatattagga gcattgaata tatattagag aattaagaaa 3600

gacatgggaa taaaaatatt ttaaatccag taaaaatatg ataagattat ttcagaatat 3660

gaagaactct gtttgttttt gatgaaaaaa caaacaaaaa aaatccacct aacggaatct 3720

caatttaact aacagcggcc aaactgagaa gttaaatttg agaaggggaa aaggcggatt 3780

tatacttgta tttaactatc tccattttaa cattttatta aaccccatac aagtgaaaat 3840

cctcttttac actgttcctt taggtgatcg cggagggaca ttatgagtga agtaaaccta 3900

aaaggaaata cagatgaatt agtgtattat cgacagcaaa ccactggaaa taaaatcgcc 3960

aggaagagaa tcaaaaaagg gaaagaagaa gtttattatg ttgctgaaac ggaagagaag 4020

atatggacag aagagcaaat aaaaaacttt tctttagaca aatttggtac gcatatacct 4080

tacatagaag gtcattatac aatcttaaat aattacttct ttgatttttg gggctatttt 4140

ttaggtgctg aaggaattgc gctctatgct cacctaactc gttatgcata cggcagcaaa 4200

gacttttgct ttcctagtct acaaacaatc gctaaaaaaa tggacaagac tcctgttaca 4260

gttagaggct acttgaaact gcttgaaagg tacggtttta tttggaaggt aaacgtccgt 4320

aataaaacca aggataacac agaggaatcc ccgattttta agattagacg taaggttcct 4380

ttgctttcag aagaactttt aaatggaaac cctaatattg aaattccaga tgacgaggaa 4440

gcacatgtaa agaaggcttt aaaaaaggaa aaagagggtc ttccaaaggt tttgaaaaaa 4500

gagcacgatg aatttgttaa aaaaatgatg gatgagtcag aaacaattaa tattccagag 4560

gccttacaat atgacacaat gtatgaagat atactcagta aaggagaaat tcgaaaagaa 4620

atcaaaaaac aaatacctaa tcctacaaca tcttttgaga gtatatcaat gacaactgaa 4680

gaggaaaaag tcgacagtac tttaaaaagc gaaatgcaaa atcgtgtctc taagccttct 4740

tttgatacct ggtttaaaaa cactaagatc aaaattgaaa ataaaaattg tttattactt 4800

gtaccgagtg aatttgcatt tgaatggatt aagaaaagat atttagaaac aattaaaaca 4860

gtccttgaag aagctggata tgttttcgaa aaaatcgaac taagaaaagt gcaataaact 4920

gctgaagtat ttcagcagtt ttttttattt agaaatagtg aaaaaaatat aatcagggag 4980

gtatcaatat ttaatgagta ctgatttaaa tttatttaga ctggaattaa taattaacac 5040

gtagactaat taaaatttaa tgagggataa agaggataca aaaatattaa tttcaatccc 5100

tattaaattt taacaagggg gggattaaaa tttaattaga ggtttatcca caagaaaaga 5160

ccctaataaa atttttacta gggttataac actgattaat ttcttaatgg gggagggatt 5220

aaaatttaat gacaaagaaa acaatctttt aagaaaagct tttaaaagat aataataaaa 5280

agagctttgc gattaagcaa aactctttac tttttcattg acattatcaa attcatcgat 5340

ttcaaattgt tgttgtatca taaagttaat tctgttttgc acaacctttt caggaatata 5400

aaacacatct gaggcttgtt ttataaactc agggtcgcta aagtcaatgt aacgtagcat 5460

atgatatggt atagcttcca cccaagttag cctttctgct tcttctgaat gtttttcata 5520

tacttccatg ggtatctcta aatgattttc ctcatgtagc aaggtatgag caaaaagttt 5580

atggaattga tagttcctct ctttttcttc aactttttta tctaaaacaa acactttaac 5640

atctgagtca atgtaagcat aagatgtttt tccagtcata atttcaatcc caaatctttt 5700

agacagaaat tctggacgta aatcttttgg tgaaagaatt tttttatgta gcaatatatc 5760

cgatacagca ccttctaaaa gcgttggtga atagggcatt ttacctatct cctctcattt 5820

tgtggaataa aaatagtcat attcgtccat ctacctatcc tattatcgaa cagttgaact 5880

ttttaatcaa ggatcagtcc tttttttcat tattcttaaa ctgtgctctt aactttaaca 5940

actcgatttg tttttccaga tctcgagggt aactagcctc gccgatcccg caagaggccc 6000

ggcagtcagg tggcactttt cggggaaatg tgcgcggaac ccctatttgt ttatttttct 6060

aaatacattc aaatatgtat ccgctcatga gacaataacc ctgataaatg cttcaataat 6120

attgaaaaag gaagagtatg agtattcaac atttccgtgt cgcccttatt cccttttttg 6180

cggcattttg ccttcctgtt tttgctcacc cagaaacgct ggtgaaagta aaagatgctg 6240

aagatcagtt gggtgcacga gtgggttaca tcgaactgga tctcaacagc ggtaagatcc 6300

ttgagagttt tcgccccgaa gaacgttttc caatgatgag cacttttaaa gttctgctat 6360

gtggcgcggt attatcccgt attgacgccg ggcaagagca actcggtcgc cgcatacact 6420

attctcagaa tgacttggtt gagtactcac cagtcacaga aaagcatctt acggatggca 6480

tgacagtaag agaattatgc agtgctgcca taaccatgag tgataacact gcggccaact 6540

tacttctgac aacgatcgga ggaccgaagg agctaaccgc ttttttgcac aacatggggg 6600

atcatgtaac tcgccttgat cgttgggaac cggagctgaa tgaagccata ccaaacgacg 6660

agcgtgacac cacgatgcct gtagcaatgg caacaacgtt gcgcaaacta ttaactggcg 6720

aactacttac tctagcttcc cggcaacaat taatagactg gatggaggcg gataaagttg 6780

caggaccact tctgcgctcg gcccttccgg ctggctggtt tattgctgat aaatctggag 6840

ccggtgagcg tgggtctcgc ggtatcattg cagcactggg gccagatggt aagccctccc 6900

gtatcgtagt tatctacacg acggggagtc aggcaactat ggatgaacga aatagacaga 6960

tcgctgagat aggtgcctca ctgattaagc attggtaact gtcagaccaa gtttactcat 7020

atatacttta gattgattta aaacttcatt tttaatttaa aaggatctag gtgaagatcc 7080

tttttgataa tctcatgacc aaaatccctt aacgtgagtt ttcgttccac tgagcgtcag 7140

accccgtaga aaagatcaaa ggatcttctt gagatccttt ttttctgcgc gtaatctgct 7200

gcttgcaaac aaaaaaacca ccgctaccag cggtggtttg tttgccggat caagagctac 7260

caactctttt tccgaaggta actggcttca gcagagcgca gataccaaat actgtccttc 7320

