1.一種用于D-核糖生產的枯草芽孢桿菌工程菌,其特征在于,所述工程菌為枯草芽孢桿菌SFA-H43菌株中轉酮酶基因替換為SEQ ID NO.7所示基因序列后獲得的工程菌。
2.一種用于D-核糖生產的枯草芽孢桿菌工程菌,其特征在于,枯草芽孢桿菌SFA-H43菌株中轉酮酶基因終止密碼子前500bp序列,替換為枯草芽孢桿菌SFR-4菌株的轉酮酶基因終止密碼子前500bp序列獲得的工程菌。
3.一株用于D-核糖生產的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)工程菌SFR-43T,該菌株于2016年11月22日保藏于中國典型培養物保藏中心,保藏地址為:湖北省武漢市武昌珞珈山,保藏號為:CCTCC M 2016666。
4.一種用于D-核糖生產的枯草芽孢桿菌工程菌的構建方法,其特征在于,通過同源重組的方法,將枯草芽孢桿菌SFA-H43菌株中轉酮酶基因替換為SEQ ID NO.7所示基因。
5.根據權利要求4所述的方法,其特征在于,SEQ ID NO.7所示基因序列源自枯草芽孢桿菌SFR-4菌株。
6.根據權利要求5所述的方法,其特征在于,同源重組的方法中,枯草芽孢桿菌SFA-H43菌株中轉酮酶基因終止密碼子前500bp序列替換為枯草芽孢桿菌SFR-4菌株的轉酮酶基因終止密碼子前500bp序列。
7.根據權利要求5所述的方法,其特征在于,所述工程菌的構建方法為:
(1)以菌株SFR-4基因組為模板,擴增該菌株轉酮酶基因終止密碼子前500bp片段,稱為L-tkt,其中下游引物含有質粒p7Z6的lox71-zeo-lox66片段前端25bp互補序列;優選的,所用引物序列為SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示;
(2)以菌株SFA-H43基因組為模板,擴增其轉酮酶基因下游500bp片段,為R-tkt,其中上游引物含有質粒p7Z6的lox71-zeo-lox66末端25bp互補序列;優選的,所用引物序列為SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示;
(3)以質粒p7Z6為模板,擴增攜帶有lox位點的博來霉素抗性基因片段lox71-zeo-lox66;優選的,所用引物序列為SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示;
(4)采用融合PCR方法,將L-tkt、lox71-zeo-lox66、R-tkt融合;優選的,融合PCR所用引物序列為SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.4所示;
(5)將融合片段轉化菌株SFA-H43,通過博來霉素抗性平板篩選整合型重組突變菌株,獲得含有菌株SFR-4轉酮酶突變位點的菌株SFA-H43的工程菌株,并采用Cre/lox系統方法敲除工程菌株中的抗性基因zeo,獲得不帶抗生素抗性基因的安全轉酮酶突變工程菌株,命名為SFR-43T。
8.權利要求1-3任一項所述工程菌在發酵生產D-核糖和/3-羥基丁酮中的應用。
9.一種利用權利要求1-3任一項所述工程菌發酵生產D-核糖和/3-羥基丁酮的方法,其采用如下的搖瓶發酵和/發酵罐發酵方式:
(1)菌種培養:將工程菌株活化后接種到種子培養基培養,獲得一級種子和/二級種子;
(2)搖瓶發酵:將步驟(1)培養好的一級種子接種到裝有發酵培養基的搖瓶中,搖瓶培養至發酵液中D-核糖含量不再增加,結束發酵;
(3)發酵罐發酵:將步驟(1)培養好的一級或二級種子接種到發酵罐中,進行通風攪拌培養,培養過程中,控制pH,通過調節攪拌轉速和通風比,控制溶解氧進行發酵。
10.根據權利要求9所述的方法,其特征在于,
步驟(1)中菌種培養為:取35-40℃培養2-3天工程菌株的新鮮斜面,用接種環取1-2環斜面菌種,接種到50ml液體種子培養基中,35-40℃,150-200rpm,搖瓶培養10-16小時,是為一級種子;將一級種子以1-10%的(體積百分數)接種種子培養基,35-40℃培養6-12小時,是為二級種子;
或者,步驟(2)搖瓶發酵:將步驟(1)培養好的一級種子以1-10%(體積百分數)的接種量接種到裝有發酵培養基的搖瓶中,35-40℃、180-220rpm,搖瓶培養至發酵液中D-核糖含量不再增加,結束發酵;
或者,步驟(3)發酵罐發酵:將步驟(1)培養好的一級或二級種子以1-10%(體積百分數)的接種量接種到發酵罐中(65-75%的裝液量),35-40℃進行通風攪拌培養,培養過程中,控制pH在5-7,通過調節攪拌轉速和通風比,保持發酵液中相對溶解氧濃度5-30%;
優選的,斜面培養所用的斜面菌種培養基的組成為:酵母浸提物5g/L,蛋白胨10g/L,NaCl 3g/L,瓊脂20g/L,其余為水,pH7.0-7.2;
優選的,液體一級種子培養基的組成為:葡萄糖20-40g/L,酵母浸提物2-10g/L,玉米漿8-12g/L,pH 7.0-7.2;
優選的,二級種子培養基的組成為:葡萄糖30-60g/L,酵母浸提物2-10g/L,玉米漿8-12g/L,(NH4)2SO4 2-3g/L,MgSO4 2g/L,pH 7.0-7.2;
優選的,搖瓶發酵培養基組成為:葡萄糖120-150g/L,酵母浸提物2-10g/L,玉米漿5-15g/L,(NH4)2SO4 2-3g/L,MgSO4 2g/L,MnSO4 0.2g/L,pH 7.0-7.2;
優選的,發酵罐發酵初始培養基組成為:葡萄糖120-150g/L,酵母浸提物3-6g/L,玉米漿5-10g/L,(NH4)2SO4 2-3g/L,MgSO4 2g/L,MnSO4 0.2g/L,pH 6.0-7.2;
優選的,一級種子培養基培養的時間為12-14小時;
優選的,二級種子培養基培養的時間為6-8小時;
優選的,搖瓶發酵或發酵罐發酵的培養溫度為36-38℃;
優選的,發酵罐發酵的pH控制在5.5-6.5;
優選的,發酵罐發酵的溶解氧濃度保持在20-30%;
更優選的,發酵培養基中葡萄糖130-150g/L,酵母浸提物3-6g/L,玉米漿6-10g/L,(NH4)2SO4 2-3g/L,MgSO4 2g/L,MnSO4 0.2g/L,pH 7.0-7.2;
優選的,發酵罐發酵通過補料的方式提高發酵效率和增加發酵產率;
優選的,補料發酵,初始葡萄糖濃度為120-150g/L;
優選的,補料采用一次補料方式;
優選的,補料時間為發酵液中葡萄糖濃度降至20-40g/L;
優選的,補料量為40-60g/L葡萄糖;
優選的,補料葡萄糖濃度為600-800g/L,酵母浸提物0.5g/L。