本發明涉及一種利用組培苗葉片再生不定芽途徑快速繁育羊躑躅的方法，屬于農業生物技術領域。

背景技術：

羊躑躅(Rhododendron molle(Blume)G.Don)，又名鬧羊花、黃杜鵑、黃色映山紅，隸屬于杜鵑花科杜鵑花屬羊躑躅亞屬落葉灌木，是中國羊躑躅亞屬中僅有的一個原生種。羊躑躅是有待開發的優良的園林綠化樹種，可引種馴化成為露地栽培的園藝觀賞植物，是杜鵑花色品種改良的重要資源。同時它也是珍稀瀕危藥用植物，全株器官均含有多種活性成分，花、根、果實等均可供藥用，具有祛濕、除風、解痛等功效，可用于治療風濕、頑癬和疼痛等癥；對農作物蟲害的防治也有一定的作用，是開發綠色農藥的植物源。羊躑躅主要是通過種子、扦插等方式繁殖。然而羊躑躅種子細小難采集，且種子萌發率較低，種子苗生長緩慢，距開花結果的時間較長；以扦插、嫁接方式繁殖又存在生根率及移栽成活率極低等問題，使其開發及利用受到極大限制。因此，亟待采取有效的方法對羊躑躅加以繁殖，使之能夠規模化生產，滿足人們日益增長的需求。

利用植物組織培養技術繁殖羊躑躅可以不受季節和環境條件等因素的影響，并能得到大規模整齊的瓶苗，且繁殖系數高，是解決上述難題的重要途徑。國內羊躑躅組織培養快繁技術研究是通過剪取羊躑躅的枝條獲得無菌組培苗，進一步通過剪取組培苗的莖節，誘導和培養嫩莖段腋芽叢生的方式建立羊躑躅離體培養和植株再生體系，芽叢的增殖率為4-5倍以上(顧宏輝,袁群英,朱春艷,朱丹華.羊躑躅的組織培養與快速繁殖[J].植物生理學通訊,2006,42(4):683；顧地周,陸爽,巴春影,李媛媛.羊躑躅嫩莖離體培養和植株再生[J].山東農業大學學報(自然科學版),2010,43(4):574-578)；以誘導和培養嫩莖段腋芽叢生的方式建立的快繁體系不能作為農桿菌介導的遺傳轉化體系對羊躑躅進行遺傳改良。

技術實現要素：

針對上述問題，本申請以羊躑躅組培苗頂生第三至第五個葉片為外植體材料，通過篩選不同的葉片切割方式、暗培養時間及細胞分裂素和生長素組合，提高葉片不定芽的誘導率和不定芽數目，建立高頻率植株再生技術體系，本發明是這樣實現的：

一種利用組培苗葉片再生不定芽快速繁育羊躑躅的方法，其具體步驟如下：

A)在超凈工作臺上剪取羊躑躅無菌組培苗頂生第三到第五個葉片(該葉片不太老也不太嫩，成熟度適中))，對葉片垂直于主脈切割一刀并去除葉柄和葉稍；

B)將葉片置于不定芽誘導培養基上，暗培養10-15天后進行光照培養，同時觀察葉片，可發現光照培養13-16天左右，切口處開始出現不定芽；

C)光照培養35天后，將帶不定芽的葉片轉到不定芽生長培養基上進行繼代培養，30d后形成幼苗；

D)將幼苗切下，轉移到成苗和生根培養基上，進行成苗和生根培養，30d后，幼苗即發育成具有根、莖和葉的完整再生植株。

WPM培養基：由WPM大量元素(990mg/L K₂SO₄、180.5mg/L MgSO₄、400mg/L NH₄NO₃、170mg/L KH₂PO₄、471mg/LCa(NO₃)₂·4H₂O和72.5mg/L CaCl₂)、WPM微量元素(0.25mg/L Na₂MoO₄·2H₂O、22.3mg/L MnSO₄·H₂O、8.6mg/L ZnSO₄·7H₂O、0.25mg/L CuSO₄·5H₂O、6.2mg/LH₃BO₃和36.7mg/L FeNa-EDTA)與WPM有機物(100mg/L肌醇、1.0mg/L鹽酸硫胺素、0.5mg/L鹽酸吡哆醇、0.5mg/L煙酸和2.0mg/L甘氨酸)組成，8g/L的瓊脂粉作為固化劑。