tagtgtagcc gtagttaggc caccacttca agaactctgt agcaccgcct acatacctcg 7380

ctctgctaat cctgttacca gtggctgctg ccagtggcga taagtcgtgt cttaccgggt 7440

tggactcaag acgatagtta ccggataagg cgcagcggtc gggctgaacg gggggttcgt 7500

gcacacagcc cagcttggag cgaacgacct acaccgaact gagataccta cagcgtgagc 7560

tatgagaaag cgccacgctt cccgaaggga gaaaggcgga caggtatccg gtaagcggca 7620

gggtcggaac aggagagcgc acgagggagc ttccaggggg aaacgcctgg tatctttata 7680

gtcctgtcgg gtttcgccac ctctgacttg agcgtcgatt tttgtgatgc tcgtcagggg 7740

ggcggagcct atggaaaaac gccagcaacg cggccttttt acggttcctg gccttttgct 7800

ggccttttgc tcacatgttc tttcctgcgt tatcccctga ttctgtggat aaccgtatta 7860

ccgcctttga gtgagctgat accgctcgcc gcagccgaac gaccgagcgc agcgagtcag 7920

tgagcgagga agcggaagag cgcccaatac gcatgc 7956

<210> 17

<211> 5585

<212> DNA

<213> 表達質粒pMK4序列

<400> 17

gcgcccaata cgcaaaccgc ctctccccgc gcgttggccg attcattaat gcagctggca 60

cgacaggttt cccgactgga aagcgggcag tgagcgcaac gcaattaatg tgagttagct 120

cactcattag gcaccccagg ctttacactt tatgcttccg gctcgtatgt tgtgtggaat 180

tgtgagcgga taacaatttc acacaggaaa cagctatgac catgattacg ccaagcttgg 240

ctgcaggtcg acggatcccc gggaattcac tggccgtcgt tttacaacgt cgtgactggg 300

aaaaccctgg cgttacccaa cttaatcgcc ttgcagcaca tccccctttc gccagctggc 360

gtaatagcga agaggcccgc accgatcgcc cttcccaaca gttgcgcagc ctgaatggcg 420

aatggcgcct gatgcggtat tttctcctta cgcatctgtg cggtatttca caccgcatat 480

ggtgcactct cagtacaatc tgctctgatg ccgcatagtt aagccagccc cgacacccgc 540

caacacccgc tgacgcgccc tgacgggctt gtctgctccc ggcatccgct tacagacaag 600

ctgtgaccgt ctccgggagc tgcatgtgtc agaggttttc accgtcatca ccgaaacgcg 660

cgagacgaaa gggcctcgtg atacgcctat ttttataggt taatgtcatg ataataatgg 720

tttcttagac gtcaggtggc acttttcggg gaaatgtgcg cggaacccct atttgtttat 780

ttttctaaat acattcaaat atgtatccgc tcatgagaca ataaccctga taaatgcttc 840

aataatattg aaaaaggaag agtatgagta ttcaacattt ccgtgtcgcc cttattccct 900

tttttgcggc attttgcctt cctgtttttg ctcacccaga aacgctggtg aaagtaaaag 960

atgctgaaga tcagttgggt gcacgagtgg gttacatcga actggatctc aacagcggta 1020

agatccttga gagttttcgc cccgaagaac gttttccaat gatgagcact tttaaagttc 1080

tgctatgtgg cgcggtatta tcccgtattg acgccgggca agagcaactc ggtcgccgca 1140

tacactattc tcagaatgac ttggttgagt actcaccagt cacagaaaag catcttacgg 1200

atggcatgac agtaagagaa ttatgcagtg ctgccataac catgagtgat aacactgcgg 1260

ccaacttact tctgacaacg atcggaggac cgaaggagct aaccgctttt ttgcacaaca 1320

tgggggatca tgtaactcgc cttgatcgtt gggaaccgga gctgaatgaa gccataccaa 1380

acgacgagcg tgacaccacg atgcctgtag caatggcaac aacgttgcgc aaactattaa 1440

ctggcgaact acttactcta gcttcccggc aacaattaat agactggatg gaggcggata 1500

aagttgcagg accacttctg cgctcggccc ttccggctgg ctggtttatt gctgataaat 1560

ctggagccgg tgagcgtggg tctcgcggta tcattgcagc actggggcca gatggtaagc 1620

cctcccgtat cgtagttatc tacacgacgg ggagtcaggc aactatggat gaacgaaata 1680

gacagatcgc tgagataggt gcctcactga ttaagcattg gtaactgtca gaccaagttt 1740

actcatatat actttagatt gatttaaaac ttcattttta atttaaaagg atctaggtga 1800

agatccatat ccttcttttt ctgaaccgac ttctcctttt tcgcttcttt attccaattg 1860

ctttattgac gttgagcctc ggaaccctta acaatcccaa aacttgtcga atggtcggct 1920

taatagctca cgctatgccg acattcgtct gcaagtttag ttaagggttc ttctcaacgc 1980

acaataaatt ttctcggcat aaatgcgtgg tctaattttt atttttaata accttgatag 2040

caaaaaatgc cattccaata caaaaccaca tacctataat cgataaccac ataacagtca 2100

taaaaccact cctttttaac aaactttatc acaagaaata tttaaatttt aaatgccttt 2160

attttgaatt ttaaggggca ttttaaagat ttaggggtaa atcatatagt tttatgccta 2220

aaaacctaca gaagctttta aaaagcaaat atgagccaaa taaatatatt ctaattctac 2280

aaacaaaaat ttgagcaaat tcagtgtcga ttttttaaga cactgcccag ttacatgcaa 2340

attaaaattt tcatgatttt ttatagttcc taacagggtt aaaatttgta taacgaaagt 2400

ataatgttta tataacgtta gtataataaa gcattttaac attatacttt tgataatcgt 2460

ttatcgtcgt catcacaata acttttaaaa tactcgtgca taattcaaca gctgacctcc 2520

caataactac atggtgttat cgggaggtca gctgttagca cttatatttt gttattgttc 2580

ttcctcgatt tcgtctatca ttttgtgatt aatttctctt ttttcttgtt ctgttaagtc 2640

ataaagttca ctagctaaat actctttttg tttccaaata taaaaaattt gatagatata 2700

ttcggttgga tcaatttctt ttaagtaatc taaatcccca ttttttaatt tctttttagc 2760

ctctttaaat aatcctgaat aaactaatac ctgtttacct ttaagtgatt tataaaatgc 2820

atcaaagact ttttgattta ttaaataatc actatcttta ccagaatact tagccatttc 2880

atataattct ttattattat tttgtcttat tttttgaact tgaacttgtg ttatttctga 2940

aatgcccgtt acatcacgcc ataaatctaa ccattcttgt tggctaatat aatatctttt 3000

atctgtgaaa tacgatttat ttactgcaat taacacatga aaatgaggat tataatcatc 3060

