本發明屬于抗癡呆藥物領域，具體涉及一種法尼基轉移酶抑制劑在制備易化膽堿能神經系統藥物中的應用。

背景技術：

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一種以進行性認知障礙為主要臨床表現的神經退行性疾病。隨著世界人口進入老齡化，AD的發病率快速上升，幾乎每7秒鐘就有一人患病，預測到2050年將增加到9000萬人。由于缺乏有效的預防和治療措施，AD已被列為第四位死亡原因。血管性癡呆(VD)是指由缺血性卒中、出血性卒中和造成記憶、認知和行為等腦區低灌注的腦血管疾病所致的嚴重認知功能障礙綜合征。我國血管性癡呆的患病率為1.1％～3.0％，年發病率在5～9/1000人。帕金森病(PD)為老年期常見的神經系統變性疾病，≥65歲人群中的發病率約2％。帕金森病是一種緩慢發生的選擇性的中腦黑質多巴胺能神經元喪失和紋狀體多巴胺含量顯著減少，導致錐體外系的一系列癥狀。帕金森病的非運動障礙癥狀，特別是帕金森病患者中癡呆的發生率高達24％～31％，是普通老年人群癡呆發生率的2～6倍。但是，迄今仍然缺乏療效高、副作用少、長期使用不產生耐藥性的抗癡呆藥物。

有一些胞內蛋白翻譯后需經法尼基化修飾，才能結合于細胞膜并發揮其傳導信號的作用。法尼基化修飾就是在法尼基轉移酶的作用下，把法尼基基團加到蛋白質分子上。法尼基轉移酶抑制劑(farnesyltransferase inhibitors，FTI)是一類正在試驗中的靶向抗腫瘤藥物。

技術實現要素：

解決的技術問題：本發明提供一種法尼基轉移酶抑制劑(farnesyltransferase inhibitors，FTI)在制備易化膽堿能神經系統藥物中的應用。

技術方案：法尼基轉移酶抑制劑在制備易化膽堿能神經系統藥物中的應用。

所述法尼基轉移酶抑制劑為

(1)FTI-276，trifluoroacetate salt(三氟乙酸鹽)

N-[4-[2-(R)-Amino-3-mercaptopropyl]amino-2-phenylbenzoyl]methionine trifluoroacetate salt

經驗分子式(希爾表示法)C₂₁H₂₇N₃O₃S₂·C₂HF₃O₂，分子量547.61

(2)FTI-277trifluoroacetate salt(三氟乙酸鹽)

N-[4-[2(R)-Amino-3-mercaptopropyl]amino-2-phenylbenzoyl]methionine methyl ester trifluoroacetate salt

經驗分子式(希爾表示法)C₂₂H₂₉N₃O₃S₂·xC₂HF₃O₂，，分子量447.61(free base basis)

MDL number MFCD06795840

(3)Lonafarnib(Sch66336)

(4)Tipifarnib

易化膽堿能神經系統藥物，包括上述的法尼基轉移酶抑制劑。

法尼基轉移酶抑制劑在制備抗癡呆藥物中的應用。

上述癡呆病癥為老年性癡呆、阿爾茨海默病癡呆、血管性癡呆和帕金森病癡呆。

抗癡呆藥物，包括上述的法尼基轉移酶抑制劑。

有益效果：法尼基轉移酶抑制劑(farnesyltransferase inhibitors，FTI)對老年性癡呆，阿爾茨海默病認知障礙，血管性癡呆和帕金森病認知功能減退都具有明顯的改善作用。具體的說，在老齡小鼠、阿爾茨海默病模型小鼠、腦缺血的癡呆模型小鼠和帕金森病認知功能減退模型小鼠，FTI經口腔、腹腔注射、腦室內注入或細胞孵育等途徑處理都能劑量依賴地(1)增強神經細胞乙酰膽堿受體α7亞型(α7nACh)的活性和表達，(2)改善癡呆行為，(3)恢復海馬腦區的突觸傳遞效應和長時程增強誘導。

附圖說明

圖1為法尼基轉移酶抑制劑FTI-277和SCH66336增強海馬腦組織的α7nACh受體活性和表達的試驗結果圖，(A和B)分別為2-4小時用FTI-277和SCH66336處理海馬腦片后，乙酰膽堿(ACh)誘導的α7nACh受體內向電流(I_ACh)的密度曲線。(C和D)分別為FTI-277和SCH66336連續5天進行小鼠腹腔注射后，海馬α7nACh受體蛋白水平。α7nAChR：α7nACh受體；FTI：FTI-277；SCH：SCH66336。(E和F)分別為FTI-277和SCH66336連續5天進行小鼠腹腔注射后，海馬α7nACh受體mRNA水平。*P<0.05和**P<0.01vs.對照組。

