本發明屬于微生物肥料領域，具體地說，涉及一種甲基營養型芽孢桿菌菌劑及其制備方法。
背景技術：
甲基營養型芽孢桿菌是一類嗜溫、好氧、產芽孢的桿狀細菌，該菌廣泛存在于自然界及植物根莖等內部器官中，安全無毒，且具有廣譜的抗菌活性和極強的抗逆能力。近年來，國內學者對甲基營養型芽孢桿菌在植物生防、促生等方面應用研究較多，Munusamy Madhaiyan等人(Munusamy Madhaiyan,Selvaraj Poonguzhali,Soon-WoKwon,et al.Bacillus methylotrophicus sp.nov.,a methanol utilizing,plant-growth promoting bacterium isolated from rice rhizosphere siol[J].IJSEM,2010,60(10):2490-2495)從水稻根際土壤中分離篩選出一株甲基營養型芽孢桿菌，該菌不僅能促進水稻生長，而且也能抑制水稻青枯病的發生；周登博等人(周登博，井濤，譚昕等，6種基質拮抗菌發酵液對香蕉枯萎病及相關防御酶的影響[J]，熱帶作物學報，2013,34(5)：947-951)從土壤中分離的一株甲基營養型芽孢桿菌菌株4-L-16，對香蕉枯萎病有顯著的防治效果。呂倩等人(呂倩，胡江春，王楠等，南海深海甲基營養型芽孢桿菌SHB114抗真菌脂肽活性產物的研究[J]，中國生物防治學報，2014,30(1)：113-120)在南海深海分離出一株甲基型營養型芽孢桿菌，該菌對黃瓜炭疽病菌、立枯絲核菌、黃瓜枯萎病菌等具有較強的抑制作用。可見，甲基營養型芽孢桿菌在防治病害發生、促進作物生長，改善農產品品質等方面顯示出廣闊的應用前景。也正因如此，甲基營養型芽孢桿菌被越來越多的企業看中，作為生產生物菌劑的功能菌所用。
生物菌劑的主要成分是活的有益微生物，由于液體發酵液有效活菌數下降快、不易保存，且物流運輸不方便，所以除生物葉面肥外，一般生物菌劑均經過合適的載體吸附后，制備成為粉劑菌劑或顆粒菌劑。但由于活菌保活對載體的特性有一定的要求，需要載體細度大，具有一定空隙，并含有一定的有機質，所以長久以來菌劑生產大多選擇草炭作為吸附載體。隨著生物菌劑產業的不斷擴大，草炭的開采量逐年增加，對環境造成一定破壞的同時單價也在逐年提高，因此，選擇合適的替代載體成為生物菌劑生產環節的迫切需求。秸稈含有豐富的N、P、K、有機質及其他中微量元素，且資源豐富、價格低廉、易得，適合作為菌劑載體。近年來，隨著秸稈囤積量的增加及因秸稈焚燒帶來的大氣污染等問題的頻繁出現，如何將秸稈資源化應用于生物菌劑生產中，這也成為生物肥料產業各界的關注熱點。
目前，市場上銷售的或專利中涉及到的甲基營養型芽孢桿菌菌劑，其吸附載體多為草炭，而草炭為不可再生資源，長期大量開采終有枯竭的時候。
技術實現要素：
有鑒于此，本發明針對上述的問題，提供了一種甲基營養型芽孢桿菌菌劑及其制備方法，該菌劑一方面調節作物微生物生態區系，改善作物品質，另一方面減少草炭使用量，降低廢棄農作物秸稈囤積量，緩解因秸稈焚燒帶來的環境污染等問題。
為了解決上述技術問題，本發明公開了一種甲基營養型芽孢桿菌菌劑，包括質量份的原料：草炭10～14份、農作物秸稈粉40～56份、礦物質13～20份，以草炭、農作物秸稈粉和礦物質的質量總量計，該甲基營養型芽孢桿菌菌劑還包括250-450mL/kg的甲基營養型芽孢桿菌發酵液。
進一步地，甲基營養型芽孢桿菌發酵液含有效活菌數大于或等于5.5×108/ml。
進一步地，甲基營養型芽孢桿菌發酵液通過以下步驟制備得到：
1.1)將保存在-4℃環境下的甲基營養型芽孢桿菌菌株接種至牛肉蛋白胨平板上30℃培養48h；挑取單菌落接種至牛肉膏蛋白胨液體培養基中，30℃培養24h后的液體即為所需接種液；