tcttttttta ttatatgtaa tctctaactt acgaacatat ccctttataa cactacctac 3120

tttttttctc tttataagtt ttctaaaaga attattataa cgttttattt cattttctaa 3180

ttcatcactc attacattag gtgtagtcaa agttaaaaag ataaactcct ttttctcttg 3240

ctgcttaata tattgcatca tcaaagataa acccaatgca tcttttctag cttttctcca 3300

agcacagaca ggacaaaatc gatttttaca agaattagct ttatataatt tctgtttttc 3360

taaagtttta tcagctacaa aagacagaaa tgtattgcaa tcttcaacta aatccatttg 3420

attctctcca atatgacgtt taataaattt ctgaaatact tgatttcttt gttttttctc 3480

agtatacttt tccatgttat aacacataaa aacaacttag ttttcacaaa ctatgacaat 3540

aaaaaaagtt gctttttccc ctttctatgt atgtttttta ctagtcattt aaaacgatac 3600

attaataggt acgaaaaagc aacttttttt gcgcttaaaa ccagtcatac caataactta 3660

agggtaacta gcctcgccgg caatagttac ccttattatc aagataagaa agaaaaggat 3720

ttttcgctac gctcaaatcc tttaaaaaaa cacaaaagac cacatttttt aatgtggtct 3780

tttattcttc aactaaagca cccattagtt caacaaacga aaattggata aagtgggata 3840

tttttaaaat atatatttat gttacagtaa tattgacttt taaaaaagga ttgattctaa 3900

tgaagaaagc agacaagtaa gcctcctaaa ttcactttag ataaaaattt aggaggcata 3960

tcaaatgaac tttaataaaa ttgatttaga caattggaag agaaaagaga tatttaatca 4020

ttatttgaac caacaaacga cttttagtat aaccacagaa attgatatta gtgttttata 4080

ccgaaacata aaacaagaag gatataaatt ttaccctgca tttattttct tagtgacaag 4140

ggtgataaac tcaaatacag cttttagaac tggttacaat agcgacggag agttaggtta 4200

ttgggataag ttagagccac tttatacaat ttttgatggt gtatctaaaa cattctctgg 4260

tatttggact cctgtaaaga atgacttcaa agagttttat gatttatacc tttctgatgt 4320

agagaaatat aatggttcgg ggaaattgtt tcccaaaaca cctatacctg aaaatgcttt 4380

ttctctttct attattccat ggacttcatt tactgggttt aacttaaata tcaataataa 4440

tagtaattac cttctaccca ttattacagc aggaaaattc attaataaag gtaattcaat 4500

atatttaccg ctatctttac aggtacatca ttctgtttgt gatggttatc atgcaggatt 4560

gtttatgaac tctattcagg aattgtcaga taggcctaat gactggcttt tataatatga 4620

gataatgccg actgtacttt ttacagtcgg ttttctaatg tcactaacct gccccgttag 4680

ttgaagaagg tttttatatt acagctccag atctaggtga agatcctttt tgataatctc 4740

atgaccaaaa tcccttaacg tgagttttcg ttccactgag cgtcagaccc cgtagaaaag 4800

atcaaaggat cttcttgaga tccttttttt ctgcgcgtaa tctgctgctt gcaaacaaaa 4860

aaaccaccgc taccagcggt ggtttgtttg ccggatcaag agctaccaac tctttttccg 4920

aaggtaactg gcttcagcag agcgcagata ccaaatactg ttcttctagt gtagccgtag 4980

ttaggccacc acttcaagaa ctctgtagca ccgcctacat acctcgctct gctaatcctg 5040

ttaccagtgg ctgctgccag tggcgataag tcgtgtctta ccgggttgga ctcaagacga 5100

tagttaccgg ataaggcgca gcggtcgggc tgaacggggg gttcgtgcac acagcccagc 5160

ttggagcgaa cgacctacac cgaactgaga tacctacagc gtgagctatg agaaagcgcc 5220

acgcttcccg aagggagaaa ggcggacagg tatccggtaa gcggcagggt cggaacagga 5280

gagcgcacga gggagcttcc agggggaaac gcctggtatc tttatagtcc tgtcgggttt 5340

cgccacctct gacttgagcg tcgatttttg tgatgctcgt caggggggcg gagcctatgg 5400

aaaaacgcca gcaacgcggc ctttttacgg ttcctggcct tttgctggcc ttttgctcac 5460

atgttctttc ctgcgttatc ccctgattct gtggataacc gtattaccgc ctttgagtga 5520

gctgataccg ctcgccgcag ccgaacgacc gagcgcagcg agtcagtgag cgaggaagcg 5580

gaaga 5585

<210> 18

<211> 7602

<212> DNA

<213> 整合質粒pDG1730序列

<400> 18

aacaaaattc tccagtcttc acatcggttt gaaaggagga agcggaagaa tgaagtaaga 60

gggatttttg actccgaagt aagtcttcaa aaaatcaaat aaggagtgtc aagaatgttt 120

gcaaaacgat tcaaaacctc tttactgccg ttattcgctg gatttttatt gctgtttcat 180

ttggttctgg caggaccggc ggctgcgagt gctgaaacgg cgaacaaatc gaatgagctt 240

acagcaccgt cgatcaaaag cggaaccatt cttcatgcat ggaattggtc gttcaatacg 300

ttaaaacaca atatgaagga tattcatgat gcaggatata cagccattca gacatctccg 360

attaaccaag taaaggaagg gaatcaagga gataaaagca tgtcgaactg gtactggctg 420

tatcagccga catcgtatca aattggcaac cgttacttag gtactgaaca agaatttaaa 480

gaaatgtgtg cagccgctga agaatatggc ataaaggtca ttgttgacgc ggtcatcaat 540

cataccacca gtgattatgc cgcgatttcc aatgaggtta agagtattcc aaactggaca 600

catggaaaca cacaaattaa aaactggtct gatcggatcc tagaagctta tcgaattcct 660

gcagccctgg cgaatggcga ttttcgttcg tgaatacatg ttataataac tataactaat 720

aacgtaacgt gactggcaag agatattttt aaaacaatga ataggtttac acttacttta 780

gttttatgga aatgaaagat catatcatat ataatctaga ataaaattaa ctaaaataat 840

tattatctag ataaaaaatt tagaagccaa tgaaatctat aaataaacta aattaagttt 900

atttaattaa caactatgga tataaaatag gtactaatca aaatagtgag gaggatatat 960

ttgaatacat acgaacaaat taataaagtg aaaaaaatac ttcggaaaca tttaaaaaat 1020

aaccttattg gtacttacat gtttggatca ggagttgaga gtggactaaa accaaatagt 1080

gatcttgact ttttagtcgt cgtatctgaa ccattgacag atcaaagtaa agaaatactt 1140

atacaaaaaa ttagacctat ttcaaaaaaa ataggagata aaagcaactt acgatatatt 1200