圖2為FTI-277增強老齡小鼠空間認知功能——改善老年性認知功能減退的試驗結果圖；為FTI-277連續10天進行老齡(14月齡)小鼠腹腔注射后，(A)Morris水迷宮隱蔽平臺的逃避潛伏期；(B)Morris水迷宮空間探索時的各象限游泳時間百分比(PQ：站臺象限；R-AQ：站臺右側象限；L-AQ：站臺左側象限；OQ：站臺對側象限；FTI：FTI-277)；(C)“Y“迷宮的進臂交替率；(D)海馬CA1區的輸入–輸出(input-output relationship，I/O)曲線。*P<0.05和**P<0.01vs.4月齡小鼠；#P<0.05和##P<0.01vs.14月齡小鼠；+P<0.05和++P<0.01vs.FTI-277處理的14月齡小鼠。

圖3為FTI-277和SCH66336改善阿爾茨海默病模型(APP/PS1轉基因)小鼠的認知功能——抗阿爾茨海默病癡呆的試驗結果圖；分別為FTI-277連續20天進行APP/PS1小鼠腹腔注射后，(A-B)Morris水迷宮隱蔽平臺的逃避潛伏期；(C)Morris水迷宮空間探索時的各象限游泳時間百分比；(D)“Y“迷宮的進臂交替率(％)；(E-F)海馬CA1區的長時程增強(LTP)誘導。FTI：FTI-277；SCH：SCH66336，GAL：Galantamine hydrobromide。*P<0.05和**P<0.01vs.野生型小鼠；#P<0.05和##P<0.01vs.APP/PS1小鼠；+P<0.05和++P<0.01vs.DMXB處理的APP/PS1小鼠。

圖4為SCH66336改善阿爾茨海默病模型(Aβ_25-35)小鼠的認知功能——抗阿爾茨海默病癡呆的試驗結果圖；分別為SCH66336連續20天進行Aβ_25-35小鼠腹腔注射后，(A-B)Morris水迷宮隱蔽平臺的逃避潛伏期；(C)Morris水迷宮空間探索時的各象限游泳時間百分比；(D)“Y“迷宮的進臂交替率(％)；(E)海馬CA1區的長時程增強(LTP)誘導。SCH：SCH66336。*P<0.05和**P<0.01vs.對照組小鼠；#P<0.05和##P<0.01vs.Aβ_25-35小鼠；+P<0.05和++P<0.01vs.DMXB處理的Aβ_25-35小鼠。

圖5為FTI-277改善局部腦缺血小鼠的認知功能——抗血管性癡呆的試驗結果圖；(A)Morris水迷宮隱蔽平臺的逃避潛伏期。(B)Morris水迷宮空間探索的各象限游泳時間百分比。(C)“Y“迷宮的進臂交替率(％)。FTI：FTI-277，*P<0.05和**P<0.01vs.sham-op小鼠(假手術組作為對照組小鼠)；#P<0.05和##P<0.01vs.MCAO小鼠。

圖6為SCH66336改善帕金森病癡呆小鼠的認知功能——抗帕金森病癡呆的試驗結果圖；“Y“迷宮的進臂交替率(％)。*P<0.05vs.對照組小鼠；#P<0.05vs.MPTP小鼠。

具體實施方式

本發明結合附圖和實施例作進一步的說明(1)法尼基轉移酶抑制劑能增強α7nACh受體的活性和表達；(2)采用多種認知障礙(癡呆)的動物模型，抑制法尼基轉移酶對老年性認知功能減退、阿爾茨海默病認知障礙、血管性癡呆和抗帕金森病癡呆都有顯著的抗癡呆作用及其相關機制。

實施例1：法尼基轉移酶抑制劑能增強α7nACh受體的活性和表達

實驗主要材料：

30-35天齡的ICR小鼠購自南京醫科大學實驗動物中心。動物飼養在南京醫科大學實驗動物中心，并且維持在溫度23±2℃，濕度55±5％，12:12h光/暗循環的環境下。它們可以自由的取食食物和水。

藥物和試劑

法尼基轉移酶抑制劑(farnesyltransferase inhibitors，FTI)：①Farnesyl transferase inhibitor(FTI,FTI-277)從美國Calbiochem公司購買(Cat#344555)，在5％Tween 80產生乳液或溶解于dimethyl sulfoxide(DMSO)，進行腹腔注射(50mg/kg)或腦片孵育(1μM)。②Lonafarnib(SCH66336)從美國Medchemexpress公司購買(Cat#HY-15136)，溶解于dimethyl sulfoxide(DMSO)，進行灌胃給藥(50mg/kg)或腦片孵育(5μM)。

