本發明涉及植物組培培養，具體涉及一種櫻草根組培繁殖方法。

背景技術：

櫻草(學名：primulasieboldiie.morren)報春花科報春花屬多年生草本，根狀莖傾斜或平臥，葉片卵狀矩圓形至矩圓形，稀近圓形或截形，邊緣圓齒狀淺裂，上面深綠色，下面淡綠色，兩面均被灰白色多細胞長柔毛，花葶高可達30厘米，傘形花序頂生，苞片線狀披針形，花萼鐘狀，花冠紫紅色至淡紅色，稀白色，蒴果近球形，長約為花萼的一半。5月開花，6月結果。

櫻草一般是種子繁殖，包括園藝品種也是，但種子繁殖容易發生變異，導致得到的新品種無法通過無性繁殖的方法保存下來，也沒有有關櫻草組培繁殖的報道。通過組織培養的方法，可以有效保存櫻草園藝品種的優良性狀，對櫻草的大規模繁殖有重要意義。

技術實現要素：

發明目的：針對現有技術存在的問題，本發明提供一種櫻草根組培繁殖方法。該方法采用櫻草的根部作來外植體進行組培，可減少對母株的傷害，降低外植體污染程度，并且可以有效提高櫻草的不定芽形成率、愈傷組織形成率和發根率，從而提高增殖率。促進根端組培的增殖率，比用葉、莖組培有更高的增殖率。

技術方案：為了實現上述發明目的，如本發明所述一種櫻草根組培繁殖方法，包括如下步驟：

(1)外植體的處理：切取櫻草根部的細小根系作為外植體，剪切成長約1.5-1.6cm的根段，用洗衣粉的溶液搓洗后自來水沖洗；

(2)消毒處理：將去掉了表面灰塵和泥土的外植體放在超凈工作臺上消毒處理，先用酒精處理，再用升汞進行消毒處理，最后用無菌水沖洗，殘留的水分用無菌濾紙吸取；將消毒完畢的外植體置于無菌紙上，剪去外植體的下端0.2-0.3cm，以免影響其從培養基中吸收養分，接種于組培培養基上；

(3)外植體的培養：將步驟(2)接種于組培培養基上的外植體置于培養室內進行組培繁殖，直到形成愈傷組織。

其中，步驟(1)所述用洗衣粉的溶液搓洗時間為2-3min，自來水流水沖洗時間為12-14h。

其中，步驟(2)所述酒精處理時間為30-45s，升汞進行消毒時間為4-5min，無菌水沖洗3-4次。步驟(2)所述組培培養基為ms+1mg/l6-ba，加入蔗糖30g/l、瓊脂7g/l，ph調整為5.7。培養基在溫度121℃，15min滅菌處理。

其中，步驟(3)所述培養室的條件為光照16h/d，光照度為3000lx，溫度控制在23-27℃，培養時間為28-30天。

本發明將消毒處理后外植體用剪刀、鑷子剪去外植體的下端0.2cm，接種于ms培養基上，每處理接種20瓶，每個試瓶放5個外植體。每隔1d觀察一次外植體的污染情況，培養17d后對外植體的污染率和成活率進行統計。篩選污染率低，成活率高的進行組培培養。

有益效果：與現有技術相比，本發明具有如下優點：1、本發明利用根進行櫻草的組培，可避免傷害植株，比用葉、莖組培有更高的增殖率。通過本發明的這種方法有效保存新品種，可以大規模繁殖櫻草，以供給市場。

2、本發明采用的組培培養基是最適合櫻草繁殖的培養基，可以有效提高櫻草的不定芽形成率達到100％、愈傷組織形成率到達100％和發根率最高達到93％，從而提高增殖率。

3、本發明利用根作為外植體，可以最大限度的降低對母株的傷害，降低外植體污染程度。

具體實施方式

以下結合實施例對本發明作進一步說明。

實施例1

組培培養基為ms+1mg/l6-ba，加入蔗糖30g/l、瓊脂7g/l，ph調整為5.7。

組培方法：

(1)外植體的處理：切取櫻草根部的細小根系作為外植體，剪切成長約1.5cm的根段，放入白瓷缸中用加了少量洗衣粉的水搓洗2min，將泡沫淘洗干凈后于自來水下流水沖洗12h；