不定芽誘導培養基：向WPM培養基中加入終濃度為1.0mg/L的細胞分裂素噻苯隆TDZ、終濃度為1.0mg/L的生長素吲哚乙酸IAA、終濃度為30g/L的蔗糖，高壓滅菌，氫氧化鈉或鹽酸調整pH值至5.8；

不定芽生長培養基：WPM培養基中加入終濃度為1.0mg/L的細胞分裂素玉米素ZT、終濃度為0.1-0.5mg/L的生長素吲哚丁酸IBA、終濃度為30g/L蔗糖，高壓滅菌，氫氧化鈉或鹽酸調整pH值至5.8；

成苗和生根培養基：按照1/2WPM培養基(即WPM培養基中各元素、有機物添加量減半)，加入終濃度為10-12.5mg/L的生長素吲哚丁酸IBA、終濃度為15g/L的蔗糖、終濃度為0.3g/L的活性炭，高壓滅菌，氫氧化鈉或鹽酸調整pH值至5.8。

進一步，本發明所述利用組培苗葉片再生不定芽快速繁育羊躑躅的方法中，步驟B)所述光照培養是指：光照強度為1500lx，光照時間為12h/d；培養室溫度為25±2℃。

進一步，本發明所述利用組培苗葉片再生不定芽快速繁育羊躑躅的方法中，步驟D)所述成苗和生根培養培養是指：光照強度為1500lx，光照時間為12h/d；培養室溫度為25±2℃。

進一步，本發明所述利用組培苗葉片再生不定芽快速繁育羊躑躅的方法中，無菌組培苗葉片暗處理后不定芽的誘導產生、成苗和生根培養均在光照條件下進行，光照強度為1500lx，光照時間為12h/d；培養室溫度為25±2℃。

進一步，本發明所述利用組培苗葉片再生不定芽快速繁育羊躑躅的方法中，步驟A)所述組培苗是這樣獲得的：剪取當年羊躑躅帶有4～6個側芽的新發枝條3～5cm，通過組織培養方法(顧宏輝,袁群英,朱春艷,朱丹華.羊躑躅的組織培養與快速繁殖[J].植物生理學通訊,2006,42(4):683))獲得羊躑躅無菌組培苗。

本發明在前人研究基礎上，采用羊躑躅組培快繁中丟棄不用的葉片為材料，通過誘導葉片直接再生不定芽建立了羊躑躅的快速繁殖體系，增殖系數提高到7倍以上；通過采用羊躑躅無菌組培苗葉片誘導直接再生不定芽，避免了羊躑躅組織培養過程中外植體需要滅菌、污染率高等問題；通過解決葉片再生不定芽的葉片切割方式、暗培養時間、最適宜培養基組分以及不定芽生長和組培苗生根等關鍵技術問題，建立了羊躑躅快速、高效的繁殖體系，最終實現羊躑躅在短時間內大量、快速、高質量的繁殖，有效地滿足人們對羊躑躅日益增長的需求；同時這個快速繁殖體系也可以作為農桿菌介導的遺傳轉化體系對羊躑躅進行遺傳改良，具有較大的科研價值和經濟價值。

附圖說明

圖1為組培苗葉片誘導產生不定芽示意圖片。

圖2為不定芽伸長示意圖片。

圖3為不定芽長成幼苗示意圖片。

圖4為組培苗生根培養示意圖片。

具體實施方式

下面將結合附圖實施例詳細說明本發明所具有的有益效果，旨在幫助閱讀者更好地理解本發明的實質，但不能對本發明的實施和保護范圍構成任何限定。

實施例涉及材料來源：

羊躑躅地栽苗由江蘇省農業科學院園藝研究所觀賞植物與茶研究室提供；

蔗糖、瓊脂、生長素吲哚乙酸(Indole-3-acetic acid，簡稱IAA)、吲哚丁酸(3-indolebutyric acid，簡稱IBA)和細胞分裂素玉米素(Zeatin，簡稱ZT)均購自南京鼎國生物技術有限公司；

細胞分裂素噻苯隆(Thidiazuron)簡稱TDZ，購于南京生興生物技術有限公司；

實施例涉及的培養基：

WPM培養基：由WPM大量元素(990mg/L K₂SO₄、180.5mg/L MgSO₄、400mg/L NH₄NO₃、170mg/L KH₂PO₄、471mg/LCa(NO₃)₂·4H₂O和72.5mg/L CaCl₂)、WPM微量元素(0.25mg/L Na₂MoO₄·2H₂O、22.3mg/L MnSO₄·H₂O、8.6mg/L ZnSO₄·7H₂O、0.25mg/L CuSO₄·5H₂O、6.2mg/LH₃BO₃和36.7mg/L FeNa-EDTA)與WPM有機物(100mg/L肌醇、1.0mg/L鹽酸硫胺素、0.5mg/L鹽酸吡哆醇、0.5mg/L煙酸和2.0mg/L甘氨酸)組成，8g/L的瓊脂粉作為固化劑。(該培養基為木本植物組織培養中常用的培養基，也可參見LloydGB,McCownBH.Commercially-feasible micropropagation of mountain laurel,Kalmia latifolia,by use of shoot-tip culture[J].Comb.Proc.Int.Plant Prop.Soc.,1980,30:421-426制備方法)；