gaattaacaa ttattattca gcaagaaatg gtaccgtgga atcatcctcc caaacaagaa 1260

tttatttatg gagaatggtt acaagagctt tatgaacaag gatacattcc tcagaaggaa 1320

ttaaattcag atttaaccat aatgctttac caagcaaaac gaaaaaataa aagaatatac 1380

ggaaattatg acttagagga attactacct gatattccat tttctgatgt gagaagagcc 1440

attatggatt cgtcagagga attaatagat aattatcagg atgatgaaac caactctata 1500

ttaactttat gccgtatgat tttaactatg gacacgggta aaatcatacc aaaagatatt 1560

gcgggaaatg cagtggctga atcttctcca ttagaacata gggagagaat tttgttagca 1620

gttcgtagtt atcttggaga gaatattgaa tggactaatg aaaatgtaaa tttaactata 1680

aactatttaa ataacagatt aaaaaaatta taaaaaaatt gaaaaaatgg tggaaacact 1740

tttttcaatt tttttgtttt attatttaat atttgggaaa tattcattct aattggtaat 1800

cagattttag aaaacaataa acccttgcat agggggatct cgacatggat gagcgatgat 1860

gatatccgtt taggctgggc ggtgatagct tctcgttcag gcagtacgcc tcttttcttt 1920

tccagacctg agggaggcgg aaatggtgtg aggttcccgg ggaaaagcca aataggcgat 1980

cgcgggagtg ctttatttga agatcaggct atcactgcgg tcaatagatt tcacaatgtg 2040

atggctggac agcctgagga actctcgaac ccgaatggaa acaaccagat atttatgaat 2100

cagcgcggct cacatggcgt tgtgctggca aatgcaggtt catcctctgt ctctatcaat 2160

acggcaacaa aattgcctga tggcaggtat gacaataaag ctggagcggg ttcatttcaa 2220

gtgaacgatg gtaaactgac aggcacgatc aatgccaggt ctgtagctgt gctttatcct 2280

gatgatattg caaaagcgcc tcatgttttc cttgagaatt acaaaacagg tgtaacacat 2340

tctttcaatg atcaactgac gattaccttg cgtgcagatg cgaatacaac aaaagccgtt 2400

tatcaaatca ataatggacc agacgacagg cgtttaagga tggagatcaa ttcacaatcg 2460

gaaaaggaga tccaatttgg caaaacatac accatcatgt taaaaggaac gaacagtgat 2520

ggtgtaacga ggaccgagaa atacagtttt gttaaaagag atccagcgtc ggccaaaacc 2580

atcggctatc aaaatccgaa tcattggagc caggtaaatg cttatatcta taaacatgat 2640

gggagccgag taattgaatt gaccggatct tggcctggaa aaccaatgac taaaaatgca 2700

gacggaattt acacgctgac gctgcctgcg gacacggata caaccaacgc aaaagtgatt 2760

tttaataatg gcagcgccca agtgcccggt cagaatcagc ctggctttga ttacgtgcta 2820

aatggtttat ataatgactc gggcttaagc ggttctcttc cccattgagg gcaaggctag 2880

acgggactta ccgaaagaaa ccatcaatga tggtttcttt tttgttcata aatcagacaa 2940

aacttttctc ttgcaaaagt ttgtgaagtg ttgcacaata taaatgtgaa atacttcaca 3000

aacaaaaaga catcaaagag aaacataccc tgcaaggatg ctgatattgt ctgcatttgc 3060

gccggagcaa accaaaaacc tggtgagaca cgccttgaat tagtagaaaa gaacttgaag 3120

attttcaaag gcatcgttag tgaagtcatg gcgagcggat ttgacggcat tttcttagtc 3180

gcgacgcgag gctggatggc cttccccatt atgattcttc tcgcttccgg cggcatcggg 3240

atgcccgcgt tgcaggccat gctgtccagg caggtagatg acgaccatca gggacagctt 3300

caaggatcgc tcgcggctct taccagccta acttcgatca ctggaccgct gatcgtcacg 3360

gcgatttatg ccgcctcggc gagcacatgg aacgggttgg catggattgt aggcgccgcc 3420

ctataccttg tctgcctccc cgcgttgcgt cgcggtgcat ggagccgggc cacctactga 3480

agtggatttc tttaagagct cctttaactt cctcaccagt agttgtatcg gtaccataag 3540

tagaagcagc aacccaagta gctttaccag catccggttc aaccagcata gtaagaatct 3600

tactggacat cggcagttct tcgaacagtg cgccaactac cagctctttc tgcagttcat 3660

tcagggcacc ggagaacctg cgtgcaatcc atcttgttca atcatgcgaa acgatcctca 3720

tcctgtctct tgatccatgg attacgcgtt aacccgggcc cgcggatgca tatgatcaga 3780

tcctttaact ctggcaaccc tcaaaattga atgagacatg ctacacctcc ggataataaa 3840

tatatataaa cgtatataga tttcataaag tctaacacac tagacttatt tacttcgtaa 3900

ttaagtcgtt aaaccgtgtg ctctacgacc aaaactataa aacctttaag aactttcttt 3960

ttttacaaga aaaaagaaat tagataaatc tctcatatct tttattcaat aatcgcatcc 4020

gattgcagta taaatttaac gatcactcat catgttcata tttatcagag ctcgtgctat 4080

aattatacta attttataag gaggaaaaaa tatgggcatt tttagtattt ttgtaatcag 4140

cacagttcat tatcaaccaa acaaaaaata agtggttata atgaatcgtt aataagcaaa 4200

attcatataa ccaaattaaa gagggttata atgaacgaga aaaatataaa acacagtcaa 4260

aactttatta cttcaaaaca taatatagat aaaataatga caaatataag attaaatgaa 4320

catgataata tctttgaaat cggctcagga aaaggccatt ttacccttga attagtaaag 4380

aggtgtaatt tcgtaactgc cattgaaata gaccataaat tatgcaaaac tacagaaaat 4440

aaacttgttg atcacgataa tttccaagtt ttaaacaagg atatattgca gtttaaattt 4500

cctaaaaacc aatcctataa aatatatggt aatatacctt ataacataag tacggatata 4560

atacgcaaaa ttgtttttga tagtatagct aatgagattt atttaatcgt ggaatacggg 4620

tttgctaaaa gattattaaa tacaaaacgc tcattggcat tacttttaat ggcagaagtt 4680

gatatttcta tattaagtat ggttccaaga gaatattttc atcctaaacc taaagtgaat 4740

agctcactta tcagattaag tagaaaaaaa tcaagaatat cacacaaaga taaacaaaag 4800

tataattatt tcgttatgaa atgggttaac aaagaataca agaaaatatt tacaaaaaat 4860

caatttaaca attccttaaa acatgcagga attgacgatt taaacaatat tagctttgaa 4920

caattcttat ctcttttcaa tagctataaa ttatttaata agtaagttaa gggatgcata 4980

