本發明涉及美容、護膚領域，具體涉及一種用于美容護膚的干細胞制劑及其制備方法。

背景技術：

間充質干細胞(mesenchymal stem cells，MSC)是一類具有自我更新和多向分化潛能的種子細胞，在不同的誘導條件下不僅能夠分化形成骨、軟骨、脂肪、肌肉等中胚層的細胞，還能跨胚層分化形成外胚層的神經元、神經膠質細胞、皮膚細胞以及內胚層的血管內皮細胞等多種組織細胞。除具有多向分化潛能外，MSC還可分泌多種細胞因子，MSC通過旁分泌的形式分泌EGF、KGF、VEGF、促血管生成素-1(angiopoietin-1,Ang-1)、bFGF、IGF-1、Wnt1/3A/5A、HGF、PDGF-BB和EPO等眾所周知能促進血管生成、促進組織細胞生物合成及能量代謝的細胞活性物質，其還可加強創面愈合。另外，這些因子可對調節表皮及上皮細胞生長、分化增殖、促進毛細血管生長、改善生長微環境、保持細胞活性等方面起著重要作用^[1]。文獻報道，極微量的EGF、FGF即能強烈促進皮膚細胞的分裂和生長，從而達到促進人皮膚的新陳代謝、促進再生修復、減緩皮膚衰老，使皮膚重新恢復彈性和光澤^[2-3]。

目前市售的細胞因子產品多是單一成分美容護膚品，也有以EGF和bFGF為活性成分添加到美容護膚品中，單一的一種或兩種細胞因子不能滿足皮膚修護、細胞更新的需求，多種因子聯合應用才能促進表皮更新，多因子產品也將成為化妝品行業發展的必然趨勢。

中國專利CN1872025A和CN101461772A均涉及到干細胞分泌的細胞因子，均在空氣氧濃度(約為21％)下進行培養擴增，文獻報道^[4]，微環境中O₂濃度是非常重要的因素，對間充質干細胞的影響是多個方面的，空氣氧濃度下培養的間充質干細胞分泌的細胞因子量較少，經過低氧條件(O₂濃度為4％)培養的間充質干細胞分泌的各種因子量均有不同程度增加，另外，文獻報道^[5]，人體正常組織和組織間隙中的O₂濃度在3％-9％，人類軟骨細胞(無血管組織)生長環境的氧體積分數為0-7％，骨髓腔內濃度在1％-7％范圍，說明間充質干細胞在體內處于低氧環境中，其是在此條件下分泌細胞因子發揮各種功能。

相關文獻已報道采用低氧培養可對個別細胞因子在一定程度上增加其含量，但是需要長時間低氧工藝，對培養條件要求高，且普通培養方法，干細胞經多次傳代后出現分化現象，一旦分化就不再具備分泌干細胞相關因子的能力，而且分化細胞不能繼續傳代培養，以上問題不適于大批量生產。

基于干細胞可分泌多種細胞因子的特征，本發明開發人干細胞美容護膚產品，及其美容護膚品添加的活性物質，選材源于人類，解決了部分人群因使用化學試劑產品產生的變態反應，這使得人們在心理、生理上更容易接受這類產品改善肌膚敏感人群的膚質。解決傳統的物理化學美容所不能解決的問題，從本質上改善肌膚。

本發明通過特殊培養工藝，添加維生素A使得干細胞傳代倍數增加，傳代至20代時仍具有干細胞分泌細胞因子的功能，同時采用黃芪甲苷刺激培養與低氧培養結合工藝，增加干細胞因子分泌，開發一種培養方法簡單、細胞因子分泌功能強、細胞因子獲取量高的制備方法，以少量原料實現批量獲取，是一種適合于產業化的制備方法，為細胞因子應用于護膚美容行業、組織損傷修復領域奠定基礎。