1.2)將步驟1.1)中的接種液接種于裝有種子培養基的300L種子罐中，接菌量為10％，接菌后進行發酵；初始pH值6.9-7.1、溫度28-35℃、轉速180-220r/min；
1.3)當種子罐發酵9-10小時，菌體生長處于對數期，此時將種子罐中的發酵液加入到裝有發酵培養基的3000L發酵罐中繼續發酵，控制條件同種子罐，培養28-30小時，當菌體芽孢形成90-95％時，結束發酵，即得甲基營養型芽孢桿菌發酵液；
其中，所述牛肉膏蛋白胨培養基：牛肉膏5.0g，蛋白胨10.0g，瓊脂15-20g，pH 7.2-7.6；
所述種子培養基：葡萄糖10g/L、蛋白胨2g/L、MgSO4 0.5g/L、酵母膏2g/L、牛肉膏2g/L；
所述發酵培養基：玉米粉30.0g/L，豆餅粉20.0g/L，MgSO4 0.2g/L，NaH2PO4 0.5g/L，CaCl2.2H2O 0.1g/L，K2HPO4 0.5g/L，pH 7.0；
各培養基滅菌條件為：0.1-0.15MPa，121℃滅菌30分鐘。
進一步地，農作物秸稈粉為木薯莖稈、甘蔗葉、菠蘿莖葉、玉米秸稈、香蕉葉、荔枝枝葉、龍眼枝葉中的一種或幾種的混合物經粉碎，并過80目篩后所得的秸稈粉。
進一步地，礦物質為沸石粉、蛭石粉、硅藻土、白炭黑、輕質碳酸鈣中的一種或幾種的混合物。
本發明還公開了一種甲基營養型芽孢桿菌菌劑的制備方法，包括以下步驟：
1)制備甲基營養型芽孢桿菌發酵液；
2)稱量：按照質量百分比稱量以下組分：草炭10～14份、農作物秸稈粉40～56份、礦物質13～20份，以草炭、農作物秸稈粉和礦物質的質量總量計，該甲基營養型芽孢桿菌菌劑還包括250-450mL/kg的甲基營養型芽孢桿菌發酵液；
3)將稱量好的草炭、甲基營養型芽孢桿菌發酵液倒入混拌機里進行吸附，混合均勻后，往混拌機中逐步添加農作物秸稈粉進行稀釋混勻，最后加入礦物質，攪拌均勻后將物料進行粉碎，過100目篩，調整物料水分含量及pH值，即得甲基營養型芽孢桿菌菌劑。
進一步地，制備甲基營養型芽孢桿菌發酵液具體為：
1.1)將保存在-4℃環境下的甲基營養型芽孢桿菌菌株接種至牛肉蛋白胨平板上30℃培養48h；挑取單菌落接種至牛肉膏蛋白胨液體培養基中，30℃培養24h后的液體即為所需接種液；
1.2)將步驟1.1)中的接種液接種于裝有種子培養基的300L種子罐中，接菌量為10％，接菌后進行發酵；初始pH值6.9-7.1、溫度28-35℃、轉速180-220r/min；
1.3)當種子罐發酵9-10小時，菌體生長處于對數期，此時將種子罐中的發酵液加入到裝有發酵培養基的3000L發酵罐中繼續發酵，控制條件同種子罐，培養28-30小時，當菌體芽孢形成90-95％時，結束發酵，即得甲基營養型芽孢桿菌發酵液。
進一步地，牛肉膏蛋白胨培養基：牛肉膏5.0g，蛋白胨10.0g，瓊脂15-20g，pH 7.2-7.6；所述種子培養基：葡萄糖10g/L、蛋白胨2g/L、MgSO40.5g/L、酵母膏2g/L、牛肉膏2g/L；所述發酵培養基：玉米粉30.0g/L，豆餅粉20.0g/L，MgSO4 0.2g/L，NaH2PO4 0.5g/L，CaCl2.2H2O 0.1g/L，K2HPO4 0.5g/L，pH 7.0；各培養基滅菌條件為：0.1-0.15MPa，121℃滅菌30分鐘。
進一步地，甲基營養型芽孢桿菌菌劑的水分含量少于或等于29％，pH為6.9～7.5。
與現有技術相比，本發明可以獲得包括以下技術效果：
1)本發明選用草炭和農作物秸稈粉為復合載體，且復合載體組成比例已進行菌種保存實驗驗證，菌種保質期大于12月，符合農用微生物菌劑國家標準GB 20287-2006。
從產品的組成上看出，如果不添加40％-56％農作物秸稈，則這部分量需要由草炭補充。本方法采用農作物秸稈和草炭作為載體，可以減少40-56％草炭使用量，因此，該復合載體既可以保證功能菌劑與草炭的吸附量，延長功能菌種的保存時間，又可以減少約50％的草炭使用量，