aactgcatcc cttaacttgt ttttcgtgtg cctatttttt gtgaatcgat tatgtctttt 5040

gcgcagtcgg cttaaaccag ttttcgctgg tgcgaaaaaa gagtgtcttg tgacacctaa 5100

attcaaaatc tatcggtcag atttataccg atttgatttt atatattctt gaataacata 5160

cgccgagtta tcacataaaa gcgggaacca atcatcaaat ttaaacttca ttgcataatc 5220

cattaaactc ttaaattcta cgattccttg ttcatcaata aactcaatca tttctttaat 5280

taatttatat ctatctgttg ttgttttctt taataattca tcaacatcta caccgccata 5340

aactatcata tcttcttttt gatatttaaa tttattagga tcttaaggcc taggtctaga 5400

gtctttgttt tgacgccatt agcgtacgta acaatcctcg ttaaaggaca aggacctgag 5460

cggaagtgta tcgtacagta gacggagtat actagtatag tctatagtcc gtggaattat 5520

tatatttatc tccgacgata ttctcatcag tgaaatccag ctggagttct ttagcaaatt 5580

tttttattag ctgaacttag tattagtggc catactcctc caatccaaag ctatttagaa 5640

agattactat atcctcaaac aggcggtaac cggcctcttc atcgggaatg cgcgcgacct 5700

tcagcatcgc cggcatgtcc ccctggcgga cgggaagtat ccagctcgag gtcgggccgc 5760

gttgctggcg tttttccata ggctccgccc ccctgacgag catcacaaaa atcgacgctc 5820

aagtcagagg tggcgaaacc cgacaggact ataaagatac caggcgtttc cccctggaag 5880

ctccctcgtg cgctctcctg ttccgaccct gccgcttacc ggatacctgt ccgcctttct 5940

cccttcggga agcgtggcgc tttctcatag ctcacgctgt aggtatctca gttcggtgta 6000

ggtcgttcgc tccaagctgg gctgtgtgca cgaacccccc gttcagcccg accgctgcgc 6060

cttatccggt aactatcgtc ttgagtccaa cccggtaaga cacgacttat cgccactggc 6120

agcagccact ggtaacagga ttagcagagc gaggtatgta ggcggtgcta cagagttctt 6180

gaagtggtgg cctaactacg gctacactag aaggacagta tttggtatct gcgctctgct 6240

gaagccagtt accttcggaa aaagagttga tagctcttga tccggcaaac aaaccaccgc 6300

tggtagcggt ggtttttttg tttgcaagca gcagattacg cgcagaaaaa aaggatctca 6360

agaagatcct ttgatctttt ctacggggtc tgacgctcag tggaacgaaa actcacgtta 6420

agggattttg gtcatgagat tatcaaaaag gatcttcacc tagatccttt taaattaaaa 6480

atgaagtttt aaatcaatct aaagtatata tgagtaaact tggtctgaca gttaccaatg 6540

cttaatcagt gaggcaccta tctcagcgat ctgtctattt cgttcatcca tagttgcctg 6600

actccccgtc gtgtagataa ctacgatacg ggagggctta ccatctggcc ccagtgctgc 6660

aatgataccg cgagacccac gctcaccggc tccagattta tcagcaataa accagccagc 6720

cggaagggcc gagcgcagaa gtggtcctgc aactttatcc gcctccatcc agtctattaa 6780

ttgttgccgg gaagctagag taagtagttc gccagttaat agtttgcgca acgttgttgc 6840

cattgctgca ggcatcgtgg tgtcacgctc gtcgtttggt atggcttcat tcagctccgg 6900

ttcccaacga tcaaggcgag ttacatgatc ccccatgttg tgcaaaaaag cggttagctc 6960

cttcggtcct ccgatcgttg tcagaagtaa gttggccgca gtgttatcac tcatggttat 7020

ggcagcactg cataattctc ttactgtcat gccatccgta agatgctttt ctgtgactgg 7080

tgagtactca accaagtcat tctgagaata gtgtatgcgg cgaccgagtt gctcttgccc 7140

ggcgtcaaca cgggataata ccgcgccaca tagcagaact ttaaaagtgc tcatcattgg 7200

aaaacgttct tcggggcgaa aactctcaag gatcttaccg ctgttgagat ccagttcgat 7260

gtaacccact cgtgcaccca actgatcttc agcatctttt actttcacca gcgtttctgg 7320

gtgagcaaaa acaggaaggc aaaatgccgc aaaaaaggga ataagggcga cacggaaatg 7380

ttgaatactc atactcttcc tttttcaata ttattgaagc atttatcagg gttattgtct 7440

catgagcgga tacatatttg aatgtattta gaaaaataaa caaatagggg ttccgcgcac 7500

atttccccga aaagtgccac ctgacgtcta agaaaccatt attatcatga cattaaccta 7560

taaaaatagg cgtatcacga ggccctttcg tcttcaagaa tt 7602

<210> 19

<211> 79

<212> PRT

<213> 人工序列（放射性鈾結合蛋白SUP）

<400> 19

Leu Asp Cys Arg Glu Arg Ile Glu Lys Asp Leu Glu Asn Leu Glu Lys

1 5 10 15

Glu Leu Met Glu Met Lys Ser Ile Lys Leu Ser Asp Asp Glu Glu Ala

20 25 30

Val Val Glu Arg Ala Leu Asn Tyr Arg Asp Asp Ser Val Tyr Tyr Leu

35 40 45

Glu Lys Gly Asp His Ile Thr Ser Phe Gly Cys Ile Thr Tyr Ala Glu

50 55 60

Gly Leu Thr Asp Ser Leu Arg Met Leu His Arg Ile Ile Glu Gly

65 70 75

<210> 20

<211> 1113

<212> DNA

<213> 人工序列（合成的P2-agrBD-ter序列）

<400> 20

ggatcctatt ttccatcaca tctctgtgat ctagttatat taaaacatgc taaaagcatt 60

tattttccaa tttttcttaa ctagtcgttt tttattctta actgtaaatt tttttatgtt 120

aaaatattaa atacaaatta catttaacag ttaagtattt atttcctaca gttaggcaat 180

ataatgataa aagattgtac taaatcgtat aatgacagtg aggagagtgg tgtaaaaaag 240

cttttgaatt attttgataa taaaattgac cagtttgcca cgtatcttca aaagagaaat 300

aacttagatc atattcaatt tttgcaagta cgattaggga tgcaggtctt agctaaaaat 360

ataggtaaat taattgttat gtatactatt gcctatattt taaacatttt tctgtttacg 420

ttaattacga atttaacatt ttatttaata agaagacatg cacatggtgc acatgcacct 480

tcttcttttt ggtgttatgt agaaagtatt atactattta tacttttacc tttagtaata 540

gtaaattttc atattaactt tttaattatg attattttaa cagttatttc tttaggtgta 600

atctcagtat atgctcctgc agcaactaaa aagaagccca ttcctgtgcg acttattaaa 660

cgaaaaaaat attatgcgat tattgttagt ttaacccttt tcattatcac acttatcatc 720