不定芽誘導培養基：WPM培養基中加入終濃度為1.0mg/L的細胞分裂素噻苯隆TDZ、終濃度為1.0mg/L的生長素吲哚乙酸IAA、終濃度為30g/L的蔗糖，氫氧化鈉或鹽酸調整pH值至5.8，高壓滅菌；

不定芽生長培養基：WPM培養基中加入終濃度為1.0mg/L的細胞分裂素玉米素(ZT)、終濃度為0.1-0.5mg/L的生長素吲哚丁酸(IBA)、終濃度為30g/L蔗糖，氫氧化鈉或鹽酸調整pH值至5.8，高壓滅菌；

成苗和生根培養基：按照1/2WPM培養基(即WPM培養基中各元素、有機物添加量減半)，加入終濃度為10-12.5mg/L的生長素吲哚丁酸IBA、終濃度為15g/L的蔗糖、終濃度為0.3g/L的活性炭，氫氧化鈉或鹽酸調整pH值至5.8，高壓滅菌；

Aderson培養基：由Aderson大量元素、Aderson微量元素和Aderson有機物組成(具體參見Anderson WC.A revised tissue culture medium for shoot multiplication of Rhododendron[J].J.Amer.Soc.Hort Sci..,1984,109:343-4347)。

實施例1

1、羊躑躅無菌組培苗的獲得與增殖

剪取羊躑躅3～5cm長，當年新發枝條(帶有4～6個側芽)，應用組織培養方法(顧宏輝,袁群英,朱春艷,朱丹華.羊躑躅的組織培養與快速繁殖[J].植物生理學通訊,2006,42(4):683)獲得無菌苗并對其進行增殖培養。

2、葉片切割方式對葉片直接再生不定芽的影響

剪取步驟1中羊躑躅無菌組培苗頂生第三至第五個葉片，分別采取以下四種處理方式：

(1)不切割；

(2)垂直于主脈切割一刀；

(3)垂直于主脈切割一刀并去葉柄和葉稍；

(4)垂直于主脈切割兩刀并去葉柄和葉稍。

分別將經過這四種不同方式處理的葉片接種在不定芽誘導培養基上，培養室溫度為25±2℃(該溫度為暗培養和光培養溫度)，暗培養10天后進行光照培養，光照培養35d(光照強度為1500lx，光照時間為12h/d；)后統計葉片不定芽誘導率和不定芽數，其結果如表1所示：

表1不同切割方式對葉片直接再生不定芽的影響

表1結果表明，在光照培養35天調查時，第(1)和第(2)種葉片切割方式的葉片很少有不定芽再生；而采用第(3)種方式，即垂直于主脈切割一刀并去葉柄和葉稍的切割方式有效地提高了葉片直接再生不定芽的頻率，且不定芽主要發生在葉片切口處(如圖1所示)，葉片再生不定芽百分率達86.2％，平均再生芽數4.7個/葉片；而采用第(4)種方法葉片再生率顯著降低，主要原因可能是切口過多導致葉片死亡率增加，從而降低了其再生頻率。

3、基本培養基類型對葉片直接再生不定芽的影響

剪取步驟1中羊躑躅無菌組培苗頂生第三至第五個葉片，采取垂直于主脈切割一刀并去葉柄和葉稍的切割方式接種于WPM培養基和Aderson培養基中，并分別附加終濃度TDZ 0.2mg/L+IAA 1.0mg/L的激素組合，培養室溫度為25±2℃，暗培養10天后進行光照培養(光照強度為1500lx，光照時間為12h/d)，35d后統計葉片誘導率和不定芽數，結果如表2所示：

表2不同培養基對葉片直接再生不定芽的影響

由表2可見，葉片外植體在WPM培養基上的再生率和再生芽數與Anderson培養基沒有顯著差異，但Anderson培養基上葉片再生的不定芽葉色偏黃，質量不如WPM培養基上的不定芽。

