本發明涉及生物技術領域，具體指N15多肽在制備藍藻抑制劑中的用途。

背景技術：

藍藻之所以又稱藍細菌，是因為藍藻是最原始、最古老的藻類.其結構簡單，無典型的細胞核，所以又稱藍細菌，屬于原核生物。已知藍藻約2000種，中國已有記錄的約900種。藍藻有極大的適應性，分布很廣。在一些營養豐富的水體中，有些藍藻常于夏季大量繁殖，并在水面形成一層藍綠色而有腥臭味的浮沫，稱為“水華”，大規模的藍藻爆發，被稱為“綠潮”(和海洋發生的赤潮對應)。綠潮引起水質惡化，嚴重時耗盡水中氧氣而造成魚類的死亡。

技術實現要素：

本發明的目的在于提供一種多肽，該多肽能夠抑制藍藻生長，具有在制備細菌抑制劑中的用途，它已被現有技術公開，名為N15多肽。

N15多肽是一個具有15個氨基酸的短肽，其序列為甲硫氨酸-脯氨酸-酪氨酸-絲氨酸-蘇氨酸-谷氨酸-亮氨酸-異亮氨酸-苯丙氨酸-酪氨酸-異亮氨酸-谷氨酸-甲硫氨酸-天門冬氨酸-脯氨酸，它具有多種生物學功能，包括調節NF-κB轉錄因子結合目的基因的能力，影響NF-κB目的基因產物蛋白質的轉錄和表達；阻斷PCNA結合DNA聚合酶，從而阻止細胞DNA合成抑制細胞增殖；抑制上皮細胞增生，調節表皮增生及分化，使皮膚角化過程正常化等。

發明人發現在研究中發現N15可以抑制革蘭氏陰性菌(大腸桿菌)、藍細菌的生長，N15多肽能夠對各種大腸桿菌和藍藻的生長產生抑制作用。N15多肽抑制藍藻增殖可能是通過抑制DNA復制和異形胞分化基因的表達，起到抑制藍藻增殖的。

本發明還提供了一種N15多肽制備的抗藍藻藥物，為N15多肽的水溶液，濃度大于等于100μg/mL。

本發明的有益效果：N15多肽是一種結構清晰，易于工業化生產的多肽，它可以抑制藍藻的增殖，效果好且無毒副作用。

附圖說明

圖1為N15對魚腥藍細菌PCC 7120的抑菌曲線。

圖2為缺氮誘導48小時對照組和N15實驗組魚腥藍細菌PCC7120異形胞的分化情況。

圖3為熒光定量RT-PCR檢測N15對藍藻hetR基因mRNA表達量的影響。

圖4為熒光定量RT-PCR檢測N15對藍藻ntcA基因mRNA表達量的影響。

具體實施方式

下面結合附圖和具體實驗例對本發明作進一步的論證說明，以下實驗例僅是對本發明的解釋而本發明并不局限于以下實驗例。

實驗例1：N15抑制了魚腥藍細菌的生長

實驗方法：

將魚腥藍細菌PCC 7120在液體BG11培養基中培養至OD750(波長750nm處的吸光度)在0.3～0.4左右，添加N15至終濃度為100μg/mL，同時設置不添加N15的菌株作為對照。每隔24小時用分光光度計測定菌液的OD750，連續測定8天后根據數據繪制N15的抑菌曲線，結果如圖1所示。

實驗結果表明，加入N15多肽至終濃度為100ug/mL的魚腥藍細菌PCC 7120的生長和不加入N15的對照菌株比較，受N15多肽抑制魚腥藍細菌的生長較為緩慢，加入N15對魚腥藍細菌PCC 7120的生長具有抑制作用。

實驗例2：N15推遲了魚腥藍細菌的異形胞分化時間

實驗方法：

魚腥藍細菌PCC 7120是一種絲狀細菌，其菌絲體能進行光合作用。在環境中缺乏氮源的條件下，會分化出具有固氮功能的異形胞。為了觀察N15處理對異形胞發育的影響，本研究中在對魚腥藍細菌進行缺氮處理的同時，加入100ug/mL的N15，同時設置不加入N15的對照組，誘導后進行顯微鏡觀察。

實驗結果：

魚腥藍細菌PCC 7120的營養細胞在形成異形胞的過程中，產氧的光系統II復合物在異形胞中失活，因此在熒光顯微鏡下，只有營養細胞能夠發紅色熒光，而異形胞沒有熒光。在進行缺氮誘導的同時加入100μg/mL的N15，分別在24小時、48小時候、72小時、96小時進行顯微鏡觀察，結果顯示對照組的魚腥藍細菌在缺氮誘導24小時就有異形胞的產生，而加入N15的魚腥藍細菌直到96小時以后才有異形胞生成，缺氮誘導48小時的照片如圖2所示，加入N15的魚腥藍細菌PCC 7120沒有異形胞產生，菌絲體的所有細胞在熒光顯微鏡下都發紅色熒光，而對照組菌絲有異形胞產生，這些異形胞在熒光顯微鏡下也沒有紅色熒光。由此我們得知，N15推遲了魚腥藍細菌PCC7120的異形胞發育生成的時間。

實驗例3：N15抑制了異形胞分化基因的表達

實驗方法：

為了觀察N15處理對異形胞發育的影響，本研究中在對魚腥藍細菌進行缺氮處理的同時，加入100μg/mL的N15，同時設置不加入N15的對照組，分別提取0hour、6hour、12hour、24hour的對照組和實驗組，每個樣品收集50mL菌體,提取RNA，并且用DNasel去除殘余的基因組DNA。利用紫外分光光度計對總RNA定量后,使用TakaRa公司的反轉錄試劑盒反轉錄RNA合成cDNA。具體操作步驟參見產品說明書。用TakaRa公司的試劑盒PrimeScriptTM RT Reagent Kit(Perfect Real Time)進行實時熒光定量反轉錄PCR。具體操作參見產品說明書。分析軟件使用ROCHE LightCycler480進行分析,定量方法為相對定量法。

實驗結果：

異形胞在發育過程中需要在許多基因的參與，其中hetR和ntcA基因是異形胞發育的關鍵基因，與異形胞發育的多個后期基因的轉錄激活依賴于hetR和ntcA。我們通過實時熒光定量反轉錄PCR實驗檢測了N15對這幾個異形胞分化相關基因表達的影響，實驗結果如圖3～4所示。

和對照組相比，N15加入6hour、12hour、24hour后，較明顯的抑制了魚腥藍細菌中hetR和ntcA基因的表達，由此我們得知N15對藍藻生長的抑制是通過抑制藍細菌中異形胞分化相關基因的表達來實現的。