(2)消毒處理：將去掉了表面灰塵和泥土的外植體放在超凈工作臺上消毒處理，先用體積分數75％酒精處理30s，再用1g·l^-1升汞進行消毒處理5min，最后用無菌水沖洗3次，殘留的水分用無菌濾紙吸取；將消毒完畢的外植體置于無菌紙上，剪去外植體的下端0.2cm，以免影響其從培養基中吸收養分，接種于組培培養基上；

(3)外植體的培養：將步驟(2)接種于組培培養基上的外植體置于培養室內在光照16h/d，光照度為3000lx，溫度控制在20℃進行組培繁殖，培養30天。

本實施例1櫻草根組培繁殖方法櫻草的不定芽形成率達到了100％，愈傷組織形成率達到100％，發根率達到了93％。

實施例2

組培培養基為ms+1mg/l6-ba，加入蔗糖30g/l、瓊脂7g/l，ph調整為5.8。

組培方法：

(1)外植體的處理：切取櫻草根部的細小根系作為外植體，剪切成長約1.6cm的根段，放入白瓷缸中用加了少量洗衣粉的水搓洗3min，將泡沫淘洗干凈后于自來水下流水沖洗14h；

(2)消毒處理：將去掉了表面灰塵和泥土的外植體放在超凈工作臺上消毒處理，先用體積分數75％酒精處理45s，再用1g·l^-1升汞進行消毒處理6min，最后用無菌水沖洗4次，殘留的水分用無菌濾紙吸取；將消毒完畢的外植體置于無菌紙上，剪去外植體的下端0.3cm，以免影響其從培養基中吸收養分，接種于組培培養基上；

(3)外植體的培養：將步驟(2)接種于組培培養基上的外植體置于培養室內在光照16h/d，光照度為3000lx，溫度控制在25℃進行組培繁殖，培養28天。

本實施例2櫻草根組培繁殖方法櫻草的不定芽形成率達到了100％，愈傷組織形成率達到100％，發根率達到了84％。

試驗例1

采用實施例1的組培方法，其中選用不同的6-ba和naa的濃度(其他組分保持不變：ms、蔗糖30g/l、瓊脂7g/l，ph調整為5.7)，6-ba濃度分別為0、1mg/l、10mg/l，naa的濃度分別是0、0.1、1、10mg/l，12個組合，研究不同激素不同濃度下30天后愈傷組織的形成率，培養結束后植物體的鮮重、從愈傷組織上形成不定芽的情況、每外植體生長的球狀體數及從球狀體上發根率，還有球狀體超過1cm的數量，每一處理接種100瓶，每試管瓶置1個外植體。結果見表1。

表1naa和6-ba對外植體愈傷組織和不定芽的影響

從表1中可看出，試驗序號1和2中，不定芽形成率在25～37％之間；在6-ba為1mg/l的培養基上，隨naa濃度升高，愈傷組織形成率、不定芽形成率、發根率均表現為下降態勢。在6-ba為10mg/l區域，naa為1mg/l時不定芽形成率最高達97％，而發根率卻是6-ba為1mg/l時最高93％。從以上表1中看在5號組合激素的培養基上，愈傷組織形成率、不定芽形成率和發根率都最高。

試驗例2

培養溫度的影響

培養溫度對外植體體愈傷組織、不定芽形成和發根率的影響也很大。采用實施例1的組培方法，通過改變培養室的溫度研究不同溫度對外植體愈傷組織不定芽形成和發根率的影響。結果見表2。

表2溫度對外植體愈傷組織不定芽形成和發根率的影響

從表2中可以看出，在15℃、20℃、25℃時，愈傷組織形成率、不定芽形

成率均為100％，而30℃下則為30％和23％，但發根率以20℃下最高，所以對外植體愈傷組織形成、不定芽形成和發根率最有利的溫度是20℃。

綜上所述，對櫻草根的培養以在20℃條件下，在ms培養基中，添加6-ba為1mg/l、naa為0mg/l時，愈傷組織形成率、不定芽形成率和發根率最高。