4、暗培養時間對葉片直接再生不定芽的影響

剪取步驟1中羊躑躅無菌組培苗頂生第三至第五個葉片，采取垂直于主脈切割一刀并去葉柄和葉稍的切割方式接種于WPM培養基中(加入終濃度為0.2mg/L的TDZ和終濃度為1.0mg/L的IAA)，分別進行0天、5天、10天、15天和20天五個時間點的暗培處理。處理完后將其置于光照環境中繼續培養35d后統計葉片誘導率和不定芽數。處理結果如表3所示：

表3暗培養時間對葉片直接再生的影響

表3結果表明暗培養對羊躑躅不定芽再生有一定促進作用；暗培養為10-15天，葉片的再生頻率和平均再生芽數均顯著高于其它處理。因此，葉片外植體最佳的暗培養時間為10-15天。

5、不同植物生長調節劑對葉片直接再生不定芽的影響

剪取步驟1中羊躑躅無菌組培苗頂生第三至第五個葉片，采取垂直于主脈切割一刀并去葉柄和葉稍的切割方式接種于包含不同激素組合的WPM培養基上：不同濃度TDZ(分別為0.1mg/L、0.2mg/L、0.5mg/L和1.0mg/L)與IAA(1.0mg/L和2.0mg/L)的完全隨機組合，結果如表4所示：

表4不同激素配比對葉片直接再生的影響

表4結果可見，在基本培養基(WPM)和培養條件相同的情況下，接種于激素配比終濃度為TDZ 1.0mg/L+IAA 1.0mg/L培養基(因此選擇其作為不定芽誘導培養基，并加入蔗糖，給植物提供能量)上的葉片外植體再生率和分化芽數最高，顯著高于其它激素配比。

6、不定芽伸長生長：

將在不定芽誘導培養基暗培養(培養方式同上述暗培養)10天后的葉片繼續進行光照培養(光照強度為1500lx，光照時間為12h/d；培養室溫度為25±2℃)35天產生不定芽的葉片轉到不定芽生長培養基上進行繼代(如圖2所示)，30d后形成幼苗(如圖3所示)。

7、成苗和生根培養

將步驟6培養30d天后形成的幼苗切下轉移到成苗和生根培養基上，培養30d后，幼苗發育成具有根、莖和葉的完整小植株(如圖4所示)，生根率達95％以上。

成苗后如果不適宜大田栽培，可以移入溫房栽培，待機再移出。

實施例2

1、羊躑躅、江南春早和胭脂蜜3個杜鵑品種無菌組培苗的獲得與增殖

分別剪取羊躑躅、江南春早和胭脂蜜3～5cm長，當年新發枝條(帶有4～6個側芽)，應用組織培養方法(顧宏輝,袁群英,朱春艷,朱丹華.羊躑躅的組織培養與快速繁殖[J].植物生理學通訊,2006,42(4):683)獲得無菌苗并對其進行增殖培養。

2、羊躑躅、江南春早和胭脂蜜3個杜鵑品種對本發明的平行試驗

不定芽誘導培養基：WPM培養基中加入終濃度為1.0mg/L的細胞分裂素噻苯隆TDZ、終濃度為1.0mg/L的生長素吲哚乙酸IAA、終濃度為30g/L的蔗糖，氫氧化鈉或鹽酸調整pH值至5.8，高壓滅菌；

分別剪取步驟1中羊躑躅、江南春早和胭脂蜜無菌組培苗頂生第三至第五個葉片，采取垂直于主脈切割一刀并去葉柄和葉稍的切割方式接種于不定芽誘導培養基上，培養室溫度為25±2℃，暗培養10天后進行光照培養(光照強度為1500lx，光照時間為12h/d)，35d后統計葉片誘導率和不定芽數，結果如表5所示：

表5羊躑躅、江南春早和胭脂蜜3個杜鵑品種對本發明的平行試驗

表5顯示杜鵑品種江南春早組培苗葉片直接再生不定芽的頻率僅為30％，而杜鵑品種胭脂蜜組培苗葉片不能產生不定芽。表5結果表明本發明的葉片切割方式、暗培養時間及不定芽誘導培養基只適用于杜鵑品種羊躑躅，對杜鵑品種江南春早和胭脂蜜并不適用，進而證明本發明不適宜其他同類產品，為羊躑躅專屬快速繁殖方法。

以上所述僅是本發明的優選實施方式，應該指出，對于本技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明技術原理的前提下，還可以做出若干修改和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發明的保護范圍。