草炭市場價格約340元/噸，而農作物秸稈粉價格約100-200元/噸，用農作物秸稈粉替代部分草炭，故可降低產品成本，因此，本發明消納了大量農作物秸稈，既保障了產品質量，降低了產品成本，又緩解了因秸稈焚燒帶來的環境污染等問題。
2)本發明添加了甲基營養型芽孢桿菌，該菌對人畜無毒害，可調節作物微生物生態區系，改善作物品質，且對植物枯萎病害表現出較強的防治效果。
當然，實施本發明的任一產品并不一定需要同時達到以上所述的所有技術效果。
具體實施方式
以下將配合實施例來詳細說明本發明的實施方式，藉此對本發明如何應用技術手段來解決技術問題并達成技術功效的實現過程能充分理解并據以實施。
本發明公開了一種甲基營養型芽孢桿菌菌劑，包括質量份的原料：草炭10～14份、農作物秸稈粉40～56份、礦物質13～20份，以草炭、農作物秸稈粉和礦物質的質量總量計，該甲基營養型芽孢桿菌菌劑還包括250-450mL/kg的甲基營養型芽孢桿菌發酵液。
其中，由于菌在保存過程中有效活菌數會逐漸下降，若甲基營養型芽孢桿菌發酵液添加量小，產品有效活菌數會達不到農用微生物菌劑的國家標準GB 20287-2006；若添加量大，則會增加產品成本。
本發明選用草炭和農作物秸稈粉為復合載體，若農作物秸稈粉含量高于草炭，不利于菌的存活，若農作物秸稈粉含量低于草炭，則達不到消納農作物秸稈的目的。
礦物質的添加，一方面能夠維持產品中菌的生存，另一方面增加產品中微量元素的含量，添加量太少不足以維持菌的存活，添加太多，會增加產品成本。
本發明還公開了一種甲基營養型芽孢桿菌菌劑的制備方法，包括以下步驟：
1)制備甲基營養型芽孢桿菌發酵液：
1.1)將保存在-4℃環境下的甲基營養型芽孢桿菌菌株接種至牛肉蛋白胨平板上30℃培養48h；挑取單菌落接種至牛肉膏蛋白胨液體培養基中，30℃培養24h后的液體即為所需接種液；其中，所述牛肉膏蛋白胨培養基：牛肉膏5.0g，蛋白胨10.0g，瓊脂15-20g，pH 7.2-7.6；
1.2)將步驟1.1)中的接種液接種于裝有種子培養基的300L種子罐中，接菌量為10％，接菌后進行發酵；初始pH值6.9-7.1、溫度28-35℃、轉速180-220r/min；所述種子培養基：葡萄糖10g/L、蛋白胨2g/L、MgSO40.5g/L、酵母膏2g/L、牛肉膏2g/L；其中，初始pH值、溫度、轉速在上述范圍內提高發酵液中菌的有效活菌數量。
1.3)當種子罐發酵9-10小時，菌體生長處于對數期，此時將種子罐中的發酵液加入到裝有發酵培養基的3000L發酵罐中繼續發酵，控制條件同種子罐，培養28-30小時，當菌體芽孢形成90％-95％時，結束發酵，即得甲基營養型芽孢桿菌發酵液；所述發酵培養基：玉米粉30.0g/L，豆餅粉20.0g/L，MgSO4 0.2g/L，NaH2PO4 0.5g/L，CaCl2.2H2O 0.1g/L，K2HPO40.5g/L，pH 7.0；
各培養基滅菌條件為：0.1-0.15MPa，121℃滅菌30分鐘。
2)稱量：按照質量百分比稱量以下組分：草炭10～14份、農作物秸稈粉40～56份、礦物質13～20份，以草炭、農作物秸稈粉和礦物質的質量總量計，該甲基營養型芽孢桿菌菌劑還包括250-450mL/kg的甲基營養型芽孢桿菌發酵液；
3)將稱量好的草炭、甲基營養型芽孢桿菌發酵液倒入混拌機里進行吸附，混合均勻后，往混拌機中逐步添加農作物秸稈粉進行稀釋混勻，最后加入礦物質，攪拌均勻后將物料進行粉碎，過100目篩，調整物料水分含量少于或等于29％，pH為6.9～7.5，即得甲基營養型芽孢桿菌菌劑。
實施例1
配方：甲基營養型芽孢桿菌發酵液200L、草炭120kg、甘蔗葉粉550kg、蛭石粉130kg。