實驗操作

電生理的檢測和分析：(1)海馬腦片制備：乙醚麻醉后快速斷頭取腦，置于0-4℃冰凍ACSF中1分鐘備用。ACSF使用前通混合氣(95％O₂，5％CO₂)使PH值穩定在7.4。鼠腦稍加修飾后移至振動切片機浴槽內，在0-4℃ACSF中切取包含海馬的冠狀腦片3-6片(厚度350μm)。將切好的腦片迅速轉移至持續通混合氣的氧飽和ACSF中，在28℃左右孵育至少60分鐘后移至記錄浴槽。浴槽為浸潤式灌流系統，灌流速度2mL/min，灌流液為持續通95％O₂/5％CO₂混合氣體的ACSF。微電極的拉制：選用長10cm，外徑為1.5mm，內徑為0.86mm標準硼硅酸鹽玻璃毛細管，在水平拉制儀上用四步拉制法拉制成記錄用微電極。充灌電極內液后電極尖端入水阻抗為4-6MΩ。電極無需拋光即可直接進行實驗。循環灌流系統：實驗中ACSF用作灌流液進行循環灌流。溶液置于一定容積的刻度管中，并持續給95％O₂/5％CO₂混合氣，通過恒流泵的動力作用將氧飽和ACSF泵入記錄槽。溶液灌流速度由調節閥進行控制，通常為2-3mL/min，需要特殊沖洗的實驗，可將流速調至5-8mL/min，以使藥物快速而有效的作用于腦片細胞或者將殘留的藥物迅速沖洗干凈。灌流液溫度通過恒溫水浴鍋控制在28-30℃，使得記錄槽溫度維持在室溫附近。保持實驗室封閉透光，室內常溫(22-25℃)，并具備較好的隔離噪音等條件。灌流系統所用的灌流管定期(兩周)更換，以免被污塘堵塞。

(2)全細胞膜片鉗記錄：實驗在室溫(22-25℃)下進行。將孵育好的腦片，轉移到記錄糟內，并用鉑金絲網固定，置于正置顯微鏡載物臺(配有40×的水鏡)上。在40×水鏡下，通過CCD(EvolutuonQE)采集圖象并可在顯示器上進行實時觀察。實驗過程中，選取腦片上CA1或CA3區胞體飽滿均勻，邊界清晰的神經元為記錄對象。在電壓鉗模式下用MP-225微型操縱儀引導充有電極內液的玻璃微電極靠近細胞，記錄電極入水前要先給予一正壓(將1mL注射器向前輕推1/10的體積)，以防止電極尖端被污染。待電極靠近細胞，細胞出現小凹陷，并能觀察到電極阻抗上升3-5MΩ，釋放正壓并用給予適當負壓進行封接，同時逐步將鉗制電壓調節到–70mV，形成高阻封接(>1GΩ)。待形成穩定的封接后，給予強烈而短促的負壓打破電極尖端下的小片細胞膜，從而形成穩定的全細胞記錄模式。全細胞膜片鉗所用放大器為EPC-10，數據采集使用2.9kHz低通濾波，并在10kHz采樣。在電流記錄時，通過實時監控窗口，監測串聯電阻(Rs)的變化，防止破膜的回封引起電流動力學參數如幅度和衰減時間(decay time)的變化。其中Rs或者電容值的變化不應超過原值的20％，同時保持Rs<30M，Ra>200M。所采集數據中統計時舍去未補償的串聯電阻導致的電壓鉗誤差超過5mV的神經元數據。采樣后數據用PulseFit(HEKA公司)進行數據分析。記錄α7nACh受體電流(I_ACh)時，鉗制為–60mV，乙酰膽堿(ACh)溶解到灌流液中，通過快速噴藥系統局部對目標神經元胞體進行加藥。同時浴槽循環灌流液中加入1μM strychnine，10μM bicuculline，10μM NBQX和0.1μM TTX。電生理結果用pClamp軟件(Axon公司)或PulseFit軟件(HEKA公司)進行數據處理。膜片鉗記錄數據分析：相關量效曲線用Hill方程進行擬合，n為Hill系數，EC₅₀為半數有效劑量。

Western blot檢測

乙醚麻醉小鼠，斷頭取腦，分離海馬局部組織。加入RIPA蛋白裂解液，勻漿后低溫高速離心(4℃，12000r/min，15分鐘)，取上清液，BCA法測定蛋白濃度，上清液置于-80℃保存。將蛋白樣品與上樣緩沖液混合，100℃加熱5分鐘，離心3分鐘，取上清加樣后進行蛋白電泳。蛋白經SDS-PAGE電泳、轉至PVDF膜、5％脫脂牛奶封閉后，加α7nACh受體特異性一抗4℃孵育過夜。第二天，TBST洗脫3遍之后，再與辣根過氧化物(HRP)標記的相應二抗室溫反應2h，經適當洗滌，ECL化學發光顯色，X光片壓片曝光。之后將PVDF膜用抗體洗脫液洗滌15分鐘，重新封閉后加β-actin一抗及相應二抗體再次顯色曝光。用凝膠成像系統對膠片進行薄層密度掃描，并用Image J分析軟件反映蛋白含量。