技術實現要素：

本發明一方面提供了一種制備干細胞制劑的方法，其包括：

a)提供從哺乳動物獲得的干細胞；

b)在干細胞培養基中，對干細胞進行原代培養；

c)在添加有0.8-1.2μM的維生素A的干細胞培養基中，對干細胞進行傳代培養至第15至20代；

d)更換為添加有0.8-1.2μM黃芪甲苷的無酚紅培養液，在1％至5％O₂的條件下繼續培養24小時；

e)在將步驟d)培養后的干細胞連同培養液進行超聲破碎，離心，收集上清液，并過濾除菌；

f)檢測步驟e)獲得的上清液的總蛋白濃度，將上清液總蛋白濃度調整至9-11μg/μL。

在一個具體的實施方案中，所述干細胞培養基是含2％血清替代物的α-MEM培養液。

在一個具體的實施方案中，所述無酚紅培養液是DMEM培養液或DMEM/F12培養液。

在一個可選的實施方案中，所述干細胞選自臍血干細胞、臍帶間充質干細胞、表皮干細胞、骨髓間充質干細胞、脂肪間充質干細胞。

在一個優選的實施方案中，所述哺乳動物是人。

在一個具體的實施方案中，其中在c)中，當細胞融合率達75％-85％時進行傳代。

在一個可選的實施方案中，上述方法還包括g)：將f)中經調整總蛋白濃度的上清液冷凍干燥，獲得冷凍干燥品。

在一個可選的實施方式中，0.8-1.2μM黃芪甲苷還可以采用1mg/mL黃芪多糖替代。其中，黃芪多糖中的主要有效成份是多糖和黃芪苷。黃芪苷分為黃芪苷Ⅰ、黃芪苷Ⅱ、黃芪苷Ⅳ。其中生物活性最好的是黃芪苷IV即黃芪甲苷。

在一個具體的實施方案中，制備上述干細胞制劑的方法包括以下步驟：

1)提供從哺乳動物獲得的干細胞：采用相應細胞分離技術，從人的相應組織中分離出干細胞；

2)在干細胞培養基中，對干細胞進行原代培養：使用含有2％血清替代物的α-MEM培養液，在37℃、5％CO₂條件下采用細胞培養箱進行培養、擴增；

3)干細胞的傳代培養：在添加有1μM的維生素A的干細胞培養基中，對干細胞進行傳代培養，視細胞的生長狀態進行換液、傳代，每隔一天傳代一次，傳代培養至第20代時，且融合率達75％-85％時，棄去上清液，換上含1μM黃芪甲苷的無酚紅培養液DMEM；

4)細胞因子富集：將步驟3)獲得的細胞放入1％至5％的O₂低氧培養箱中繼續培養24h，使細胞因子分泌量增加；

5)干細胞制劑的制備：將步驟4)處理過的細胞連同無酚紅培養液DMEM進行超聲破碎；細胞因子完全釋放到培養體系中；再以4000r/min離心15min，收集上清液，棄去沉淀，上清液用0.22μm濾膜過濾，使其無菌；

6)采用BCA法進行總蛋白濃度測定，調整蛋白濃度為10μg/μL；可選地蛋白濃度測定方法如Lowry法、磺基水楊酸沉淀法、Bradford法；

7)干細胞制劑的冷凍干燥品的制備：將6)中多因子復合的干細胞制劑按照2-3ml/瓶灌裝于西林瓶中，采取冷凍干燥技術獲得干細胞制劑的冷凍干燥品。

可選地，在步驟4)和步驟5)之間還可以進行細胞生物學相關檢測：采用ELISA法分析培養上清液中幾種因子的分泌量，包括EGF、bFGF、VEGF、KGF、Ang-I、PDGF、IGF-1、HGF。

本發明另一方面提供了一種干細胞制劑，其通過上述的方法制備獲得。

在一個具體的實施方案中，所述干細胞制劑包括干細胞分泌的細胞因子包括但不局限于表皮細胞生長因子(EGF)、成纖維細胞生長因子(bFGF)、血管內皮生長因子(VEGF)、人血管生成素I(Ang-I)、促紅細胞生成素(EPO)、肝細胞生長因子(HGF)、轉化生長因子-β(TGF-β)、白介素6(IL-6)、白介素10(IL-10)、前列腺素E2(PGE2)、胰島素樣生長因子(IGF-1)、血小板源性生長因子(PDGF)。