制備方法：準確稱取上述甲基營養型芽孢桿菌發酵液、草炭倒入混拌機里進行吸附，混合均勻后，再往混拌機中添加甘蔗葉粉逐步稀釋混勻，最后加入蛭石粉，攪拌均勻后將物料進行粉碎，過100目篩，調整物料水分含量為28.6％，pH為7.0，即得甲基營養型芽孢桿菌菌劑。
所述甲基營養型芽孢桿菌發酵液是通過以下方法制備得到的：
(1)將保存在-4℃環境下的甲基營養型芽孢桿菌菌株接種至牛肉蛋白胨平板上30℃培養48h。挑取單菌落接種至牛肉膏蛋白胨液體培養基中，30℃培養24h后即得接種液。所述牛肉膏蛋白胨培養基為牛肉膏5.0g，蛋白胨10.0g，瓊脂15-20g，pH 7.2-7.6；
(2)將上述培養好的接種液接種于裝有種子培養基的300L種子罐中，接菌量為10％，接菌后進行發酵。種子培養基：葡萄糖10g/L、蛋白胨2g/L、MgSO4 0.5g/L、酵母膏2g/L、牛肉膏2g/L；培養條件：初始pH值為7.0，溫度為30℃，轉速200r/min。
(3)當種子罐發酵9-10小時，菌體生長處于對數期，此時將種子罐中的發酵液加入到裝有發酵培養基的3000L發酵罐中繼續發酵，控制條件同種子罐，培養28-30小時，當菌體芽孢形成90-95％時，結束發酵，即得甲基營養型芽孢桿菌發酵液，此時有效活菌數為5.8×108/ml。所述發酵培養基為玉米粉30.0g/L，豆餅粉20.0g/L，MgSO4 0.2g/L，NaH2PO4 0.5g/L，CaCl2.2H2O 0.1g/L，K2HPO4 0.5g/L，pH 7.0。
各培養基滅菌條件為：0.1-0.15MPa，121℃滅菌30分鐘。
實施例2
配方：甲基營養型芽孢桿菌發酵液300L、草炭100kg、甘蔗葉粉400kg、蛭石粉200kg。
制備方法：準確稱取上述甲基營養型芽孢桿菌發酵液、草炭倒入混拌機里進行吸附，混合均勻后，再往混拌機中添加甘蔗葉粉逐步稀釋混勻，最后加入蛭石粉，攪拌均勻后將物料進行粉碎，過100目篩，調整物料水分含量為28.6％，pH為7.5，即得甲基營養型芽孢桿菌菌劑。
所述甲基營養型芽孢桿菌發酵液是通過以下方法制備得到的：
(1)將保存在-4℃環境下的甲基營養型芽孢桿菌菌株接種至牛肉蛋白胨平板上30℃培養48h。挑取單菌落接種至牛肉膏蛋白胨液體培養基中，30℃培養24h后即得接種液。所述牛肉膏蛋白胨培養基為牛肉膏5.0g，蛋白胨10.0g，瓊脂15-20g，pH 7.2-7.6；
(2)將上述培養好的接種液接種于裝有種子培養基的300L種子罐中，接菌量為10％，接菌后進行發酵。種子培養基：葡萄糖10g/L、蛋白胨2g/L、MgSO4 0.5g/L、酵母膏2g/L、牛肉膏2g/L；培養條件：初始pH值6.9、溫度35℃、轉速180r/min。
(3)當種子罐發酵9-10小時，菌體生長處于對數期，此時將種子罐中的發酵液加入到裝有發酵培養基的3000L發酵罐中繼續發酵，控制條件同種子罐，培養28-30小時，當菌體芽孢形成90-95％時，結束發酵，即得甲基營養型芽孢桿菌發酵液，此時有效活菌數為5.5×108/ml。所述發酵培養基為玉米粉30.0g/L，豆餅粉20.0g/L，MgSO4 0.2g/L，NaH2PO4 0.5g/L，CaCl2.2H2O 0.1g/L，K2HPO4 0.5g/L，pH 7.0。
各培養基滅菌條件為：0.1-0.15MPa，121℃滅菌30分鐘。
實施例3
配方：甲基營養型芽孢桿菌發酵液300L、草炭140kg、甘蔗葉粉560kg、蛭石粉150kg。
制備方法：準確稱取上述甲基營養型芽孢桿菌發酵液、草炭倒入混拌機里進行吸附，混合均勻后，再往混拌機中添加甘蔗葉粉逐步稀釋混勻，最后加入蛭石粉，攪拌均勻后將物料進行粉碎，過100目篩，調整物料水分含量為29.2％，pH為7.3，即得甲基營養型芽孢桿菌菌劑。