實時定量RT-PCR

小鼠麻醉后斷頭取腦，冰上快速分離海馬和皮層置于離心管中，加入TRIzol RNA提取液，超聲粉碎裂解后，靜置15分鐘。加入氯仿混勻后離心15分鐘(12000rpm，4℃)。轉移上層無色水相至新的離心管中，加入異丙醇充分混勻后離心10分鐘(12000rpm，4℃)，棄上清，RNA沉淀于管底。加入75％乙醇振蕩后離心5分鐘(7500rpm，4℃)，棄上清，用DEPC處理水溶解RNA沉淀。核酸蛋白檢測儀測定樣品OD260、OD280和RNA的濃度，使OD260/OD280比值在1.8-2.0左右的RNA作為反轉錄模板。運用PCR擴增儀和RT Master Mix試劑盒進行逆轉錄(10μL體系)，反應條件：37℃15分鐘，85℃5秒終止反應。轉錄后的cDNA加DEPC水稀釋10倍。PCR擴增體系(5μLPremix Ex TaqTM，0.2μL Primer Forward，0.2μL Primer Reverse，1μL cDNA，3.6μL ddH2O)加入到96孔板中，每個樣品的目的基因和內參基因都設三個平行反應管。擴增條件：預變性90℃30秒，40個循環(95℃5秒，60℃30秒，72℃30秒)，總延伸72℃10分鐘。實時定量PCR反應結束后輸出Ct值，根據以下公式計算實驗組和對照組之間目的基因的相對表達差異。(Fold：實驗組與對照組目的基因拷貝數的比值；Ct11：實驗組目的基因Ct值；Ct10：實驗組內參基因Ct值；Ct01：對照組目的基因Ct值；Ct00：對照組內參基因Ct值。)Fold＝2^-ΔΔCt；ΔΔCt＝(Ct11–Ct10)–(Ct₀₁–Ct00)。α7nACh受體的引物序列為：5′-CACATTCCACACCAACGTCTT-3′和5′-AAAAGGGAACCAGCGTACATC-3′。GAPDH的引物序列為：5′-TGGGTGTGAACCACGAG-3′和5′-AAGTTGTCATGGATGACCTT-3′。

實驗結果

(1)海馬腦片進行FTI-277(1μM)或SCH66336(5μM)2-4小時孵育，能增加乙酰膽堿(ACh)誘導的α7nACh受體內向電流(I_ACh)的密度(FTI-277：P<0.05，n＝10小鼠；圖1-A，SCH66336：P<0.05，n＝10；圖1-B)。

(2)給與小鼠連續5天的FTI-277(50mg/kg)或SCH66336(50mg/kg)腹腔注射，引起小鼠海馬組織α7nACh受體的蛋白水平增加(FTI-277：P<0.01，n＝10；圖1-C，SCH66336：P<0.01，n＝10；圖1-D)。

(3)給與小鼠連續5天的FTI-277(50mg/kg)或SCH66336(50mg/kg)腹腔注射，引起小鼠海馬組織α7nACh受體的mRNA水平(FTI-277：P<0.01，n＝10；圖1-E，SCH66336：P<0.01，n＝10；圖1-F)。

結論：抑制法尼基轉移酶能增強α7nACh受體的活性和表達。

實施例2：法尼基轉移酶抑制劑改善老齡小鼠的認知功能——抗老年性癡呆。

實驗主要材料

4月齡和14月齡的雄性ICR小鼠(體重27-30g，SPF級)由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供，許可證號：SCXK(滬)2007－0005，合格證號：2007000517888。清潔級動物房飼養，溫度22－25℃，使用SPF級專用大小鼠顆粒飼料和SPF級消毒墊料(南京安立默科技有限公司提供)。12小時(6:00-18:00)明暗周期，自由進食水(南京醫科大學動物中心)。所有接觸動物的操作器械和材料均經紫外消毒滅菌，實驗動物操作人員經專門培訓，有實驗動物使用上崗合格證，試驗用液體的配制在醫用凈化工作臺中進行。動物抵達實驗室后，適應性飼養一周后開始試驗。動物活殺或處死均在麻醉條件下進行。