aaagagccat ttgcccaatt cattcaatta ggcatcataa tagaagctat tacattatta 780

cctattttct ttattaagga ggacttaaaa tgaatacatt atttaactta ttttttgatt 840

ttattactgg gattttaaaa aacattggta acatcgcagc ttatagtact tgtgacttca 900

taatggatga agttgaagta ccaaaagaat taacacaatt acacgaataa agatctgtcg 960

actactagag ccaggcatca aataaaacga aaggctcagt cgaaagactg ggcctttcgt 1020

tttatctgtt gtttgtcggt gaacgctctc tactagagtc acactggctc accttcgggt 1080

gggcctttct gcgtttatat actagaggaa ttc 1113

<210> 21

<211> 2063

<212> DNA

<213> agrCA序列

<400> 21

aagcttagat ctagagagtg tgatagtagg tggaattatt aaatagttat aattttgttt 60

tattcgtatt aactcaaatg atattaatgt ttacaatacc agctataatt agtggtatta 120

agtacagtaa acttgattat tttttcatca tagtaatttc gacattatcg ttatttctat 180

ttaaaatgtt tgatagcgcg tccttaatca tattaacttc atttattatt ataatgtatt 240

ttgtcaaaat caaatggtat tctattttgt tgattatgac ttcgcagatt attctatact 300

gtgctaacta catgtatata gttatatatg catatatcac caaaatttct gatagtatat 360

ttgtaatatt ccctagcttt tttgtagttt atgtgactat tagtatacta ttctcatata 420

taataaatag agttctcaaa aaaattagca caccatatct aatactaaac aaaggatttt 480

taatagttat ttcgactatc ttactgctta ctttttcatt atttttcttt tattcacaaa 540

taaactcgga tgaagctaaa gtaataaggc agtattcttt tatttttatt ggtatcacta 600

tatttttaag tatattaaca tttgttattt ctcaatttct ccttaaagag atgaaatata 660

aacgtaatca agaagaaatt gaaacctatt atgaatatac attgaagatt gaagctatca 720

acaacgaaat gcgcaagttc cgtcatgatt atgtcaatat cttaacgaca ctttcagaat 780

acattcgaga agatgacatg cctggcctac gtgattattt caataaaaat attgtaccta 840

tgaaagacaa tttacaaatg aatgctataa aattaaatgg tatcgagaat cttaaagtac 900

gtgaaattaa aggcttaatt actgcgaaaa ttttacgtgc acaagaaatg aatattccga 960

ttagtatcga aatacccgat gaagtaagta gcattaactt gaatatgatc gatttaagtc 1020

gcagtattgg tattattctt gataatgcaa ttgaggcatc aactgaaatt gatgacccta 1080

tcattcgcgt tgcatttatt gaaagtgaaa attcagtaac gtttattgtt atgaataaat 1140

gcgctgatga tataccacgc attcatgaat tgttccaaga aagtttttct actaaaggtg 1200

aaggtcgtgg tttaggtcta tcaactttaa aagaaattgc tgataatgca gacaatgtct 1260

tattagatac aattatcgaa aatggtttct ttattcaaaa agttgaaatt attaacaact 1320

agccataagg atgtgaatgt atgaaaattt tcatttgcga agacgatcca aaacaaagag 1380

aaaacatggt taccattatt aaaaattata taatgataga agaaaagcct atggaaattg 1440

ccctcgcaac tgataatcct tatgaggtgc ttgagcaagc taaaaatatg aatgacatag 1500

gctgttactt tttagatatt caactttcaa ctgatattaa tggtatcaaa ttaggcagtg 1560

aaattcgtaa gcatgaccca gttggtaaca ttattttcgt tacgagtcac agtgaactta 1620

cctatttaac atttgtctac aaagttgcag cgatggattt tatttttaaa gatgatccag 1680

ctgaattaag aactcgaatt atagactgtt tagaaactgc acatacacgc ttacaattgt 1740

tgtctaaaga taatagcgtt gaaacgattg aattaaaacg tggcagtaat tcagtgtatg 1800

ttcaatatga tgatattatg ttttttgaat catcaacaaa atctcacaga ctcattgccc 1860

atttagataa ccgtcaaatt gaattttatg gtaatttaaa agaactgagt caattagatg 1920

atcgtttctt tagatgtcat aatagctttg tcgtcaatcg ccataatatt gaatctatag 1980

attcgaaaga gcgaattgtc tattttaaaa ataaagaaca ctgctatgca tcggtgagaa 2040

acgttaaaaa aatataagtc gac 2063

<210> 22

<211> 33

<212> DNA

<213> D tasAsinR Upstream-F

<400> 22

ggggtcgaca tgtttcgatt gtttcacaat cag 33

<210> 23

<211> 43

<212> DNA

<213> D tasAsinR Upstream-R

<400> 23

tcataccgta aatcctttct gattaagtag acatggtgct gtc 43

<210> 24

<211> 43

<212> DNA

<213> D tasAsinR downstream-F

<400> 24

gacagcacca tgtctactta atcagaaagg atttacggta tga 43

<210> 25

<211> 30

<212> DNA

<213> D tasAsinR downstream-R

<400> 25

gcgagatctg cgtttttttc aagcaaacag 30

<210> 26

<211> 29

<212> DNA

<213> D eps Upstream-F

<400> 26

aaaggatccg caatcctcgg actggcggg 29

<210> 27

<211> 46

<212> DNA

<213> D eps Upstream-R

<400> 27

gagaatcaaa ataaaccttc cgcgtattca tagccttcag ccttcc 46

<210> 28

<211> 46

<212> DNA

<213> D eps downstream -F

<400> 28

ggaaggctga aggctatgaa tacgcggaag gtttattttg attctc 46

<210> 29

<211> 29

<212> DNA

<213> D eps downstream-R

<400> 29

aaagtcgact tccgctgcga tgtgcccat 29

<210> 30

<211> 59

<212> DNA

<213> D tasA Upstream-F

<400> 30

ttacacatta actagacaga tctatcgatg catgccatgg aaaccagaaa gcggactta 59

<210> 31

<211> 25

<212> DNA

<213> D tasA Upstream-R

<400> 31

taacagcaaa aaaaagagac ggccc 25

<210> 32

<211> 57

<212> DNA

<213> D tasA downstream-F

<400> 32

tatgaatact gggccgtctc ttttttttgc tgttaggtaa gctccccttt tattgaa 57

<210> 33

<211> 55

<212> DNA

<213> D tasA downstream-R

<400> 33

tctgcagaag cttctagaat tcgagctccc gggatcaaac ggatacgaaa ggcac 55

<210> 34

<211> 39

<212> DNA

<213> Bam-tasA-F

<400> 34

gggggatcca tgggtatgaa aaagaaattg agtttagga 39

<210> 35