所述甲基營養型芽孢桿菌發酵液是通過以下方法制備得到的：
(1)將保存在-4℃環境下的甲基營養型芽孢桿菌菌株接種至牛肉蛋白胨平板上30℃培養48h。挑取單菌落接種至牛肉膏蛋白胨液體培養基中，30℃培養24h后即得接種液。所述牛肉膏蛋白胨培養基為牛肉膏5.0g，蛋白胨10.0g，瓊脂15-20g，pH 7.2-7.6；
(2)將上述培養好的接種液接種于裝有種子培養基的300L種子罐中，接菌量為10％，接菌后進行發酵。種子培養基：葡萄糖10g/L、蛋白胨2g/L、MgSO4 0.5g/L、酵母膏2g/L、牛肉膏2g/L；培養條件：初始pH值6.9-7.1、溫度28-35℃、轉速180-220r/min。
(3)當種子罐發酵9-10小時，菌體生長處于對數期，此時將種子罐中的發酵液加入到裝有發酵培養基的3000L發酵罐中繼續發酵，控制條件同種子罐，培養28-30小時，當菌體芽孢形成90-95％時，結束發酵，即得甲基營養型芽孢桿菌發酵液，此時有效活菌數為6.6×108/ml。所述發酵培養基為玉米粉30.0g/L，豆餅粉20.0g/L，MgSO4 0.2g/L，NaH2PO4 0.5g/L，CaCl2.2H2O 0.1g/L，K2HPO4 0.5g/L，pH 7.0。
各培養基滅菌條件為：0.1-0.15MPa，121℃滅菌30分鐘。
實施例4
配方：甲基營養型芽孢桿菌發酵液450L、草炭150kg、甘蔗葉粉625kg、蛭石粉225kg。
制備方法：準確稱取上述甲基營養型芽孢桿菌發酵液、草炭倒入混拌機里進行吸附，混合均勻后，再往混拌機中添加甘蔗葉粉逐步稀釋混勻，最后加入蛭石粉，攪拌均勻后將物料進行粉碎，過100目篩，調整物料水分含量為29％，pH為6.9，即得甲基營養型芽孢桿菌菌劑。
所述甲基營養型芽孢桿菌發酵液按實施例一方法制備得到，且有效活菌數為5.5×108/ml。
下面結合具體的實驗方案對本發明的技術效果進行說明：
選取長勢一致的3葉甜瓜幼苗移栽到盆缽中，移栽7天后，對甜瓜苗進行接菌處理。處理1：先接種枯萎病病原菌，隔1天再分別施入實施例1、2、3中制備的菌劑，標記為實施例1、實施例2、實施例3；處理2：先分別施入實施例1、2、3中制備的菌劑，隔1天再接種枯萎病病原菌，標記為實施例Ⅰ、實施例Ⅱ、實施例Ⅲ；對照處理：只接種枯萎病病原菌，標記為CK。每個處理10盆，每盆1株甜瓜苗。病原菌接種量均為107cfu/mL孢子懸浮液10ml，甲基營養型芽孢桿菌菌劑施用量菌為1g/盆。接菌7天之后，記錄甜瓜發病情況，計算其病情指數及相對防治效果，統計結果見表1。
甜瓜枯萎病發病情況按標準劃分為5級：0級：全株無病；1級：植株1/4以下葉面表現萎蔫癥狀；2級：植株1/4到1/2葉面表現萎蔫癥狀；3級：植株1/2以上葉面表現萎蔫癥狀：4級：全株萎蔫死亡。
病情指數＝[Σ(病級株數×病害級數)/(該處理盆栽苗總和×發病最重級的代表數值)]×100。
相對防治效果＝[(對照病情指數-處理病情指數)/對照病情指數]×100％。
表1本發明甲基營養型芽孢桿菌菌劑對甜瓜枯萎病的防治效果
以上結果表明，先施入甲基營養型芽孢桿菌菌劑后接病原菌處理的甜瓜病情指數要小于先接病原菌后施入菌劑的處理，說明在一定程度上甲基營養型芽孢桿菌菌劑對甜瓜枯萎病的發生有一定的預防作用。另外，不管是先病原菌之前或是之后施入菌劑，均高于對照防治效果。可見，本發明的甲基營養型芽孢桿菌菌劑對甜瓜枯萎病有一定的預防及防治效果。
上述說明示出并描述了發明的若干優選實施例，但如前所述，應當理解發明并非局限于本文所披露的形式，不應看作是對其他實施例的排除，而可用于各種其他組合、修改和環境，并能夠在本文所述發明構想范圍內，通過上述教導或相關領域的技術或知識進行改動。而本領域人員所進行的改動和變化不脫離發明的精神和范圍，則都應在發明所附權利要求的保護范圍內。