藥物和試劑

同實施例1。

α7nACh受體拮抗劑methyllycaconitine(MLA,Sigma Research Biochemicals,Natick,MA)溶解在生理鹽水中進行腹腔注射(5mg/kg)。

實驗操作

空間認知行為的評價：

Morris水迷宮試驗:水迷宮水溫保持(23±2)℃，池壁上標有東南西北四個入水點，將水池等分為四個象限(E、S、W、N)，迷宮上方安置帶有顯示系統的攝像機，用以同步記錄小鼠運動軌跡。訓練期間迷宮外參照物保持不變，以供鼠定位平臺。此實驗主要由隱蔽平臺試驗和探索試驗。(1)隱蔽平臺試驗(hidden platform trial)。試驗時平臺位置固定不變(第四象限)，分別從四個象限的入水點入水，訓練時將動物面朝池壁標示輕輕放入水中。記錄鼠從入水至找到平臺的游泳路線的長度及找到平臺的時間(逃避潛伏期，escape latency)，然后讓鼠在平臺上停留10秒。如果60秒內找不到平臺，潛伏期記為60秒，并將鼠置于平臺上休息10秒。訓練結束后，將鼠置于籠中，并注意保暖、用吹風機烘干鼠毛。每天在4個入水點各訓練1次，以四次潛伏期的算術均值作為這一天的成績進行統計分析。每天每只動物入水點順序保持一致，同一組內不同動物不同，以排除組內動物信息交流。空間探索試驗(probe trial)。隱蔽平臺試驗結束24小時后，撤除平臺。然后從平臺的同一對角入水點入水，記錄鼠在60秒內的游泳路徑，對小鼠原平臺所在象限停留時間％進行統計分析。觀察受試鼠的空間定位能力，及在空間探索過程中的變化規律。

“Y”迷宮試驗：自發性的交替行為可以用Y-maze實驗來評估。Y-maze即黑色Y形三等分輻射式迷路箱，由3個支臂和一個連接區組成，三臂互相間夾角120°，每臂長38.5厘米，上寬8厘米，下寬3.5厘米，高12厘米，三個臂可任選一臂為起始臂。每只小鼠從固定一臂的末端釋放，讓小鼠自由活動8分鐘，記錄每次進臂的次序。三次連續進入不同的三個臂被定為交替進臂(如：ABC，ACB，BAC，BCA，CAB，CBA)。交替進臂率的計算為：1－(錯誤次數/總次數－2)×100％。另外，總的進臂次數也可以確定。

海馬突觸傳遞功能檢查

腦片制備：小鼠在乙醚麻醉下快速斷頭取腦，置于0–4℃冰凍人工腦脊液(artificial cerebrospinal fluid，ACSF)中2min左右備用。ACSF成分為(mM)：124.0NaCl，4.5KCl，2.0CaCl₂，1.0MgCl₂，26.0NaHCO₃，1.2NaH₂PO₄，10.0D-glucose。使用前通混合氣(95％O₂，5％CO₂)使PH值穩定在7.4。鼠腦經稍加修飾后移至振動切片機浴槽內，在0–4℃ACSF中切取包含海馬的冠狀腦片2–4片(厚度400μm)。將切好的腦片迅速轉移至持續通飽和氧混合氣的ACSF中，在室溫(22–25℃)下孵育至少60min后移至恒溫記錄浴槽，浴槽為浸潤式灌流系統，灌流速度1ml/min，溫度30±1℃，并持續通氧。記錄電極使用標準硼硅酸鹽玻璃管經P-97拉制儀拉制，沖灌2M NaCl溶液后電極阻抗為4–5MΩ。刺激電極為自制雙極鎢絲電極，直徑50μm，極間距為100–150μm，尖端裸露40–60μm。刺激電極為雙極鎢絲電極置于海馬腦片CA2或CA1區的謝弗側支處，進行順向刺激，距離刺激電極約2–3mm，其尖端位于腦片表面下50–200μm處，記錄興奮性的突觸后電位EPSP。記錄信號經放大器放大，Bridge模式，濾波5kHz，經A/D卡進行數模轉換后用Clampex軟件(Axon Inc.，USA)顯示并保存。使用SEN-3301刺激器，刺激波寬0.1ms，刺激強度約為0.1–1.0mA，刺激間隔為15秒，每4個刺激進行一次疊加平均獲得標準EPSP。每次實驗時，刺激強度從閾值開始直至誘發最大EPSP，測定輸入–輸出(input-output relationship，I/O)曲線。每一個刺激強度取5個反應，以刺激強度為橫坐標，以平均的EPSP斜率為縱坐標得到I/O曲線。根據I/O曲線，選擇最大反應的刺激強度一半作為測試刺激強度進行穩定記錄。