在一個具體的實施方案中，所述干細胞制劑還包括膠原蛋白、層粘蛋白、纖連蛋白、透明質酸。

本發明另一個方面，提供了上述干細胞制劑、或上述方法制備的干細胞制劑在制備美容護膚產品和/或化妝品中的用途。

在一個具體的實施方案中，所述干細胞制劑是液體形式。在另一個具體的實施方案中，所述干細胞制劑是通過冷凍干燥獲得的固體形式的冷凍干燥品。

在具體的實施方案中，本發明所獲得的液體形式的干細胞制劑(即干細胞制劑的原液)可以直接添加到美容護膚產品中，如美容水液、霜、膏、干粉、針劑、乳劑等各種劑型。包括但不局限于面霜、乳液、化妝水、柔膚水、清潔乳、清潔皂、面膜、按摩膏、粉底霜。也可以將本發明所獲得的固體形式的干細胞制劑的冷凍干燥品添加到美容護膚產品當中，該冷凍干燥品可長久保存其活性不降解，滿足長期存放，具有因子使用濃度可調節等優勢。另外，該冷凍干燥品用一定溶解介質溶解后可直接涂抹于皮膚表面，或借助器械將此美容液導入皮下，使其充分吸收發揮作用。

在具體的實施方案中，液體形式的所述干細胞制劑或固體形式的所述干細胞制劑的冷凍干燥品配合一定溶媒介質，包括添加保濕因子、促吸收因子、美白因子等活性物質直接用于美容、護膚，達到修復組織、促進皮膚新陳代謝的作用。

在具體的實施方案中，液體形式的所述干細胞制劑和固體形式的所述干細胞制劑的冷凍干燥品可作為一種美容活性成分，添加到美容護膚產品中，如美容水液、霜、膏、干粉、針劑、乳劑等各種劑型。包括但不局限于面霜、乳液、化妝水、柔膚水、清潔乳、清潔皂、面膜、按摩膏、粉底霜。

本發明另一個方面，提供了上述干細胞制劑、或上述方法制備的干細胞制劑在制備用于治療皮膚損傷的藥物中的用途。

具體地，所述皮膚組織損傷包括但不局限于皮膚燒傷、燙傷、紫外線損傷、創傷、糖尿病足病、手術切口、慢性創面(如慢性肉芽創面、潰瘍、褥瘡等)等引起的皮膚組織損傷、難愈性創面。

從以上所述可以看出，本方法的優勢在于采用維生素A結合黃芪甲苷共刺激體外培養的干細胞，以及低氧培養工藝，采用維生素A使得體外培養的間充質干細胞傳代倍數明顯增加，擴增數量顯著增加，黃芪甲苷刺激間充質干細胞使其分泌的細胞因子量明顯增加，解決了常規培養方法體外培養細胞數目少，因子含量低等關鍵性問題。本方法得到的干細胞制劑功效明顯增強，并且其冷凍干燥品不僅使用方便，可實現產業化，而且便于長期保存，大大降低了保存條件的要求，解決了保存時間短這一瓶頸問題。本發明制備的干細胞制劑的冷凍干燥品可配合一定溶解介質直接涂抹于皮膚表面上，或導入皮下；也可以作為一種美容護膚成分添加到美容、護膚產品中，如添加到面霜、化妝水、乳劑、粉餅等產品。也可以添加到以細胞因子為原料的創傷修復系列產品當中。

附圖說明

圖1為本發明的干細胞制劑的冷凍干燥品實物圖。

圖2A至圖2D為本發明的干細胞制劑對人臍帶間充質干細胞生長增殖的影響。其中，圖2A為空白對照組中培養的人臍帶間充質干細胞的生長結果；圖2B為添加實施例1制備的干細胞制劑的冷凍干燥品培養的人臍帶間充質干細胞的生長結果；圖2C為添加實施例2制備的干細胞制劑冷凍干燥品培養的人臍帶間充質干細胞的生長結果；圖2D為添加實施例3制備的干細胞制劑的冷凍干燥品培養人臍帶間充質干細胞的生長結果。

圖3A至圖3C為本發明的干細胞制劑治療紫外線損傷動物模型愈后實例。其中，圖3A為紫外線損傷模型；圖3B為使用實施例2中制備的骨髓間充質干細胞制劑的原液治療紫外線損傷結果；圖3C為使用實施例3中脂肪間充質干細胞制劑的原液治療紫外線損傷結果。