<211> 39

<212> DNA

<213> Sma-tasA-R

<400> 35

gggcccgggt taatttttat cctcgctatg cgctttttc 39

<210> 36

<211> 39

<212> DNA

<213> Sma-tasA-histag-R

<400> 36

gggcccgggt tagtggtggt ggtggtggtg atttttatc 39

<210> 37

<211> 93

<212> DNA

<213> Sma-tasA-spytag-R

<400> 37

gggcccgggt tatttggtgg gtttatatgc atcgaccata acgatgtgcg cggagccccc 60

gccggagccc ccgccatttt tatcctcgct atg 93

<210> 38

<211> 38

<212> DNA

<213> Sma-tasA-mgfp3-R

<400> 38

gggcccgggt tagtggtggt ggtggtggtg atgataat 38

<210> 39

<211> 38

<212> DNA

<213> Sma-mgfp5-tasA-F

<400> 39

gggcccggga tgagttctga agaatacaaa ggtggtta 38

<210> 40

<211> 37

<212> DNA

<213> Sma-mgfp5-tasA-R

<400> 40

gggcccgggt tagtggtggt ggtggtggtg attttta 37

<210> 41

<211> 85

<212> DNA

<213> tasA-F

<400> 41

tctttattat aagaattgtg gaattgtgag cggataacaa ttcccaatta aaggaggaag 60

atgggtatga aaaagaaatt gagtt 85

<210> 42

<211> 87

<212> DNA

<213> tasA-R

<400> 42

ttcgggccat agtaatccgc ggatcctgag cctcctcctc ctgatcctcc gccgccgccg 60

gcatttttat cctcgctatg cgctttt 87

<210> 43

<211> 87

<212> DNA

<213> tasA-mefp3-F

<400> 43

aaaagcgcat agcgaggata aaaatgccgg cggcggcgga ggatcaggag gaggaggctc 60

aggatccgcg gattactatg gcccgaa 87

<210> 44

<211> 112

<212> DNA

<213> tasA-mefp3-R

<400> 44

tgaaaaaagc ccgctcatta ggcgggctgc cccggggacg tcgactctag aggatcttat 60

ggccaatgat gatggtgatg atggtgacta gtccagtatt tgccgcgtct gc 112

<210> 45

<211> 89

<212> DNA

<213> tasA-mefp5-F

<400> 45

aaaagcgcat agcgaggata aaaatgccgg cggcggcgga ggatcaggag gaggaggctc 60

aggatccagc agcgaagagt ataagggcg 89

<210> 46

<211> 114

<212> DNA

<213> tasA-mefp5-R

<400> 46

tgaaaaaagc ccgctcatta ggcgggctgc cccggggacg tcgactctag aggatcttat 60

ggccaatgat gatggtgatg atggtgacta gtgctgctgc cgccgtaata ctta 114

<210> 47

<211> 86

<212> DNA

<213> tasA-mms6-F

<400> 47

cgtgaaagaa aatgaaaaag cgcatagcga ggataaaaat ggcggcggag gatcaggcgg 60

cggcggcagc ggcggcacaa tttgga 86

<210> 48

<211> 90

<212> DNA

<213> tasA-mms6-R

<400> 48

cgctcattag gcgggctgcc ccggggacgt cgactctaga ggatcttaat gatgatggtg 60

atgatggtgt gccagcgcat cgcgcagttc 90

<210> 49

<211> 30

<212> DNA

<213> mts-F

<400> 49

aaaggatccg accctaattg ttcttgcgca 30

<210> 50

<211> 30

<212> DNA

<213> mts-R

<400> 50

aatactagtc gcgcaacagc tgcatttatc 30

<210> 51

<211> 29

<212> DNA

<213> pbrR-F

<400> 51

aaaggatcca atatccagat cggcgagct 29

<210> 52

<211> 29

<212> DNA

<213> pbrR-R

<400> 52

aaaactagtg tcgcttggat gggcggtgg 29

<210> 53

<211> 87

<212> DNA

<213> tasA-mcherry-F

<400> 53

aaaagcgcat agcgaggata aaaatgccgg cggcggcgga ggatcaggag gaggaggctc 60

aggatccgtg agcaagggcg aggagga 87

<210> 54

<211> 107

<212> DNA

<213> tasA-mcherry-R

<400> 54

tgaaaaaagc ccgctcatta ggcgggctgc cccggggacg tcgactctag aggatcttaa 60

tgatgatggt gatgatggtg actagtaccc gccttgtaca gctcgtc 107

<210> 55

<211> 89

<212> DNA

<213> tasA-maple3-F

<400> 55

aaaagcgcat agcgaggata aaaatgccgg cggcggcgga ggatcaggag gaggaggctc 60

aggatccgtg agcaaaggcg aggagacaa 89

<210> 56

<211> 117

<212> DNA

<213> tasA-maple3-R

<400> 56

tgaaaaaagc ccgctcatta ggcgggctgc cccggggacg tcgactctag aggatcttat 60

ggccaatgat gatggtgatg atggtgacta gtcttataga gttcgtccat gctgtcg 117

<210> 57

<211> 23

<212> DNA

<213> tasA-OPH-F

<400> 57

cgtgaaagaa aatgaaaaag cgc 23

<210> 58

<211> 22

<212> DNA

<213> tasA-OPH-R

<400> 58

tgaaaaaagc ccgctcatta gg 22

<210> 59

<211> 24

<212> DNA

<213> Bam-OPH no his F

<400> 59

tcaggatcct ctatcggtac cggt 24

<210> 60

<211> 43

<212> DNA

<213> Xba-OPH no his R

<400> 60

gactctagag gatcttaact agttgacgcc cgcaaggtcg gtg 43

<210> 61

<211> 62

<212> DNA

<213> upstream-F

<400> 61

ttacacatta actagacaga tctatcgatg catgccatgg aaaccagaaa gcggacttaa 60

gc 62

<210> 62

<211> 25

<212> DNA

<213> upstream-R

<400> 62

taacagcaaa aaaaagagac ggccc 25

<210> 63

<211> 22

<212> DNA

<213> downstream-F

<400> 63

agcaactcct aaactcaatt tc 22

<210> 64

<211> 54

<212> DNA

<213> downstream-R

<400> 64

tctgcagaag cttctagaat tcgagctccc gggtaaaaca aaaggtgata ataa 54

<210> 65

<211> 21

<212> DNA

<213> th-tasA-F

<400> 65

atgggtatga aaaagaaatt g 21

<210> 66

<211> 56

<212> DNA

<213> histag-R

<400> 66

tatgaatact gggccgtctc ttttttttgc tgttattagt ggtggtggtg gtggtg 56

<210> 67

<211> 56

<212> DNA

<213> mefp3-5-R

<400> 67

tatgaatact gggccgtctc ttttttttgc tgttattatg gccaatgatg atggtg 56

<210> 68

<211> 56

<212> DNA

<213> mecherry-R

<400> 68

tatgaatact gggccgtctc ttttttttgc tgttattaat gatgatggtg atgatg 56

<210> 69

<211> 50

<212> DNA