統計學分析

定量資料表示為均值±標準誤。Morris水迷宮原站臺所在象限時間％和“Y”迷宮采用雙因數和單因素方差分析。Scheffe`s檢驗測定兩組間的差異顯著性。將差異P<0.05定義為差異顯著。

試驗結果：

(1)Morris水迷宮—隱蔽平臺試驗：與4月齡小鼠相比，14月老齡小鼠的逃避潛伏期顯著延長(P<0.01，n＝10，圖2-A)。FTI-277(5mg/kg)處理(10天)能減少14月齡小鼠的逃避潛伏期(P<0.01，n＝10)。α7nACh受體拮抗劑MLA(5mg/kg)能阻止FTI-277改善逃避潛伏期的作用(P<0.01，n＝10)。

(2)Morris水迷宮—空間探索試驗：與4月齡小鼠相比，14月齡小鼠在站臺象限的游泳時間顯著減少(P<0.01，n＝10，圖2-B)。FTI-277處理能恢復14月齡小鼠在站臺象限的游泳時間(P<0.01，n＝10)。MLA能阻止FTI-277改善空間探索能力的作用(P<0.01，n＝10)。

(3)“Y“迷宮的檢測：14月齡小鼠與4月齡小鼠比較進臂交替率有顯著性減少(P<0.05，n＝10，圖2-C)。FTI-277處理能明顯增加14月齡小鼠的進臂交替率(P<0.05，n＝10)。MLA能阻止FTI-277改善進臂交替率的作用(P<0.05，n＝10)。

(4)電生理檢測：14月齡小鼠的海馬CA1區的突觸傳遞斜率明顯低于4月齡小鼠(P<0.05和0.01，n＝10，圖2-D)。FTI-277處理能提高14月齡小鼠的突觸傳遞斜率(P<0.05和0.01，n＝10)。MLA能阻止FTI-277改善突觸傳遞斜率的作用(P<0.05和0.01，n＝10)。

結論：抑制法尼基轉移酶通過增強α7nACh受體活性發揮抗老年性癡呆的作用。

實施例3：法尼基轉移酶抑制劑改善阿爾茨海默病小鼠的認知功能——抗阿爾茨海默病癡呆(1)

實驗主要材料：

動物飼養在南京醫科大學實驗動物中心，并且維持在溫度23±2℃，濕度55±5％，12:12h光/暗循環的環境下。它們可以自由的取食物和水。

藥物和試劑

同實施例1和實施例2。

α7nACh受體激動劑3-(2,4-dimethoxybenzylidene)-anabaseine(DMXB，日本大昭制藥公司提供，code name GTS-21,Taisho Pharmaceuticals,Tokushima,Japan)溶解在生理鹽水中進行腹腔注射(0.2mg/kg)。乙酰膽堿酯酶抑制劑Galantamine hydrobromide(GAL，氫溴酸加蘭他敏，99％，Melonepharma，MD1560,Dalian,P.R.China)溶解在生理鹽水中進行腹腔注射(2mg/kg)。

阿爾茨海默病模型小鼠

APP/PS1小鼠：8月齡雄性和雌性APPswe/PS1dE9雙轉基因型小鼠(以下簡稱，APP/PS1小鼠)從Jackson實驗室(Bar Harbor，ME，USA)購得，運用Jackson實驗室推薦的PCR方法進行基因型鑒定。

實驗操作

空間認知行為的評價：同實施例1。

海馬突觸傳遞功能檢查：同實施例1。

長時程增強(long-term potentiation，LTP)的誘導是先用實驗刺激強度刺激腦片作為條件測試，采集20分鐘作為平均的基值(100％)，然后進行高頻條件刺激(HFS，100Hz，1秒)，再施以相同實驗測試，至少穩定記錄1小時，以判斷LTP的發生。

統計學分析方法：同實施例1。

試驗結果：

(1)Morris水迷宮—隱蔽平臺試驗：與野生型小鼠相比，APP/PS1小鼠的逃避潛伏期顯著延長(P<0.01，n＝10，圖3-A)。FTI-277(50mg/kg)處理(20天)能減少APP/PS1小鼠的逃避潛伏期(P<0.05，n＝10)。氫溴酸加蘭他敏GAL(2mg/kg)或者α7nACh受體激動劑DMXB(0.2mg/kg)20天處理并不能明顯改善APP/PS1小鼠的逃避潛伏期(P>0.05，n＝10，圖3-B)。但是，DMXB與FTI-277聯合使用能顯著地降低APP/PS1小鼠的逃避潛伏期(P<0.01，n＝10)。