具體實施方式

以下結合附圖，通過實施例進一步說明本發明，但不作為對本發明的限制。以下提供了本發明實施方式中所使用的具體材料及其來源。但是，應當理解的是，這些僅僅是示例性的，并不意圖限制本發明，與如下試劑和儀器的類型、型號、品質、性質或功能相同或相似的材料均可以用于實施本發明。下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。

實施例1：通過臍帶間充質干細胞制備干細胞制劑及其冷凍干燥品

1、原代臍帶間充質干細胞的獲得與培養

經產婦知情同意，乙型肝炎病毒抗原、丙型肝炎表面抗體、艾滋病病毒、梅毒螺旋體抗體等檢測為陰性，獲得經無菌處理的新生兒臍帶。

將無菌采集的新生兒臍帶放入生理鹽水中，用75％乙醇浸泡2min，再用PBS浸泡清洗，除去血管內余下的血，將臍帶剪碎成lmm³大小的組織塊，將組織塊均勻平鋪在培養皿(corning，貨號430167)中，倒置培養48h，待組織貼牢后，加入5ml干細胞培養基(含2％血清替代物(Pall；貨號15950-017)的ɑ-MEM培養液(Hyclone；貨號SH30265.01))，于37℃、5％CO₂(v/v)培養箱中培養，培養3-5d，生長出的細胞即為原代臍帶間充質干細胞。

2、臍帶間充質干細胞的擴增和傳代培養

原代臍帶間充質干細胞融合率達到80％左右，小心棄掉培養液，加入適量生理鹽水清洗細胞表面，以除去剩余培養液。倒掉洗液，加入0.125g/L胰蛋白酶(SCIENTIFC RESEAROH SPECIAL；貨號27250018)2ml，鏡下觀察大部分細胞由梭狀變為圓形時，輕輕拍打培養皿，使其漂浮。加入2ml含2％血清替代物的ɑ-MEM培養液(干細胞培養基)終止胰酶對細胞的消化作用。用生理鹽水清洗培養皿，把消化下來的細胞懸液倒入50ml離心管，1500r/min離心5min，離心結束后取出離心管，棄上清。加入30ml含2％血清替代物的ɑ-MEM培養液，混合均勻，取少量細胞懸液計數，以5×10⁶個/瓶細胞密度接種于T182瓶(BIOFIL；貨號TCF011600)中，在每瓶加入25ml含2％血清替代物的ɑ-MEM培養液，同時按照終濃度為1μM維生素A(上海源葉生物科技有限公司；貨號S13006-5)添加到培養液中，放入培養箱(37℃、5％CO₂(v/v))培養。當細胞融合率達到75％-85％，按照上述步驟傳代培養，每代培養時，干細胞培養基中均加入1μM維生素A，擴增到第20代。

3、臍帶間充質干細胞分泌的細胞因子富集方案

擴增到第20代時，上述培養的間充質干細胞融合率為75％-85％(約為80％時)，將原培養液換成含有1μM黃芪甲苷(上海源葉生物科技有限公司；貨號S31401-500)的無酚紅培養液(DMEM培養液(ThermoFisher，貨號11054020)或DMEM/F12(ThermoFisher，貨號21041025)，18ml/T182瓶，放入3％O₂(v/v)低氧培養箱中繼續培養24h，使細胞因子分泌量增加。

4、臍帶間充質干細胞的干細胞制劑的制備

將經上述培養的臍帶間充質干細胞上清液收集于離心管中，加入10ml生理鹽水洗滌一次，再加入0.125g/L胰蛋白酶5ml消化帖壁細胞，鏡下觀察大部分細胞由梭狀變為圓形時，輕輕拍打培養瓶，使其漂浮，加入5ml含2％血清替代物的ɑ-MEM培養液終止胰酶對細胞的消化作用。用生理鹽水清洗培養瓶，把消化下來的細胞懸液放入200ml離心管中，1500r/min離心10min，離心結束后取出離心管，棄上清，向細胞沉淀中加入上述細胞上清液，混勻，進行超聲破碎，使細胞裂解，以4000r/min離心15min，收集上清液，棄去沉淀，上清液用0.22μm濾膜過濾，使其無菌，采用BCA蛋白濃度檢測試劑盒(碧云天，貨號P0009)進行蛋白濃度測定，調整濃度為10μg/μL(用滅菌注射用水調整，如果濃度高于10μg/μL，則用水稀釋，如果濃度低于10μg/μL，則將與檢測濃度高的樣本按照體積比混合，保證混合后濃度為10μg/μL)，獲得復合細胞因子活性液，其包含臍帶間充質干細胞分泌的細胞生長因子，以及臍帶間充質干細胞活性蛋白，即干細胞制劑。