<213> tasAoph-mad F

<400> 69

gtcgggcgat atcggatcca tatgacgatg ggtatgaaaa agaaattgag 50

<210> 70

<211> 44

<212> DNA

<213> oph-R

<400> 70

tcataccgta aatcctttct gattaactag tgctcgctct cagt 44

<210> 71

<211> 44

<212> DNA

<213> sinI-F

<400> 71

actgagagcg agcactagtt aatcagaaag gatttacggt atga 44

<210> 72

<211> 61

<212> DNA

<213> sinI-mad R

<400> 72

cattaactag acagatctat cgatgcatgc catggtaccc gcgttttttt caagcaaaca 60

g 61

<210> 73

<211> 33

<212> DNA

<213> Sal-dA upstream-F

<400> 73

ggggtcgaca tgtttcgatt gtttcacaat cag 33

<210> 74

<211> 41

<212> DNA

<213> dA upstream-R

<400> 74

gactggaaag cgggcagtga ttaagtagac atggtgctgt c 41

<210> 75

<211> 42

<212> DNA

<213> dC downstream-F

<400> 75

accaccacca ccaccactga tcagaaagga tttacggtat ga 42

<210> 76

<211> 30

<212> DNA

<213> bgl-dC downstream-R

<400> 76

gcgagatctg cgtttttttc aagcaaacag 30

<210> 77

<211> 41

<212> DNA

<213> tasA-histagF

<400> 77

gacagcacca tgtctactta atcactgccc gctttccagt c 41

<210> 78

<211> 42

<212> DNA

<213> tasA-histag-R

<400> 78

tcataccgta aatcctttct gatcagtggt ggtggtggtg gt 42

<210> 79

<211> 36

<212> DNA

<213> hindbgl-agrCAF

<400> 79

cccaagctta gatctagaga gtgtgatagt aggtgg 36

<210> 80

<211> 31

<212> DNA

<213> sal-agrCA R

<400> 80

cctgtcgact tatatttttt taacgtttct c 31

<210> 81

<211> 87

<212> DNA

<213> P3-pMK F

<400> 81

agcggataac aatttcacac aggaaacagc tatgaccatg attacgccaa gcttggctgc 60

aggttttaca ccactctcct cactgtc 87

<210> 82

<211> 66

<212> DNA

<213> P3-tas R

<400> 82

cagaagcaac tcctaaactc aatttctttt tcatacccat caactatttt ccatcacatc 60

tctgtg 66

<210> 83

<211> 54

<212> DNA

<213> Tas-P3 F

<400> 83

cacagagatg tgatggaaaa tagttgatgg gtatgaaaaa gaaattgagt ttag 54

<210> 84

<211> 88

<212> DNA

<213> TH-pMK R

<400> 84

gtaacgccag ggttttccca gtcacgacgt tgtaaaacga cggccagtga attcccgggg 60

atcttagtgg tggtggtggt ggtgattt 88

<210> 85

<211> 90

<212> DNA

<213> TMCH-pMK R

<400> 85

gtaacgccag ggttttccca gtcacgacgt tgtaaaacga cggccagtga attcccgggg 60

atcttaatga tgatggtgat gatggtgact 90

<210> 86

<211> 24

<212> DNA

<213> Bam-me3 F

<400> 86

acaggatccg cggattacta tggc 24

<210> 87

<211> 23

<212> DNA

<213> Sma-me35 R

<400> 87

tggcccgggg acgtcgactc tag 23

<210> 88

<211> 27

<212> DNA

<213> Bam-me5 F

<400> 88

acaggatcca gcagcgaaga gtataag 27

<210> 89

<211> 23

<212> DNA

<213> Bam-oph F

<400> 89

aaaggatcct caattggcac ggg 23

<210> 90

<211> 24

<212> DNA

<213> Sma-oph R

<400> 90

ggccccgggt taactagtgc tcgc 24

<210> 91

<211> 386

<212> PRT

<213> 合成Spycatcher-Mcherry人工序列（氨基酸）

<400> 91

Met Asp Tyr Asp Ile Pro Thr Thr Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Ala

1 5 10 15

Met Val Asp Thr Leu Ser Gly Leu Ser Ser Glu Gln Gly Gln Ser Gly

20 25 30

Asp Met Thr Ile Glu Glu Asp Ser Ala Thr His Ile Lys Phe Ser Lys

35 40 45

Arg Asp Glu Asp Gly Lys Glu Leu Ala Gly Ala Thr Met Glu Leu Arg

50 55 60

Asp Ser Ser Gly Lys Thr Ile Ser Thr Trp Ile Ser Asp Gly Gln Val

65 70 75 80

Lys Asp Phe Tyr Leu Tyr Pro Gly Lys Tyr Thr Phe Val Glu Thr Ala

85 90 95

Ala Pro Asp Gly Tyr Glu Val Ala Thr Ala Ile Thr Phe Thr Val Asn

100 105 110

Glu Gln Gly Gln Val Thr Val Asn Gly Lys Ala Thr Lys Gly Asp Ala

115 120 125

His Ile Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Tyr Tyr His

130 135 140

His His His His His Val Ser Lys Gly Glu Glu Asp Asn Met Ala Ile

145 150 155 160

Ile Lys Glu Phe Met Arg Phe Lys Val His Met Glu Gly Ser Val Asn

165 170 175

Gly His Glu Phe Glu Ile Glu Gly Glu Gly Glu Gly Arg Pro Tyr Glu

180 185 190

Gly Thr Gln Thr Ala Lys Leu Lys Val Thr Lys Gly Gly Pro Leu Pro

195 200 205

Phe Ala Trp Asp Ile Leu Ser Pro Gln Phe Met Tyr Gly Ser Lys Ala

210 215 220

Tyr Val Lys His Pro Ala Asp Ile Pro Asp Tyr Leu Lys Leu Ser Phe

225 230 235 240

Pro Glu Gly Phe Lys Trp Glu Arg Val Met Asn Phe Glu Asp Gly Gly

245 250 255

Val Val Thr Val Thr Gln Asp Ser Ser Leu Gln Asp Gly Glu Phe Ile

260 265 270

Tyr Lys Val Lys Leu Arg Gly Thr Asn Phe Pro Ser Asp Gly Pro Val

275 280 285

Met Gln Lys Lys Thr Met Gly Trp Glu Ala Ser Ser Glu Arg Met Tyr

290 295 300

Pro Glu Asp Gly Ala Leu Lys Gly Glu Ile Lys Gln Arg Leu Lys Leu

305 310 315 320

Lys Asp Gly Gly His Tyr Asp Ala Glu Val Lys Thr Thr Tyr Lys Ala

325 330 335

Lys Lys Pro Val Gln Leu Pro Gly Ala Tyr Asn Val Asn Ile Lys Leu

340 345 350

Asp Ile Thr Ser His Asn Glu Asp Tyr Thr Ile Val Glu Gln Tyr Glu

355 360 365

Arg Ala Glu Gly Arg His Ser Thr Gly Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys

370 375 380

Ala Gly

385