(2)Morris水迷宮—空間探索試驗：與野生型小鼠相比，APP/PS1小鼠在站臺象限的游泳時間顯著減少(P<0.01，n＝10，圖3-C)。FTI-277處理能增加APP/PS1小鼠在站臺象限的游泳時間(P<0.05，n＝10)。DMXB單獨處理并不能明顯改善APP/PS1小鼠在站臺象限的游泳時間(P>0.05，n＝10)。但是，DMXB與FTI-277聯合使用能顯著地增加APP/PS1小鼠在站臺象限的游泳時間(P<0.01，n＝10)。

(3)“Y“迷宮的檢測結果顯示，APP/PS1小鼠與野生型小鼠比較進臂交替率有顯著性減少(P<0.01，n＝10，圖3-D)。FTI-277處理能明顯增加APP/PS1小鼠的進臂交替率(P<0.05，n＝10)。DMXB單獨處理并不能明顯改善APP/PS1小鼠的進臂交替率(P>0.05，n＝10)。但是，DMXB與FTI-277聯合使用能顯著地增加APP/PS1小鼠的進臂交替率(P<0.01，n＝10)。

(4)電生理檢測結果顯示，APP/PS1小鼠的海馬CA1區的LTP不能誘導(n＝10，圖3-E)。FTI-277處理能恢復APP/PS1小鼠的LTP誘導(n＝10)。DMXB單獨處理并不能恢復APP/PS1小鼠的LTP誘導(n＝10，圖3-F)。但是，DMXB與FTI-277聯合使用能保護APP/PS1小鼠的LTP誘導(n＝10)。

結論：抑制法尼基轉移酶能增強膽堿能受體激動劑的抗阿爾茨海默病癡呆作用。

實施例4：法尼基轉移酶抑制劑改善阿爾茨海默病小鼠的認知功能——抗阿爾茨海默病癡呆(2)

實驗主要材料：

動物飼養在南京醫科大學實驗動物中心，并且維持在溫度23±2℃，濕度55±5％，12:12h光/暗循環的環境下。它們可以自由的取食物和水。

藥物和試劑

同實施例1，實施例2和實施例3。

阿爾茨海默病模型小鼠

Aβ_25-35小鼠：4月齡雄性ICR小鼠(南京醫科大學實驗動物中心)麻醉后俯臥固定于立體定位儀，行背側頸正中切口，暴露顱骨，按Paxinos和Watson小鼠立體定位圖譜，并切開，以前囟點為坐標，前囟點后0.3mm，右側1mm，深2.5mm，為側腦室注射點。Aβ_25-35(sigma公司)置于37℃水浴箱中孵育96小時，使其聚集(老化)。用微量進樣器于單側腦室內注射Aβ_25-35約3μl。5分鐘內緩慢注射，留針分鐘，保證溶液充分進入側腦室。注射完畢后以局部軟組織封閉針孔，縫合皮膚。建立AD小鼠模型。假手術組小鼠給予同容積的生理鹽水的側腦室注射。

實驗操作

空間認知行為的評價：同實施例1。

海馬突觸傳遞功能檢查：同實施例1和同實施例3。

統計學分析方法：同實施例1。

試驗結果：

(1)Morris水迷宮—隱蔽平臺試驗，與對照組相比，Aβ_25-35小鼠的逃避潛伏期顯著延長(P<0.01，n＝10，圖4-A)。SCH66336(50mg/kg)處理(20天)能減少Aβ_25-35小鼠的逃避潛伏期(P<0.05，n＝10)。DMXB(0.2mg/kg)單獨處理并不能明顯改善Aβ_25-35小鼠的逃避潛伏期(P>0.05，n＝10，圖4-B)。但是，DMXB與SCH66336聯合使用能顯著地降低Aβ_25-35小鼠的逃避潛伏期(P<0.01，n＝10)。

(2)Morris水迷宮—空間探索試驗：與野生型小鼠相比，Aβ_25-35小鼠在站臺象限的游泳時間顯著減少(P<0.01，n＝10，圖4-C)。SCH66336處理能增加Aβ_25-35小鼠在站臺象限的游泳時間(P<0.05，n＝10)。DMXB單獨處理并不能明顯改善Aβ_25-35小鼠在站臺象限的游泳時間(P>0.05，n＝10)。但是，DMXB與FTI-277聯合使用能顯著地增加Aβ_25-35小鼠在站臺象限的游泳時間(P<0.01，n＝10)。

(3)“Y“迷宮的檢測結果顯示，Aβ_25-35小鼠與對照組比較進臂交替率有顯著性減少(P<0.05，n＝10，圖4-D)。SCH66336處理處理能明顯增加Aβ_25-35小鼠的進臂交替率(P<0.05，n＝10)。DMXB單獨處理并不能明顯改善Aβ_25-35小鼠的逃避潛伏期(P>0.05，n＝10)。但是，DMXB與SCH66336聯合使用能顯著地增加Aβ_25-35小鼠的進臂交替率(P<0.01，n＝10)。