5、臍帶間充質干細胞制劑的冷凍干燥品的制備

將以上獲得的復合細胞因子活性液以2ml/瓶，灌裝于西林瓶中，蓋上冷凍干燥專用橡膠塞，放入冷凍干燥機(LGJ-10F真空冷凍干燥機；北京松源華興科技發展有限公司)中，按以下程序進行冷凍干燥，-70℃冷凍12h，再以5℃/h的速度升溫，待溫度達到-10℃時，保持5h；溫度達到20℃時，保持3h；溫度達到25℃時，保持3h；得到臍帶間充質干細胞的干細胞制劑的冷凍干燥品。

實施例2：通過骨髓間充質干細胞制備干細胞制劑及其冷凍干燥品

1、原代骨髓間充質干細胞的獲得與培養無菌條件下采集志愿者骨髓15ml，肝素抗凝，加入10ml生理鹽水，混勻，采用5ml注射器沿著管壁緩慢加入到50ml離心管中，離心管中預先加入Percoll細胞分離液(solarbio，貨號P8370)15ml，密度梯度離心，2000r/min，離心，30min，收集中間白膜層細胞于無菌離心管中，再加入30ml生理鹽水洗滌細胞，以1500r/min，離心，10min，棄去上清液，重復洗滌2次，最后加入20ml含2％血清替代物的ɑ-MEM培養液，于37℃、5％CO₂(v/v)培養箱中培養，培養3-5d，生長出的細胞即為原代臍帶間充質干細胞。

2、骨髓間充質干細胞擴增和傳代培養、細胞因子富集、凍干制備的步驟同實施例1中的方法。

實施例3：通過脂肪間充質干細胞制備干細胞制劑及其冷凍干燥品

經知情同意，脂肪來源于女性腹部吸脂手術者，70ml脂肪加入適量鹽水洗滌兩次，除去部分血細胞，再加入等體積1.5％I型膠原酶(solarbio，貨號C8140)，于37℃恒溫水浴鍋震蕩消化40min，取下層單個核細胞于50ml離心管中，加入30ml生理鹽水洗滌細胞3次，最后加入20ml含2％血清替代物的ɑ-MEM培養液，于37℃、5％CO₂培養箱中培養，視細胞的生長狀態進行換液或傳代培養。其它制備步驟同實施例1。

實施例4：干細胞制劑對細胞生長增殖的影響

1、實驗材料

6孔培養板(corning，貨號3516)；ɑ-MEM培養液(Hyclone；貨號SH30265.01)；干細胞制劑(實施例1制備的干細胞制劑，即臍帶間充質干細胞復合細胞因子冷凍干燥品)；長時間細胞動態檢測儀(Essen Bioscience)

2、實驗方法

采用2％血清替代物的ɑ-MEM培養液混懸人臍帶間充質干細胞，再以1×10⁵個/孔接種到2塊6孔培養板中，置于培養箱中培養6h，使其充分帖壁，分成A、B、C、D組，其中A組為3個培養孔換成ɑ-MEM培養液對照組，B組為3個培養孔換成10％實施例1制備的冷凍干燥品的ɑ-MEM培養液(即2ml臍帶間充質干細胞制劑的原液制備成一瓶冷凍干燥品，再取該瓶冷凍干燥品用2ml滅菌水溶解后獲得的溶液，該溶液占ɑ-MEM培養液的體積的10％)，C組為3個培養孔換成10％實施例2制備的冷凍干燥品(2ml體積的原液制備的冷凍干燥品加入2ml滅菌水溶解)的ɑ-MEM培養液，D組為3個培養孔換成10％實施例3制備的冷凍干燥品(2ml體積的原液制備的冷凍干燥品加入2ml滅菌水溶解)的ɑ-MEM培養液，換液后采用長時間細胞動態檢測儀觀察，每隔4h拍照一次，每隔一天換液一次。