(8)電生理檢測結果顯示，Aβ_25-35小鼠的海馬CA1區不能誘導LTP(n＝10，圖4-E)。SCH66336處理能恢復Aβ_25-35小鼠的LTP誘導(n＝10)。

結論：抑制法尼基轉移酶能增強膽堿能受體活化的抗阿爾茨海默病癡呆作用。

實施例5：法尼基轉移酶抑制劑改善腦卒中小鼠的認知功能——抗血管性癡呆作用

實驗主要材料：雄性ICR小鼠(體重25g～30g)購自南京醫科大學實驗動物中心

實驗操作：

腦缺血動物模型的制備：根據Zea-longa改良線栓法制備大腦中動脈閉塞(MCAO)模型：將尼龍線(0.4號，d＝0.104mm)剪成20mm長，頭端約4mm蘸少許硅膠，懸掛在通風處24小時以上晾干。在顯微鏡下篩選出前端光滑圓鈍的尼龍線，尼龍線的頂端形成膨大的球形，可使阻塞血流的效果更佳。模型小鼠以2％水合氯醛腹腔麻醉(20ml/kg，i.p.)，仰臥位固定于手術臺上，備皮行頸正中切口，分離右側頸總動脈、頸外動脈及頸內動脈，結扎ECA與CCA，動脈夾夾閉ICA遠心端，用眼科剪在CCA作一切口，用眼科鑷夾住漁線經切口處插入，松開動脈夾，繼續插入漁線至稍有阻力，插入深度為(12±0.5)mm左右，實現右側大腦中動脈阻塞導致的局部腦缺血，入口處做一單結，防止線栓的滑脫，用浸有生理鹽水的脫脂棉球蓋住頸部切口，1小時后拔出漁線，將之前的單結處重新結扎，縫好切口，實現大腦中動脈再灌注。所有操作均在無菌條件下進行，皮膚切開處用青霉素抗菌。實驗過程中將小鼠體溫控制在37℃左右。動物清醒后，觀察小鼠的行為和神經癥狀，根據Zea-Longa建立的神經功能缺損程度的五級四分法標準系統地評分。假手術組(sham-op)處理步驟同上，但漁線插入頸總動脈而不插入大腦中動脈。

空間認知行為檢測：同實施例1。

實驗結果

(1)Morris水迷宮—隱蔽平臺試驗，在MCAO后2周，MCAO小鼠的逃避潛伏期比對照組小鼠顯著延長(P<0.01，n＝10，圖5-A)。FTI-277(50mg/kg)處理(20天)能減少MCAO小鼠的逃避潛伏期(P<0.01，n＝10)。

(2)Morris水迷宮—空間探索試驗：與假手術組小鼠相比，MCAO小鼠在站臺象限的游泳時間顯著減少(P<0.05，n＝10，圖5-B)。FTI-277處理能增加FTI-277在站臺象限的游泳時間(P<0.05，n＝10)。

(3)“Y“迷宮的檢測結果顯示，MCAO小鼠與假手術組小鼠相比進臂交替率減少(P<0.05，n＝10，圖5-C)。FTI-277處理能改善MCAO小鼠的進臂交替率(P<0.05，n＝10)。

結論：抑制法尼基轉移酶有抗血管性癡呆的作用。

實施例6：法尼基轉移酶抑制劑改善帕金森病小鼠的認知功能——抗帕金森病癡呆作用

實驗主要材料：4月齡雄性C57小鼠(SPF級)由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供。

實驗操作：

帕金森病模型的制備：MPTP-MPTP(1-Methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropyridine，1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶)是一種神經毒素。MPTP能夠通過破壞黑質中產生多巴胺的神經細胞影響認知功能。MPTP(25mg/kg)進行小鼠皮下注射每周2次，共進行連續5周的MPTP處理。

空間認知行為的評價：同實施例1。

統計學分析方法：同實施例1。

實驗結果

(1)“Y“迷宮的檢測結果顯示，在MPTP處理5周后，MPTP小鼠與對照組小鼠相比進臂交替率減少(P<0.05，n＝10，圖6)。SCH66336(50mg/kg)處理(20天)處理能改善MPTP小鼠的進臂交替率(P<0.05，n＝10)。

結論：抑制法尼基轉移酶有抗帕金森病癡呆的作用。

SEQUENCE LISTING

<110> 南京醫科大學

<120> 法尼基轉移酶抑制劑在制備易化膽堿能神經系統藥物中的應用

<130>

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

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<213> 人工序列

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<213> 人工序列

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<213> 人工序列

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