3、結果與討論

與對照孔比較，體外培養2d時，添加干細胞制劑對人臍帶間充質干細胞的生長增殖具有明顯的促進作用，結果見圖2A至圖2D，這也說明實施例1-3中的方法制備的干細胞制劑均能夠促進細胞分裂增殖，對組織損傷具有促修復作用。

實施例5：干細胞制劑對紫外線損傷動物模型的修復作用

1、實驗材料

干細胞制劑(實施例2制備骨髓間充質干細胞制劑的原液；實施例3制備脂肪間充質干細胞制劑的原液)；SD雄性大鼠(購自遼寧長生生物技術有限公司；合格證號SCXK(遼)2015-0001)(180-220g)；紫外燈UVB；剪刀；剃刀；10％水合氯醛(solarbio，貨號T8590)；鋁箔紙；微針滾輪(540針，針長1.0mm)

2、實驗方法

2.1動物飼養

大鼠每5只放入一籠飼養，在相同的自然環境下(晝夜交替12小時)飼養，常規飼食和飲水，無不良因素影響，使其適應實驗室環境后開始進行實驗。

2.2脫毛

用標記筆標出預照射范圍，先用剪刀剪去鼠背上的粗毛，在用剃須刀將剩余的絨毛剃除干凈，脫毛面積約9cm²，使背部皮膚充分暴露。

2.3模型建立及實驗處理方法

動物適應性喂養1周，第二周開始將SD大鼠36只，隨機分成4組各9只：正常組、模型對照組、模型實驗組1、模型實驗組2。UVB紫外線燈預熱15min，穩定紫外線強度。中波紫外UVB照射大鼠制備皮膚管老化、紫外線損傷模型，待皮膚狀態穩定后，采用10％水合氯醛麻醉大鼠，按照0.5ml/100g劑量進行，將模型對照組與模型實驗組大鼠進行紫外照射，距離照射部位40cm處照射中波紫外1h/次，每天照射兩次，連續照射一周，非照射部位以鋁箔紙遮蓋，以避免紫外照射損傷。

此后，每天對實驗組大鼠裸露皮膚處微針滾輪一次，再均勻涂抹0.5ml干細胞制劑原液，模型組1涂抹實施例2制備的原液，模型組2涂抹實施例3制備的原液，每天均涂抹兩次，均連續涂抹15天，觀察紫外線損傷后皮膚外觀改善情況。

3、結果與討論

正常組實驗動物皮膚光滑富有彈性、水嫩；與正常組比較，模型對照組皮膚出現紅腫、皮屑增多、粗糙肥厚、紅斑、深皺紋、干燥、失去彈性等老化、損傷特征。模型實驗組皮膚外觀均較模型對照組明顯改善，皮膚具有彈性、無角質層粗糙肥厚感、亦無深皺紋、皮膚較水嫩。這說明干細胞制劑能有效促進大鼠皮膚新細胞的產生，透明質酸的分泌以及糖蛋白生成，能夠調節受損皮膚結構，促使受損皮膚快速修復，使皮膚光潤、水嫩而富有彈性，對皮膚光老化有修復作用。結果見圖3A、圖3B和圖3C。

實施例6：干細胞制劑中細胞因子含量分析

采用ELISA試劑盒(廠家arigo)，按照試劑盒操作步驟分析干細胞制劑中EGF、bFGF、VEGF、KGF、Ang-I、PDGF-BB、IGF-1、HGF。本次列出3批干細胞制劑中上述因子含量，具體結果見表1。

表1干細胞制劑中細胞因子含量

可見，本發明提供的干細胞制劑及其冷凍干燥品可直接使用，也可做為生物活性物質添加到美容護膚產品中。本發明的干細胞制劑直接作用于皮膚靶細胞，啟動細胞內的代謝過程，加快其新陳代謝，在恢復細胞活性、促進增殖更新、修復受損組織等方面前景廣闊。細胞因子應用于護膚美容，擺脫了傳統的物理、化學美容的束縛，從人體的內在實現美麗、年輕態。目前，國內關于細胞因子在美容領域的理論研究和實踐還十分匱乏，進一步深入研究細胞因子發揮作用的本質，為更多細胞因子應用于美容提供更加充分的理論基礎，傳統美容必將被以細胞因子為代表的生物美容所取代^[6]。

參考文獻

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